全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (7): 641~647 641
收稿 2011-02-23　　修定 2011-04-14
资助 黑龙江省博士后科研启动金(LBH-Q08146)和中央高校基
本科研业务费专项资金(DL10CA03)。
* 通讯作者(E-mail: xuzhiru2003@126.com; Tel: 0451-
82191783)。
植物类黄酮3’-羟化酶(F3’H)基因的研究进展
侯杰, 佟玲, 崔国新, 许志茹*, 李玉花
东北林业大学生命科学学院, 哈尔滨150040
摘要: 本文介绍了植物F3’H基因的克隆、序列分析、表达分析、系统进化及转录调控的研究进展。
关键词: 花青素; 类黄酮3’-羟化酶基因; 表达特性, 转录调控
Research Advances of Plant Flavonoid 3’-Hydroxylase (F3’H) Gene
HOU Jie, TONG Ling, CUI Guo-Xin, XU Zhi-Ru*, LI Yu-Hua
College of Life Siences, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract: In this article, we do a brief overview of research progress for F3’H gene cloning, sequence analysis,
expression analysis, phylogeny and transcriptional regulation and also predict the development of F3’H gene.
Key words: anthocyanin; flavonoid 3’-hydroxylase gene; expression trait; transcriptional regulation
类黄酮3’-羟化酶(flavonoid 3’-hydroxylase,
F3’H)属于细胞色素P450亚家族 , 它催化依赖
NADPH和O2的单加氧反应。在类黄酮合成途径
中, F3’H催化柚皮素(naringenin)和二氢堪非醇(di-
hydrokaempferol, DHK)的B环3’位置羟基化, 生成
圣草酚(eriodictyol)和二氢栎皮黄酮(dihydroquerce-
tin, DHQ), 这两种产物是花青素和原花青素生物
合成的重要中间产物。花青素和原花青素是花和
种皮的主要成色物质, 可以使细胞避免受到强烈
UV-B照射引起的伤害(Xu等2007)。类黄酮3’-羟化
酶还可以通过黄烷酮类物质参与乙酸-丙二酸途径
(acetic-malonic acid pathway), 保护植物免受动
物、植物、病原微生物等的侵害 (黄文坤等
2007)。Brugliera等(1999)从矮牵牛(Petunia hybri-
da)中首次分离了F3’H基因, 被鉴定属于CYP75B2
家族。此后, 相继在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、
玉米(Zea mays)、金鱼草(Antirrhinum majus)、矢
车菊(Centaurea cyanus)、紫茎泽兰(Eupatorium
adenophorum)、大豆(Glycine max)、葡萄(Vitis vin-
ifera)、苹果(Malus×domestica)等众多植物中分离
鉴定了F3’H基因(Schoenbohm等2000; 刘海峰等
2009; 黄文坤等2007; Toda等2005; Castellarin等
2006; Han等2010)。
1 花青素的生物合成途径
近年来, 与花青素合成有关的重要催化酶基
因和调节基因已从矮牵牛、金鱼草、玉米等植物
中克隆出来, 并应用于花卉育种, 这是目前花青素
研究的热点。20世纪80年代末90年代初, 植物花
青素及类黄酮物质代谢途径研究已较为成熟。苯
丙氨酸是花青素及其他类黄酮生物合成的直接前
体, 由苯丙氨酸到花青素经历3个阶段: 第1阶段由
苯丙氨酸经过三步酶促反应到香豆酰辅酶A, 这是
许多次生代谢共有的, 其中苯丙氨酸解氨酶(phe-
nylalanine ammonialyase, PAL)是该酶促反应过程
中的第一个酶, 也是一个关键酶。第2阶段由香豆
酰辅酶A到二氢堪非醇, 是类黄酮代谢的关键反
应, 该阶段产生的黄烷酮和二氢堪非醇在不同酶
作用下, 可转化为花青素和其他类黄酮物质。第3
阶段是各种花青素的合成(王日为等2002)。花青
素的一般生物合成途径见图1 (刘仕芸等2006; Hol-
ton和Cornish 1995; 李春雷等2008)。类黄酮3’-羟
化酶是由二氢堪非醇合成花青素途径中的第一个
关键酶, 二氢堪非醇的B环3’位置在F3’H的催化下
发生羟化反应生成二氢栎皮黄酮, 二氢栎皮黄酮
在二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-re-
综　述 Reviews
植物生理学报642
ductase, DFR)和花色素合成酶(anthocyanidin syn-
thase, ANS)等酶的催化下生成紫红色花青素(也称
为矢车菊色素, cyanidin), 使果实和花瓣呈现红色
(许志茹等2008)。
2 F3’H基因的序列分析及系统进化
F3’H与F3’5’H同时存在于葡萄中, 它们的比
例控制着葡萄皮中花青素的组成。Jeong等(2006)
从葡萄中获得了4个F3’H基因, 通过推导该基因编
码的氨基酸序列并进行分析表明葡萄中的F3’H基
因与其他植物, 如喇叭花、拟南芥(AH009204)、矮
牵牛(AF155332)和大豆(AB191404)的氨基酸序列
同源性为66%~76%。Southern杂交表明, F3’H基因
家族在葡萄中只有2个成员, 因此认为F3’H1和
F3’H2是等位基因, 而F3’H3和F3’H4则是另外一
对等位基因。这4个F3’H都在相同的位置有2个内
含子, 这些内含子的位置与喇叭花、大豆、拟南
芥的F3’H基因内含子的位置相同 , 但是拟南芥
F3’H基因除此之外 , 还有一个内含子。Xu等
(2007)从甘蓝型油菜(Brassica napus)中克隆了一个
F3’H基因(BnF3’H-1), 序列分析表明BnF3’ H-1含
有3个内含子, 用NetPhos 2.0软件预测到了16个重
要的磷酸化位点 , 因此推测磷酸化作用可能是
BnF3’H-1的一个必要的转录后修饰。
苏丽等(2010)通过生物信息学分析发现, 不同
植物F3’H基因cDNA序列的相似性为69.5%。黄文
坤等(2007)通过氨基酸序列比对指出不同物种
F3’H氨基酸序列的主要差异在于N端的30个氨基
酸, 这段序列含有疏水氨基酸残基, 是膜插入点的
信号序列。刘海峰等(2009)克隆了山葡萄(Vitis
amurensis Rupr. cv. ShuangFeng) F3’H基因序列, 推
导氨基酸序列并发现起始于第28位的“LPPGP”序
列是细胞色素P450的主要保守域, 是F3’H在微粒
体膜上最佳的定位枢纽, 连接膜的锚定位点和酶
蛋白的球体部分, 在不同的物种中高度保守(Ya-
图1 花色素苷生物合成途径(刘仕芸等2006; Holton和Cornish 1995; 李春雷等2008)
Fig.1 Anthocyanin biosynthetic pathway
PAL: 苯丙氨酸解氨酶; C4H: 肉桂酸羧化酶; 4CL: 4-香豆酰CoA连接酶; CHS: 苯基苯乙烯酮合成酶; CHI: 苯基苯乙烯酮黄烷酮异构酶;
F3H: 黄酮3-羟化酶; F3’H: 类黄酮3’-羟化酶; F3’5’H: 类黄酮3’5’-羟化酶; ANS: 花色素苷合成酶; DFR: 二氢黄酮醇4-还原酶; 3GT: 类黄酮
3-O-糖基转移酶。
侯杰等: 植物类黄酮3’-羟化酶(F3’H)基因的研究进展 643
mazaki等1993; Murakami等1994); 此外还鉴定了促
使形成氧分子的结合域“AGTDT”、C端血红素结
合区“FGAGRRICAG”等保守序列。Zabala和Vod-
kin (2003)从大豆中分离鉴定了GmF3’H基因, 其氨
基酸序列包含“GGEK”序列, 这个序列是区分F3’H
与F3’5’H的重要标志, 是所有F3’H基因都具有的
特征。Toda等(2002)从大豆近等基因系To7B和
To7G中获得了F3’H cDNA序列, 在To7G的编码区
内由于单个碱基C的删除, 产生了一个缺少“GGEK”
一致性序列和血红素结合域的缩短的多肽链, 由
此导致蛋白质功能丧失。苏丽等(2010)通过分析
矮牵牛与其他23种植物F3’H的氨基酸序列发现,
矮牵牛F3’H与其他物种F3’H在近C端和近N端的
序列趋于保守, 分别有6个保守序列: “PPGP”、
“AGTDT”、“RPPN”、“AYNY”、“IKALLL”和
“TPLS”, 这些序列可能是重要的功能域。
利用MEGA 4.0软件对来自GenBank的20种
F3’H蛋白序列进行系统进化分析。结果(图2)表
明, 单子叶植物油点百合(Tricyrtis hirta)与其它双
子叶植物的F3’H分别聚为两大类群, 而双子叶植
物本身又分为几个不同分支, 其中菊苣(Cichorium
intybus)、向日葵(Helianthus annuus)、非洲菊
(Gerbera hybrid)等菊科植物同属于一个大的分支,
说明其亲缘关系较近, 符合植物分类学特征。
3 F3’H基因的表达特性
目前对F3’H基因的表达特性、催化特性及其
对花色的决定作用的研究也取得了一定进展。在
矮牵牛花瓣中, F3’H的转录水平最高; 花发育过程
中, F3’H的表达在花冠伸长时达到最高, 从花朵开
始开放到成熟时期转录水平开始降低, 在发育完
全成熟的花中转录水平为零, 在子房、花萼、花
梗、茎和花药中也能检测到F3’H的表达(Brugliera
等1999)。在紫茎泽兰的根、茎和叶中F3’H基因
均表达, 在叶中的表达量最高, 根中最低(黄文坤等
2007)。从葡萄中克隆的4个F3’H基因中F3’H1和
F3’H2只在根中微量表达, 而F3’H3和F3’H4则在
花、根、茎、叶和种子中都有较高水平的表达
(Castellarin等2006)。而在有着显性等位基因T的
大豆近等基因系花瓣中 , F 3 ’ H基因表达微弱
(Iwashina等2007)。另外, Kobayashi等(2009)研究
表明F3’H基因在葡萄叶片发育期间表达量上升。
利用紫茎泽兰F3’H基因侵染烟草, 可以导致
苯丙氨酸解氨酶(PAL)和过氧化物酶(peroxidase,
POD)活性增加, 可抵抗各种刺激对植株自身的伤
图2 不同植物F3’H的系统进化树
Fig.2 Phylogenetic tree of F3’H from different species of plants
植物生理学报644
害(张松焕等2009b); 同时, 紫茎泽兰F3’H过表达载
体遗传转化烟草后可以使烟草内源的F3’H基因发
生沉默(gene silencing), 由此导致烟草花青素成分
发生改变, 烟草花的颜色变淡(张松焕等2009a)。拟
南芥F3’H基因的突变(transparent testa 7, tt7)导致
种皮颜色由野生型的深褐色改变为苍白色(Brugli-
era等1999); 大豆F3’H的突变影响了种皮和表皮毛
中的色素成分(Toda等2002; Zabala和Vodkin 2003)。
Nagamatsu等(2009)通过病毒介导的F3’H基因沉默
导致大豆茸毛的黄褐色丧失。Han等(2010)利用苹
果中克隆的MdF3’H基因在拟南芥tt7突变体和烟
草中进行异位表达 , 在氮缺乏条件下 , 表达
MdF3’H基因的转基因拟南芥tt7突变体苗重新获
得了红色并积累了4’和3’,4’-羟基化的花青素; 与
野生型植株相比, 过表达MdF3’H的转基因烟草的
花红色加深。Shih等(2006)将高粱(Sorghum bicol-
or) F3’H基因(SbF3’H1或SbF3’H2)转入拟南芥tt7
突变体, 使其重新获得了在种皮中积累凝缩类单
宁和在氮缺乏条件下积累矢车菊型花青素的能力;
HPLC分析进一步表明, 野生型植株积累黄酮醇栎
精(3’,4’-羟基化)和堪非醇(4’-羟基化), 突变体中只
积累堪非醇, 而转基因苗中栎精占主导, 由此说明
由于SbF3’H的过表达, 黄酮醇生物合成的大多数
前体都被转变成了3’-羟基化的形式。
已有报道, 拟南芥二氢黄酮醇4-还原酶能够
利用二氢堪非醇作为底物, 但是有F3’H存在时不
能利用二氢堪非醇。所以在氮缺乏条件下, 野生
型拟南芥苗优先利用二氢栎皮黄酮产生高水平的
矢车菊色素而不产生天竺葵色素(Dong等2001)。
Han等(2010)在转苹果MdF3’H基因的拟南芥苗和
生长在氮缺乏条件下的拟南芥苗中都检测到了花
青素(包括天竺葵色素和矢车菊色素)的积累, 而在
拟南芥tt7-1突变体苗中没有检测到这些花青素。
许多研究表明, 类黄酮生物合成酶能够通过特定
的蛋白-蛋白相互作用形成大分子复合物, 因此氮
缺乏条件下拟南芥苗中天竺葵色素与矢车菊色素
的积累可能是由于F3’H与二氢黄酮醇4-还原酶或
者与其它类黄酮生物合成酶相互作用, 导致二氢
黄酮醇4-还原酶作用底物发生了特异性改变。
Ueyam等(2002)从蓝猪耳(Torenia hybrida)花瓣中
分离了F3’H cDNA全长, 将其在酵母中表达并测
定酶活性, 结果表明F3’H催化4,5,7-三羟黄烷酮、
黄烷酮醇、黄酮醇和芹菜甙元的3’位置羟基化, 分
别生成圣草酚、二氢栎精、栎精和四羟黄酮。而
缺少NADPH时没有检测到代谢产物。这些复合物
的F3’H的Km值分别为0.83、3.95、2.69和21.55
µmol·L-1, 每毫克总蛋白的最大值分别为55.7、
118、125和225 pmol·min-1。由此表明F3’H具有广
泛的作用特异性, 但是对4,5,7-三羟黄烷酮的亲和
性最高。Seitz等(2007)通过嵌合基因的构建和表
达发现, F3’H与F3’5’H蛋白的近N端决定其作用特
异性, 而蛋白的近C端决定了酶的功能差异。通过
位点定向诱变表明, 底物识别位点6 (SRS6)的单个
氨基酸的变化能够改变F3’H与F3’5’H的功能。
487位的保守的苏氨酸(Thr)变成丝氨酸(Ser)可以
使非洲菊(Gerbera hybrida) F3’H具有额外的5’-羟
基活性, 而蓝眼菊(Osteospermum hybrida) F3’5’H
中此位置的反向替换则可以使F3’5’H转变成F3’H,
此F3’H保留低的5’-羟基活性。
4 环境因子对F3’H基因表达的影响
影响花青素合成的外界环境因子主要包括
光、温度和糖等, 其中光是影响花青素合成最重
要的环境因子之一。已有研究表明在低光强下,
植物发育中的浅色花含有低水平的花青素(Weiss
2000)。Shih等(2008)通过对水稻进行不同时间的
光照处理, 证明了水稻T65-Plw株系和T65株系的
O s F 3 ’ H基因的表达受光诱导。而津田芜菁
BrF3’H1基因的表达量随着UV-A处理时间的延长
而增加(许志茹等 2008)。高温会影响花青素的组
成。在正常生长条件下, 玫瑰花成熟的花蕾中天
竺葵色素与矢车菊色素的比例为1:1, 39 ℃处理后,
在成熟的花蕾中天竺葵色素和矢车菊色素的比例
发生改变, 但催化天竺葵色素向矢车菊色素转变
的F3’H基因的表达量并未受高温影响(Dela等
2003)。用蔗糖渗透处理拟南芥种子, 当蔗糖的浓
度达到15 mmol·L-1时, F3’H基因的转录水平上调
(Solfanelli等2006)。除了光、温度和糖外, 激素、
水分、氮或磷的含量以及金属离子等也可以调控
花青素的合成(胡可等2010)。在拟南芥中异位表
达苹果MdF3’H基因的研究表明, MdF3’H在类黄酮
的生物合成中发挥重要作用, 同时, 氮胁迫显著影
响了花青素生物合成催化酶基因的表达(Han等
侯杰等: 植物类黄酮3’-羟化酶(F3’H)基因的研究进展 645
2010)。Ollé等(2011)研究了设拉子葡萄(Shiraz ber-
ry)成熟前和成熟后的干旱胁迫对花青素积累的影
响。Castellarin等(2007)证明了赤霞珠葡萄(Caber-
net Sauvignon)成熟前和成熟后的干旱胁迫都会导
致B环三羟基化花青素含量的增加, 这是通过F3’H
与F3’5’H表达的差异调节实现的。
5 F3’H基因的转录调控
Toda等(2005)从大豆近等位基因系To7B中克
隆了F3’H基因。序列分析表明, 该基因包含3个外
显子和2个内含子。对起始密码子上游约1.5 kb的
启动子序列分析表明 , -1400 bp处有一个植物
MYB结合域(AACCAAAC), -1250 bp处有一个
G-box核心序列(CACGTG), 而在-280 bp和-940 bp
处分别有一个植物R2R3-MYB结合蛋白的结合序
列和26个TA重复单元。启动子的这些信息对于研
究F3’H基因的转录调控是至关重要的。Laitinen
等(2008)通过微阵列研究表明, 非洲菊中GMYB10
可以调控F3’H基因上调表达。Gonzalez等(2008)
通过实验证明, MYB的低量表达降低了花青素合
成途径晚期基因DFR、LDOX (无色花色素双加氧
酶基因)和GST12 (谷胱甘肽S-转移酶基因)的表达,
也降低了F3’H和UGT75C1 (糖基转移酶基因)的表
达。这些结果表明, 拟南芥中TTG1依赖的MYBs
调节花青素晚期基因的转录, F3’H和UGT75C1也
一起被调节。
Gonzalez等(2008)通过构建TTG1依赖的
bHLH四重突变体发现, F3’H、LDOX、GST12和
UGT75C1在bHLH和ttg1多重突变的拟南芥苗中是
下调表达的。bHLH转录因子与TTG1蛋白类似,
是类黄酮途径晚期基因的调节因子 , 而F3’H和
UGT75C1与这些基因一起被调节。此外也检测到
F3’H的表达在bHLH丧失功能的突变体苗中是野
生型中的30%。由此推测F3’H可能是由依赖TTG1
和不依赖TTG1的双重机制调节的, 这与它需要栎
精型的黄酮醇底物和产生矢车菊型的花青素是一
致的。
MYB蛋白、bHLH蛋白和WD40蛋白是玉
米、金鱼草和矮牵牛中类黄酮物质生物合成的主
要调节蛋白。Gonzalez (2009)研究表明, 高温低光
条件会导致过表达MYB型调节蛋白PAP1的拟南
芥色素含量降低, 由此推测WD/bHLH/MYB复合
物本身可以应答外界环境的刺激, 促进花青素降
解。目前, 在PAL、CHS和DFR等基因的启动子内
都已经发现了MYB结合的顺式作用元件(Toda等
2005), 但关于F3’H转录调控的相关报道还很少。
6 展望
目前, 了解和探索花青素合成过程及相关的
基因调控已经成为花卉基因工程和果树遗传育种
的研究热点。对花青素合成途径中的重要催化酶
基因F3’H的研究主要集中在以下几个方面。(1)花
色的修饰: 在花色修饰方面, 越来越多的研究集中
在利用分子手段改变花色上, 而B环的羟基化修饰
在改变花色中的作用已经得到证实。类黄酮物质
B环的羟基化是由F3’H和F3’5’H催化的, 目前大多
数改变花色的基因工程主要围绕F3’H、F3’5’H和
DFR进行。自从1999年Brugliera等从矮牵牛中首
次分离了F3’H基因并将其导入矮牵牛Skr4×Sw63
株系获得粉红色花以来, 众多的研究已经从不同
物种中分离了F3’H基因, 并将其应用于花色的改
良。(2)对环境信号的应答: 花色素苷的合成受多
种环境和发育信号的调控, 其中光是最重要的环
境调节因子, 主要是通过光的信号转导途径调节
相关基因的表达以影响花色素苷的合成; 而糖对
花色素苷合成的影响仅次于光。此外, 激素在果
实花青素的积累过程中发挥重要作用, 目前大多
数研究只涉及激素对花色素苷合成相关酶基因表
达的影响, 而对于激素如何通过影响酶活性促进
花色素苷合成的机理尚不明确。(3)抵御逆境: 当
遭遇低温、干旱、紫外线照射等环境胁迫时, 植
物体内会迅速积累花青素抵御逆境。例如植物抵
御UV-B伤害的一个关键因素可能就是B-环单羟基
化的类黄酮转变为二羟基化类黄酮, 而这种转变
是由F3’H催化的(Ryan等2002)。在大豆中, 强启动
子介导F3’H基因的过量表达可以导致具有抗氧化
活性的槲皮素(quercetin)含量增加; 槲皮素含量的
增加也可以提高植物对环境胁迫的耐受能力, 事
实上To7B植株比缺乏槲皮素的To7G植株更加耐
寒(Nagamatsu等2007)。
近年来, 有关F3’H基因的研究虽然取得了一
定进展 , 但仍有许多问题有待进一步研究和解
决。例如F3’H基因顺式作用元件的鉴定及其与相
应转录因子的相互作用; F3’H对环境信号的应答
植物生理学报646
及其在色素合成中的机制; 通过研究F3’H在次生
代谢中的地位阐明F3’H抵御逆境的作用等。目前,
本研究小组已经从花青素生物合成依光型津田芜
菁和非依光型赤丸芜菁中克隆了F3’H基因, 并对
UV-A诱导的F3’H基因的表达特性进行了相关研
究(许志茹等 2008)。此外, 利用染色体步移技术克
隆了津田芜菁与赤丸芜菁F3’H基因的启动子序列,
通过缺失分析实验验证了2种芜菁F3’H启动子中
顺式作用元件的异同, 这些工作为分离依光型和
非依光型花青素合成的关键催化酶基因、初步阐
述依光型和非依光型花青素合成机理奠定了实验
基础。
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