全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 9期, 2010年 9月876
收稿 2010-05-10 修定 　2010-06-07
资助 国家自然科学基金(30671701)和国家林业局 “948”项目
(2 00 9 -4 -26 )。
* 通讯作者(E-mail: chlio@163.com; Tel: 0451-82190607)。
刺五加体细胞胚发生研究进展
周晨光, 刘立琨, 赵波, 夏德安, 李成浩 *
东北林业大学, 林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室, 哈尔滨 150040
提要: 综述了国内外对刺五加体细胞胚发生研究的现状。分别对刺五加体细胞胚发生方式、体细胞胚发育相关生理生化变
化(包括生长素极性运输、DNA甲基化和代谢途径调控)、体细胞胚生物反应器培养的研究现状进行了评述。
关键词: 刺五加; 体细胞胚发生
Research Progress in Somatic Embryogenesis of Eleutherococcus senticosus
Maxim.
ZHOU Chen-Guang, LIU Li-Kun, ZHAO Bo, XIA De-An, LI Cheng-Hao*
Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement and Biotechnology, Ministry of Education, Northeast Forestry University,
Harbin 150040, China
Abstract: Recent progresses in somatic embryogenesis of Eleutherococcus senticosus were reviewed. This
paper investigated the pattern of somatic embryogenesis and physiological and biochemical changing in somatic
embryo development, including auxin polar transportation, DNA methylation and metabolic pathways regulation.
Bioreactor culture of somatic embryos of E. senticosus was also discussed.
Key words: Eleutherococcus senticosus; somatic embryogenesis
刺五加(Eleutherococcus senticosus Maxim.)为
五加科多年生落叶灌木, 主要分布在中国东北部、
俄罗斯远东地区及日本北海道等地, 是常用的药用
植物。以刺五加为原料生产的各种片剂、冲剂、
针剂和刺五加参茶等产品远销国外, 具有很高的经
济价值。由于自然环境的破坏, 无计划的采挖等原
因, 刺五加野生资源遭到严重破坏, 已被各生产国
列为保护植物, 严格限制野生采挖(祝宁等 1998)。
上世纪80年代末开始了刺五加人工栽培的研究, 主
要进行种子繁殖、扦插等方面研究(韩承伟等
2003)。由于刺五加种子质量差、自然状态下后
熟时间长以及发芽率低、扦插生根率低等原因, 制
约了人工栽培的发展。近年来利用组织培养、细
胞培养快速繁殖刺五加的研究成为热点。体细胞
胚发生作为植物快速繁殖的方法之一, 可以不受地
区、季节和气候性灾害等自然条件限制, 具有繁殖
速度快、繁殖系数高等优点。另外, 体细胞胚胎
发生重演受精卵形态发生的特性, 是深入研究植物
细胞分化、发育、形态发生与合子胚发育机制的
理想离体实验体系(Yang和 Zhang 2010)。
自从Gui等(1991)通过体细胞胚发生形成植株
再生成功以来, 刺五加体细胞胚发生的研究已有很
多报道。目前, 研究主要集中在体细胞胚发生机
理、利用体细胞胚培养的苗木快速繁殖、次生代
谢产物生产、体细胞胚特异合成的生物活性物质
的分离、利用转基因技术改变代谢产物生物合成
途径以及体细胞胚的生物反应器培养等方面。本
文主要就近几年国内外关于刺五加体细胞胚发生的
研究进展进行综述。
1 体细胞胚发生方式
植物的体细胞胚发生方式可以分为直接从外
植体产生体细胞胚的直接方式和先产生愈伤组织然
后由愈伤组织再分化出体细胞胚的间接方式(Yang
和 Zhang 2010)。刺五加的体细胞胚发生以直接诱
导方式为主。Gui等(1991)由子叶及胚轴直接诱导
体细胞胚, 最初产生的体胚为一些小的圆柱状突起,
表面十分光滑。在纵向伸长以后, 顶端开始出现瓣
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状裂片。当体胚发育至鱼雷形时期以后, 由于胚轴
伸长及子叶联合, 致使整个体胚呈喇叭状。对培养
材料的切片观察表明刺五加的体胚起源于子叶或胚
轴表皮层及表皮层下的细胞团, 属于多细胞起源。
多细胞起源的体细胞胚几个基部相连, 集聚成团, 较
难分离, 且无再生能力; 发育正常, 有再生能力的体
细胞胚是通过次生胚产生的。
Choi等(1999a)把刺五加体细胞胚在添加 2,4-
D的诱导培养基持续培养, 从部分体细胞胚可以产
生胚性愈伤组织, 胚性愈伤组织的固体培养和液体
培养都能得到同步化发育的大量体细胞胚, 这对苗
木大量扩繁和胚发育相关生理、生化和分子生物
学研究有重要意义。他们发现, 外植体的选择对体
细胞胚的正常发育和植株转化起关键作用, 即从合
子胚诱导的体细胞胚与Gui等(1991)的报道相同,
大部分为多胚, 不能发育成完整植株; 而从发芽1~3
周后幼苗的不同组织诱导的体细胞胚为单胚(single
embryo), 能正常发芽并转化为完整植株(Choi等
1999b)。
Y ou 等( 2 00 6 )把刺五加成熟合子胚在 1 . 0
mmol·L-1甘露醇或蔗糖中进行3~24 h的质壁分离处
理, 使体细胞胚在无植物生长调节剂的培养基中高
频诱导, 而且全部体细胞胚均从合子胚表面的单一
表皮细胞直接诱导。用荧光分析法检测到经质壁
分离处理后的合子胚中胼胝质的量急剧增加, 而未
经处理的合子胚中仍保持较少; 合子胚的质壁分离
处理导致原生质膜与细胞壁之间沉积大量胼胝质。
据此推论可能是合子胚的质壁分离处理诱导胼胝质
的沉积, 并阻断细胞间联络, 刺激表皮细胞重新编
程, 使表皮细胞成为胚性感受态细胞并最终诱导单
细胞发育成体细胞胚。李成浩等(2006)通过饥饿
和高温混合处理从成熟合子胚成功直接诱导体细胞
胚, 并以次生胚发生方式继续在不加激素的培养基
里增殖和维持8年以上, 最近建立了cDNA文库, 开
展胚发生过程中基因表达研究(刘立琨等 2008)。
2 体胚发育相关生理生化变化
2.1 生长素极性运输与体胚发生 高等植物的生长
发育受激素的广泛调控, 其中生长素的作用尤为独
特。激素在植物组织的相对含量决定了该组织的
发育命运。目前已知的植物激素中只有生长素具
有极性运输特征, 因此很自然地就把植物的极性发
育、分化、生长等生理现象与生长素的极性运输
联系在一起, 例如植物的顶端优势、维管组织的发
生及向性生长等(Estelle 1998)。Choi等(2001)发现
刺五加的体细胞胚发生需要一定的生长素浓度梯
度。刺五加胚性细胞团在添加生长素极性运输抑
制剂 TIBA的培养基上培养时, 体细胞胚的形成受
到抑制却不影响细胞的分裂。将不同时期球形胚
转移到含 TIBA的培养基上培养, 导致筒状子叶的
发生, 特定时期的球形胚中轴和两侧极性的发育受
到抑制, 并且茎和根顶端分生组织的进一步发育和
微管分化也受到抑制。刺五加芽、根顶端分生组
织形成及内部组织分化发生在球形胚向心形胚转化
时期, 说明在刺五加球形期体细胞胚由轴向对称的
生长方式转向心形期的两侧对称的生长方式的过程
中, 生长素极性运输起着非常重要的作用(Choi等
2001)。
2.2 DNA甲基化与体胚发生 DNA甲基化是在DNA
复制后, 在甲基转移酶催化下将 S-腺苷 -甲硫氨酸
上的甲基基团连接到DNA分子的腺嘌呤碱基或胞
嘧啶碱基上, 进行DNA修饰的过程。DNA甲基化
参与植物基因表达的调控, 在植物的生长发育中起
着非常重要的作用(Finnegan等2000)。Chakrabarty
等(2003)利用高效液相色谱(HPLC)和甲基化敏感扩
增多态性技术(MSAP)比较刺五加胚性愈伤组织与
非胚性愈伤组织的基因组DNA甲基化水平, 发现胚
性愈伤组织的DNA甲基化水平明显降低。
2.3 代谢途径调控 植物新陈代谢分为初生代谢与
次生代谢。植物次生代谢产物是指植物体中一大
类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物,
是药物(如长春花生物碱)和化工原料(如橡胶)的重
要来源, 对人类的生产和生活影响较大, 具有很好
的经济和社会效益(高文远等 2003)。目前, 研究药
用植物次生代谢产物生物合成的基因调控已成为分
子生物学十分活跃的前沿研究领域, 其中植物甾醇
和三萜类皂苷是两种具有调节生物体免疫力、抗
血糖过多、抗癌症等生理功能的植物次生代谢产
物, 其含量和组分主要取决于生物合成关键酶以及
在细胞中的表达水平(刘强等 2006)。
鲨烯合酶(squalene synthase, SS)是催化两分子
的法呢酯焦磷酸(farnesyl diphosphate, FPP)缩合产
生鲨烯的关键酶, 而鲨烯是生物合成三萜、甾醇等
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萜烯类重要物质的共同前体。因此, SS酶成为生
物合成三萜、甾醇等物质的一个关键酶, 其含量和
活性决定了后续产物的产量(赵明文等 2003)。韩
国江原大学Choi YE实验室通过转基因人参的研究
证明人参SS酶在植物甾醇和三萜类皂苷的生物合
成中具有很强的调控功能(Lee等2004)。在此基础
上, 将人参 SS酶基因克隆到植物高效表达载体
pCAMBIA1302中, 通过根癌农杆菌介导法转化刺五
加体细胞胚, 结果表明, 转基因植物的SS酶活性是
野生型的 3倍。GC-MS与HPLC分析显示, 转基
因植物中甾醇类和三萜皂苷的含量是野生型的
2~2.5倍。由此可见, 增强植物 SS酶活性会使刺
五加甾醇和三萜皂苷的产量显著增加(Seo等 2005)。
随着分子生物学的快速发展, 可以通过对次生代谢
相关合成酶和相关基因异源表达酶活性的研究以及
反应动力学分析, 筛选和确定次生代谢物质的关键
酶基因, 然后通过人工改造关键酶基因使之高效表
达, 进而提高植物次生代谢产物的产量。
3 体细胞胚生物反应器培养
生物反应器技术是植物组织培养的重要组成
部分, 具有工作体积大、单位体积生产能力强、
物理和化学条件控制方便等优点。植物细胞培养
生产天然化合物将逐渐成为弥补天然资源短缺的有
效途径(Paek等 2005)。目前药用植物细胞培养有
一个很大的弊端, 即有效成分的含量不稳定, 药用
植物的有效成分往往是次生代谢产物, 次生代谢产
物的合成在细胞阶段并不积极, 也可以说对植物细
胞本身来说意义不大; 器官培养可以克服这一缺点,
成为目前药用植物发酵培养研究的重点(高文远等
2003)。目前, 用于生产次级代谢物的植物器官包
括毛状根、芽(Bourgaud等 2001)、体细胞胚和幼
植物体(Paek等 2005)等。
近年来, 国际上越来越多的学者认识到植物体
各器官间的协同作用对次生代谢产物合成的重要
性, 开始加强相关领域的研究(Luczkiewicz 和
Kokotkiewicz 2005; Iwase等 2005)。国内学者也
进行了对水母雪莲毛状根和野生植物的苯丙素类
(phenylpropanoids)次生代谢产物合成能力的比较
(Fu等 2006)。另外, 也陆续出现一些利用体细胞
胚生物反应器培养生产次生代谢产物方面的论文
(Eeva等 2003; Shohael等 2006a, b)。同时, 由于
组织培养技术和生物反应器设计技术的进步, 在刺
五加(Choi等2002; Li 2004)、E. sessiliflorus (Shohael
等 2005)、E. koreanum (Park等 2005)等药用植物
中实现了高密度培养的体细胞胚在生物反应器培养
中同步化发芽和快速生长, 特别是刺五加体细胞胚
的增殖速度和产量已接近或达到细胞培养的水平
(Choi等 2002; Paek等 2005; Li 2004)。
Choi等(2002)把刺五加体细胞胚在 10 L生物
反应器中培养, 得到大量幼植物体, 并提出利用培
养的幼植物体直接作为药用植物原料的可能性。
Li (2004)在 10 L鼓泡式生物反应器培养 30 g体细
胞胚, 经过 4~5周培养可以得到 1 500 g左右的幼
植物体, 生物量增长速度和产量达到了细胞培养的
水平; 对培养的幼植物体提取物的抗氧化、抗菌、
抗癌等生物活性测定结果与5年野生刺五加根皮提
取物无明显差异。李成浩等(2006)在不添加任何
植物激素的培养环境下从成熟种子诱导体细胞胚,
并通过生物反应器培养大量生产再生植株。
刺五加体细胞胚生物反应器培养中的光、温
度等理化因子对细胞生物量积累、抗氧化系统的
诱导、谷胱甘肽代谢和次生代谢产物合成的影响
也开始受到重视。Shohael等(2006a)研究了不同光
处理对生物反应器中刺五加体细胞胚发生的影响,
发现与其他光处理相比, 红光处理的体细胞胚具有
很高的氧胁迫应力水平; 超氧化物歧化酶(superoxide
dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、谷
胱甘肽转硫酶(glutathione S-transferases, GSTs)、
谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase, GR)、愈创
木酚过氧化物酶(guaiacol peroxidase, G-POD)等抗
氧化酶活性增强, 抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate
peroxidase, APX)、单二氢抗坏血酸还原酶(mono-
dehydroascorbate reductase, MDHAR)、二氢抗坏
血酸还原酶(dehydroascorbate reductase, DHAR)活
性下降; 五加苷 E、E1产量增加。荧光处理的体
细胞胚的石碳酸、类黄酮、绿原酸含量明显高于
其他处理。说明不同光源引起的氧胁迫伤害及并
发的植物抗性机制不同, 所以产生了不同的抗氧化
酶活性及次生代谢产物。Shohael等(2006b)将刺
五加体细胞胚培养在不同温度的生物反应器中, 研
究温度对次生代谢物产量和抗氧化酶活性的影响。
在低温(12 ℃)和高温(30 ℃)下的体细胞胚生长受
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到抑制, 石碳酸、类黄酮、绿原酸、五加苷含量
下降; 12 ℃时, SOD、CAT、GR、APX、MDHAR、
DHAR活性明显增强。由于低温和高温使得细胞
内蛋白变性, 进而对体细胞胚的生长造成了不可逆
的抑制。另外, 低温处理时抗氧化酶活性增强, 是
细胞对低温引发的氧胁迫的一种自我保护, 可以减
轻对自身造成的伤害。Shohael等(2007)发现, 与
非胚性愈伤组织相比, 在刺五加体细胞胚发育早期
氧化型谷胱甘肽(GSSG)与还原型谷胱甘肽(GSH)比
值持续增大, 心形胚时期达到最大值, 鱼雷胚和子
叶胚阶段急剧下降, 子叶胚时达到最小值。在体细
胞胚成熟过程中, GST、G-POD、CAT、谷胱甘
肽过氧物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性明
显增强。另外, APX、MDHAR、DHAR等抗氧
化酶也被诱导。在刺五加体细胞胚发育过程中氧
化还原状态非常重要, 植物胚胎发生开始需要还原
态的培养环境, 这更有利于细胞增殖。较高的
GSSG/GSH能促进胚胎发育过程中重要的谷胱甘肽
结合蛋白的合成。抗氧化酶与谷胱甘肽氧化还原
体系同等上调说明: 抗氧化酶通过改变谷胱甘肽的
氧化还原状态, 在刺五加体细胞胚发育过程中发挥
着重要的作用。
转基因植物作为生物反应器也是当前国内外
在分子生物学和生物技术领域的研究热点, 目前已
用于生产重要的药用蛋白, 如抗体、血液替代品和
疫苗等(杨晶等 2009)。大肠杆菌热不稳定毒素 B
亚单位(LTB)是一种强力粘膜免疫原, 又是辅佐抗原
的免疫佐剂, 大规模生产LTB能够推进可食性疫苗
的开发(Kang等 2006)。Kang等(2006)将人工合成
的 L T B 亚单位基因克隆到植物高效表达载体
pMYO51中, 利用根癌农杆菌介导转化将基因转至
刺五加体细胞胚, 以表达代谢终产物。通过气升式
生物反应器培养, 其代谢产物LTB含量基本保持在
全部可溶性蛋白的 0.36%。酶联免疫测试表明, 体
细胞胚合成的 LTB蛋白能够特异结合神经节苷脂
GM1, 由此说明LTB蛋白参与活跃五聚体的形成, 具
有正常的生物活性, 为利用植物生产药用蛋白提供
了新的途径。
4 结语
近年来, 刺五加体细胞胚的研究有很大进展和
突破, 但是仍面临很多问题: (1)外植体单一。目前,
大部分体细胞胚发生的研究均以合子胚作为外植
体, 虽然有些林木已经能从成年组织诱导出体细胞
胚, 但诱导率较低, 而且从刺五加成熟组织诱导而
得体细胞胚还未见报道。(2)体细胞胚发生体系不
完善, 如褐化问题严重、畸形胚的出现、体细胞
胚胎的个体差异大等。(3)分子水平上研究较少, 对
于刺五加体细胞胚发生的调节机制不够了解。(4)
生物反应器培养刺五加体细胞胚, 对其生长过程中
的组织细胞学、植物生理学、分子生物学等方面
研究太少, 这对改善刺五加生物反应器培养条件、
控制其代谢产物的产量等均有一定的限制。
生物科学技术的迅速发展, 为体细胞胚发生的
研究带来了新的契机, 并取得了大量成果。目前,
刺五加体细胞胚发生的研究工作还需在以下几个方
面加强: 选育优良外植体作为研究对象, 从刺五加
成熟组织诱导体细胞胚发生, 将成为完善无性繁殖
方式的重大课题; 系统地研究刺五加体细胞胚发生
时的内在机制及其调控机制, 从而为建立更稳定的
体细胞胚发生和再生体系提供理论依据; 对刺五加
体细胞胚的生物反应器培养的各个时期进行系统研
究, 特别是在其生长状态、生理生化变化、分子
水平方面的研究; 扩大生物反应器培养范围, 较大
限度地应用于大工业化生产中, 这就需要大规模采
用自动化体细胞培养的培养体系, 而在这方面仍需
进行大量改进。
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