全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (7): 710~714710
收稿 2011-05-13　　修定 2011-05-30
资助 国家自然科学基金(31070188)和浙江省科技计划项目
(2009C32066)。
致谢 浙江农林大学崔永一教授在试验及论文写作中给予帮助。
* 通讯作者(E-mail: mchji@163.com; Tel: 0571-63742250)。
不同植物生长调节物质对细叶小羽藓愈伤组织诱导及分化的影响
张楠, 杜宝明, 季梦成*
浙江农林大学园林学院, 浙江临安311300
摘要: 以细叶小羽藓[Haplocladium microphyllum (Hedw.) Broth.]的配子体为外植体, 研究了不同植物生长调节物质对细叶
小羽藓愈伤组织诱导及分化的影响。结果表明: 在MS培养基中添加不同的植物生长调节物质对细叶小羽藓配子体增殖影
响差异很大, 具体表现为2,4-D、KT、IBA和IAA促进细叶小羽藓芽体的诱导及生长, NAA抑制细叶小羽藓芽体的诱导,
TDZ及6-BA促进细叶小羽藓的配子体产生愈伤组织; 在MS培养基中添加0.3 mg·L-1 6-BA最适合愈伤组织的诱导; 在MS培
养基中添加1.0 mg·L-1 IBA最适合愈伤组织的分化。
关键词: 细叶小羽藓; 配子体; 愈伤组织; 植物生长调节物质
Effects of Different Plant Growth Regulators on Induction and Differentiation
of Haplocladium microphyllum Callus
ZHANG Nan, DU Bao-Ming, JI Meng-Cheng*
School of Landscape Architecture, Zhejiang A & F University, Lin’an, Zhejiang 311300, China
Abstract: The regeneration system of tissue culture in vitro using gametophyte as explant was established on
Haplocladium microphyllum (Hedw.) Broth., and effects of different plant growth regulators on induction and
differentiation of H. microphyllum callus was studied in this paper. The results indicated that the effects of dis-
tinct plant growth regulators added in MS medium on multiplication of H. microphyllum gametophyte are dif-
ferent. 2,4-D, KT, IBA and IAA could promote the induction and growth of H. microphyllum buds, NAA could
inhibit the induction and growth of H. microphyllum buds, TDZ and 6-BA could promote H. microphyllum
gametophyte to produce callus. Added 0.3 mg·L-1 6-BA in the MS medium was the best for the callus induction.
Added 1.0 mg·L-1 IBA in the MS medium was the best for the callus differentiation.
Key words: Haplocladium microphyllum; gametophyte; callus; plant growth regulator
细叶小羽藓[Haplocladium microphyllum (Hedw.)
Broth.], 为羽藓科(Thuidiaceae)小羽藓属的一个种,
在中国大部分地区、锡金、印度、朝鲜、日本、
俄罗斯、欧洲及北美洲都有分布(吴鹏程2002), 细
叶小羽藓全草均可药用, 用于治扁桃体炎、尿路
感染、乳腺火、丹毒、疖肿、肺炎、膀胱炎、中
耳炎、产后感染等, 用细叶小羽藓制成的青苔素
针剂功效与青霉素相似(衣艳君2000), 吴璐璐等
(2009)将其列为优先利用的药用苔藓植物种类。
另外细叶小羽藓对多种重金属有很强的富集能力
(安丽等2006), 是良好的大气环境指示植物。目前
国内外对细叶小羽藓的研究主要集中在分类、生
态及生理生化水平上, 其药用机理及药用成分分
析尚未开展, 而细叶小羽藓的组织培养是开展深
入研究的基础, 张敏(2005)曾研究了细叶小羽藓孢
子萌发及原丝体发育过程, 并指出在添加了0.2
mg·L-1 IAA+2 mg·L-1 6-BA的MS培养基上孢子萌发
及原丝体发育最好, 到目前为止, 国内外尚没有对
细叶小羽藓配子体愈伤组织诱导及分化的报道。
本文通过研究不同植物生长调节物质对细叶小羽
藓配子体愈伤组织诱导及分化的影响, 为细叶小
羽藓植物组织培养快繁体系和资源的开发利用提
供科学依据。
材料与方法
1 材料
野外采集长势健壮的细叶小羽藓[Haplocladium
microphyllum (Hedw.) Broth.]带回实验室, 置于培
养皿中待用。消毒方法为: 流水冲去表面污物→
张楠等: 不同植物生长调节物质对细叶小羽藓愈伤组织诱导及分化的影响 711
用洗涤精浸泡, 同时搅动2~3 min→流水冲洗10
min→在超净工作台上用无菌水冲洗3次→用70%
酒精表面消毒5 s→用无菌水冲洗3次→用2.5%
NaClO消毒60 s→用无菌水清洗3次→在灭过菌的
滤纸上吸干试验材料表面的水分, 剪成0.5 cm左右
的小段, 接种在培养基上。获得无菌配子体后转
接数次, 接种在下述培养基上。
2 方法
试验基本培养基均为MS培养基+6.7 g·L-1琼
脂+30 g·L-1蔗糖, pH 7.0, 培养基装在直径为10
cm、高为6 cm的圆柱形塑料培养瓶中。培养条件
为: 温度(23±2) ℃, 光照时间12 h·d-1, 光照强度
40~60 µmol·m-2·s-1。
2.1 不同植物生长调节物质对芽体及愈伤组织的
诱导
采用单因素设计, 选用2,4-D (2,4-二氯苯酚代
乙酚)、KT (激动素)、IBA (吲哚丁酸)、NAA (萘
乙酸)、IAA (吲哚乙酸)、TDZ (苯基脲衍生物)、
6-BA (6-苄氨基腺嘌呤)七种植物生长调节物质诱
导细叶小羽藓的愈伤组织, 浓度梯度均为0.1、
0.5、1.0 mg·L-1, 并以未添加任何植物生长调节物
质的为对照, 每个处理接种30个外植体, 重复3次,
接种30 d后统计芽体诱导率、个数、长度, 原丝体
直径, 愈伤组织的诱导率、褐化率及分化率, 分析
不同浓度的植物生长调节物质对细叶小羽藓配子
体的影响。
2.2 愈伤组织诱导的6-BA浓度的进一步筛选
通过愈伤组织诱导试验发现, 6-BA对细叶小
羽藓愈伤组织的诱导效果最好。为进一步筛选出
诱导愈伤组织最佳6-BA浓度, 设置6-BA的浓度梯
度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0 mg·L-1。每个处
理接种30个外植体, 重复3次, 每10 d转接一次, 培
养30 d后统计愈伤组织的紧密度、褐化率、直
径、鲜重及干重, 增长率(%)=[培养30 d后愈伤组
织的直径(鲜重、干重)-培养前愈伤组织的直径
(鲜重、干重)]/培养前愈伤组织的直径(鲜重、干
重)×100% (周建辉等2010)。
2.3 愈伤组织分化的植物生长调节物质的筛选
在前面试验中对愈伤组织诱导作用最明显的
为0.3 mg·L-1 6-BA, 1.0 mg·L-1 TDZ能产生愈伤组织,
且容易分化; 1.0 mg·L-1 2,4-D、1.0 mg·L-1 IBA、0.5
mg·L-1 KT对芽体的诱导及生长促进作用最明显。
选取生长状况良好、大小基本一致的愈伤组织,
转入添加了上述浓度单种植物生长调节物质的培
养基上, 并以未添加任何植物生长调节物质为对
照, 每处理接种30个, 重复3次, 每10 d转接一次, 培
养30 d后统计细叶小羽藓愈伤组织分化的情况。
2.4 统计方法
采用SPSS 18.0统计软件进行统计分析, 采用
Excel 2003软件制图。
实验结果
1 不同植物生长调节物质对愈伤组织诱导的影响
在未添加植物生长调节物质的培养基中, 接
种的细叶小羽藓配子体部分死亡, 并在原配子体
周围长出深绿色致密的原丝体, 在原配子体上萌
发出新芽, 芽体诱导率为53.33%, 诱导的芽体个数
为0.60个, 芽体长度为0.97 cm, 原丝体直径为0.82
cm (表1)。在添加了植物生长调节物质的培养基
中, 接种的细叶小羽藓配子体全部死亡, 同时在原
配子体周围长出原丝体, 原丝体颜色总体变浅, 致
密度降低, 随后在原配子体周围长出芽体或产生
愈伤组织, 不同植物调节物质对细叶小羽藓芽体
及愈伤组织的诱导作用差异较大。
随2,4-D的浓度升高新芽的诱导率升高, 诱导
出的新芽数增多, 但原丝体均变为褐色、松散, 添
加1.0 mg·L-1 2,4-D的培养基与对照相比效果最显
著(表1)。在KT的3个浓度中, 当浓度为0.5 mg·L-1
时, 诱导率最高, 诱导的芽体数最多, 芽体生长最
快, 当浓度高于或低于0.5 mg·L-1时, 效果显著降低
(表1)。KT的添加对原丝体直径影响不大 , 0.5
mg·L-1浓度的芽体诱导率最高(表1)。添加IBA浓
度为1.0 mg·L-1时, 细叶小羽藓的诱导率及芽体
数、芽体长度显著比未添加IBA效果要好, 原丝体
直径与未添加IBA相比效果不显著(表1)。随IBA
浓度降低, 细叶小羽藓各方面指标逐渐降低(表1),
原丝体为绿色、紧密。接种至30 d时, 添加NAA的
MS培养基中均未诱导出芽体(表1), NAA浓度为
0.1 mg·L-1时促进原丝体生长, 浓度为0.5 mg·L-1及
1.0 mg·L-1时, 抑制原丝体生长, 但添加了NAA的培
养基中细叶小羽藓的原丝体均变为褐色。显微观
察, 原丝体上有大量黄绿色的芽体, 但继续培养至
植物生理学报712
50 d后, 肉眼仍不能观察到, 显微镜观察芽体变为
褐色。当IAA浓度为0.1 mg·L-1时, 细叶小羽藓的诱
导率最高, 诱导的芽体数最多, 芽体生长最快, 原
丝体直径最大。当浓度为0.5 mg·L-1时, 与未添加
IAA差异不显著, 当浓度为1.0 mg·L-1时, 诱导的细叶
小羽藓芽体个数与未添加IAA差异显著, 但芽体的诱
导率、芽体及原丝体生长均显著受到抑制(表1)。
在添加了TDZ的MS培养基中, 接种5 d后细叶
小羽藓的配子体茎段开始死亡, 并在原茎段的周
围长出绿色的原丝体。接种10 d后TDZ浓度为1.0
mg·L-1时在原茎段的周围可以看到有新的芽体长
出, 并随原丝体一起生长, TDZ浓度为0.1 mg·L-1、
0.5 mg·L-1时仅有原丝体生长, 未有芽体长出。接
种20 d后, 原丝体面积已达到最大, 原丝体变为褐
色、松散, TDZ浓度为1.0 mg·L-1的细叶小羽藓芽
体增殖系数高达12, 芽体大小不一, TDZ浓度为0.1
mg·L-1、0.5 mg·L-1的细叶小羽藓原丝体结块, 原丝
体边缘变为黑色。接种至30 d时, 在添加了TDZ的
培养基中, 细叶小羽藓原丝体边缘多产生绿色颗
粒状愈伤组织, 1.0 mg·L-1的愈伤组织诱导率为
100% (表2), 但愈伤组织周围有大量突起产生, 显
微镜下观察为细叶小羽藓配子体, 并有大量白色
透明状假根生成(图1-A、B)。
在添加了6-BA的MS培养基中, 原配子体茎段
死亡后, 周围长出绿色原丝体, 但一直未见有芽体
图1 细叶小羽藓愈伤组织的诱导及分化
Fig.1 Induction and differentiation of H. microphyllum callus
A: TDZ诱导产生的愈伤组织; B: 显微镜(10×10倍)下TDZ诱导产生的配子体; C: 6-BA诱导产生的愈伤组织; D: 显微镜(10×10倍)下
6-BA诱导产生的愈伤组织; E: 显微镜(10×10倍)下原丝体上分化出的配子枝; F: 分化得到的细叶小羽藓配子体植株。
表1 不同植物生长调节物质对细叶小羽藓配子体增殖的影响
Table 1 Effects of different plant growth regulators on
multiplication of H. microphyllum gametophyte
种类
浓度/
芽体诱导率/%
芽体个 芽体长度 原丝体
mg·L-1 数/个 /cm 直径/cm
2,4-D 1.0 100.00a 3.23c 2.13a 1.00a
0.5 60.32def 1.49efg 1.41bc 0.79cde
0.1 60.00def 1.13fg 1.28bc 0.59f
KT 1.0 68.89cde 2.41d 1.31bc 0.73def
0.5 93.33ab 5.21a 2.40a 0.70def
0.1 40.00gh 1.67e 1.19bc 0.95abc
IBA 1.0 82.22abc 4.53b 1.64b 0.95abc
0.5 65.56cdef 1.54ef 1.32bc 0.77def
0.1 46.67fgh 1.00gh 1.25bc 0.69def
NAA 1.0 0i 0i 0d 0.63ef
0.5 0i 0i 0d 0.72def
0.1 0i 0i 0d 0.95abc
IAA 1.0 33.33h 0.53hi 0.40d 0.60f
0.5 37.78gh 0.51hi 1.32bc 0.78cde
0.1 75.56bcd 1.82e 1.41bc 0.97ab
CK — 53.33efg 0.60h 0.97c 0.82bcd
　　同列不同小写字母表示在0.05水平上差异显著, 下表同。
张楠等: 不同植物生长调节物质对细叶小羽藓愈伤组织诱导及分化的影响 713
异显著, 干重增长率差异不显著, 当6-BA浓度为1.0
mg·L-1时, 愈伤组织鲜、干重增长率最低。综上所
述, 在MS培养基中添加0.3 mg·L-1 6-BA最适宜细叶
小羽藓愈伤组织的诱导。
3 不同植物生长调节物质对细叶小羽藓愈伤组织
分化的影响
将细叶小羽藓绿色、生长基本一致的愈伤组
织转入含有不同植物生长调节物质的培养基上,
结果见表4。在添加了2,4-D的培养基上分化出的
藓株量较多, 长势健壮, 但原丝体的颜色变浅; 在
添加KT的培养基上未分化出藓株, 但愈伤组织进
一步增殖, 愈伤组织量与添加了TDZ的培养基上愈
伤组织量差异不显著; 在添加IBA的培养基上愈伤
组织变为深绿色, 有较多藓株在愈伤组织上方生
成, 藓株健壮(图1-E、F), 原丝体数量最多, 原丝体
颜色及致密度分别为绿色紧密、深绿色致密; 愈
伤组织在添加TDZ的培养基上增殖最快, 但愈伤组
织变为浅绿色, 在愈伤组织上方不断有芽体产成,
可是芽体生长不一致, 大部分芽体褐化, 不能形成
正常藓株, 且产生的原丝体量较少, 褐色、松散;
产生。接种30 d后, 添加不同浓度6-BA的MS培养
基中均诱导出绿色的愈伤组织 , 且诱导率均为
100%, 但均有不同程度的褐化及分化(表2)。
表4 不同植物调节物质对细叶小羽藓愈伤组织分化的影响
Table 4 Effects of different plant growth regulators on differentiation of H. microphyllum callus
植物生长调节物质 藓株 原丝体 愈伤组织
种类及浓度 数量 长势 数量 颜色 致密度 颜色 数量
2,4-D 1.0 mg·L-1 ++ 健壮 ++ 绿色 致密 深绿色 +
KT 0.5 mg·L-1 — — — — — 绿色 +++
IBA 1.0 mg·L-1 +++ 健壮 +++ 深绿色 致密 深绿色 +
TDZ 1.0 mg·L-1 + 一般 ++ 褐色 松散 浅绿色 +++
6-BA 0.3 mg·L-1 — — + 绿色 紧密 绿色 ++
CK + 弱 +++ 深绿色 致密 黑色 +
　　+表示有; ++表示较多; +++表示很多; —表示无(陈静文等2006)。
表2 不同浓度TDZ和6-BA对细叶小羽藓配子体愈伤组织
诱导的影响
Table 2 Effects of different concentrations of TDZ and 6-BA
on callus induction of H. microphyllum gametophyte
种类 浓度/mg·L-1 诱导率/% 褐化率/% 分化率/%
TDZ 1.0 100.00a 40.00ab 50.00ab
0.5 73.33b 50.00a 43.33ab
0.1 79.67b 63.33a 33.33b
6-BA 1.0 100.00a 10.00c 60.00a
0.5 100.00a 16.19bc 33.33b
0.1 100.00a 60.12a 10.00c
CK — 0c — —
2 不同浓度6-BA对细叶小羽藓愈伤组织诱导的影
响
在添加不同浓度6-BA的培养基中均诱导出绿
色的愈伤组织, 且诱导率均为100%。但当6-BA浓
度为0.4~1.0 mg·L-1时, 在转接3~5 d时即可观察到
愈伤组织出现分化现象。如表3所示, 当6-BA浓度
为0.3 mg·L-1时, 愈伤组织致密、愈伤组织直径增
长率最大、褐化率最低(图1-C、D)。当浓度为0.1
和0.2 mg·L-1时, 愈伤组织直径增长率与浓度为0.3
mg·L-1差异不显著, 但愈伤组织疏松, 褐化率最
高。转接数次后称量愈伤组织的鲜重及干重可知,
当6-BA浓度为0.3 mg·L-1时, 愈伤组织鲜、干重增
长速度最快, 分别为874%和991%。当6-BA浓度为
0.1、0.2和0.4 mg·L-1时, 愈伤组织鲜、干重增长率
差异不显著, 当6-BA浓度为0.5 mg·L-1时, 愈伤组织
鲜重增长率与6-BA浓度为0.1、0.2和0.4 mg·L-1差
表3 不同浓度6-BA对细叶小羽藓配子体愈伤组织诱导的
影响
Table 3 Effects of different concentrations of 6-BA on callus
induction of H. microphyllum gametophyte
6-BA浓度
紧密度 褐化率/%
增长率%
/mg·L-1 直径 鲜重 干重
1.0 比较致密 0c 348c 111d 302c
0.5 比较致密 7.00bc 364c 414c 537b
0.4 比较致密 0c 413bc 545b 590b
0.3 致密 0c 510a 874a 991a
0.2 疏松 16.30b 451ab 596b 695b
0.1 疏松 37.45a 483ab 520b 658b
植物生理学报714
添加6-BA的培养基上未见藓株分化, 但在愈伤组
织的下方出现少量绿色、紧密的原丝体; 对照组
细叶小羽藓愈伤组织未增殖, 并变为黑色, 在愈伤
组织下方产生大量深绿色、致密、垫状的原丝体,
但藓株数量较少, 藓株长势较弱。综合分析, 在培
养基中添加0.5 mg·L-1 KT最有利于愈伤组织的增
殖, 在培养基中添加1.0 mg·L-1 IBA藓株及原丝体
分化效果最好。
讨　　论
高永超等(2003, 2007)认为6-BA抑制牛角藓
(Marchantia polymorpha)及地钱(Marchantia poly-
morpha)愈伤组织的诱导。尹德明等(2008)研究发
现, 当在培养基中添加0.5 mg·L-1 2,4-D+2 mg·L-1
NAA+2 mg·L-1 6-BA最适合地钱细胞生长及次生
代谢生产。Wang等(1981)在培养立碗藓(Phy-
scomitrella patens)的培养基中发现了浓度很低的
内源植物生长调节物质的存在。高永超等(2007)
发现NAA对地钱愈伤组织的诱导作用明显, 陈静
文等(2006)研究发现添加6-BA 0.05 mg·L-1或KT
0.05 mg·L-1, 小立碗藓的愈伤组织诱导率均为
100%, 且褐化率较低, 诱导效果最佳。本研究中发
现NAA抑制细叶小羽藓芽体的诱导, 2,4-D、KT、
IBA、IAA均能诱导出芽体, 但未促进愈伤组织的
形成, 0~1 mg·L-1的TDZ和6-BA均能诱导出愈伤组
织, 与上述文献描述不同, 说明不同植物生长调节
物质对不同属种的苔藓植物作用差异很大。
陈静文等(2006)发现在未添加植物生长调节
物质的培养基中小立碗藓的愈伤组织即可分化为
正常的藓株, Gang等(2003)发现仙鹤藓(Atrichum
undulatum)和仙鹤藓小形变种(Atrichum undulatum
var. minus)在含4%葡萄糖但无任何激素的MS培养
上能再分化形成原丝体, 而在无任何碳源的Be-
necke培养基上能再分化形成经原丝体阶段发育来
的配子体, 本研究中未添加植物生长调节物质的
培养基上愈伤组织变为黑色, 在愈伤组织上部仅
分化出少量长势较弱的细叶小羽藓藓株, 同时在
愈伤组织的下部分化出深绿色、致密的原丝体,
这与两者的研究都不同。
在对愈伤组织的诱导中, KT的添加不能使细
叶小羽藓的原丝体或配子体产生愈伤组织, 但当
把愈伤组织放入添加了KT的培养基中培养时, 愈
伤组织不能产生藓株和原丝体, 而是进一步增殖,
可能是细叶小羽藓不同阶段对KT的反应差异很
大。综合考虑, 添加1.0 mg·L-1 IBA的MS培养基最
有利于细叶小羽藓愈伤组织的分化。
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