全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 12 期，2009 年 12 月 1155
收稿 2009-06-30 修定 　2009-11-08
资助 黑龙江省青年科技专项(QC07C56)和教育部科学技术研
究重点项目(1 0 7 0 3 7 )。
* 通讯作者(E-mail: wangyucheng1029@yahoo.com.cn;
Tel: 0451-82190607)。
二色补血草液泡膜 H+-ATP 酶 C 亚基(LbVHA-C)基因克隆和表达分析
蒋丽丽, 杨传平, 徐晨曦, 马辉, 王玉成 *
东北林业大学林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室, 哈尔滨 150040
提要: 从二色补血草 cDNA文库中分离出一个V-H+-ATP酶C亚基(LbVHA-C)基因全长 cDNA序列。该基因全长为729 bp。
其中, 开放读码框(ORF)为498 bp, 编码165个氨基酸, 预测编码蛋白的分子量为16.6 kDa, 理论等电点为8.62。用实时定量
RT-PCR方法进一步研究二色补血草在NaCl、NaHCO3和NaCO3胁迫下的不同时间内该基因表达模式的结果表明, NaCl
强烈诱导二色补血草叶组织中LbVHA-C基因的表达, 但其根部的表达变化不明显。NaHCO3胁迫下LbVHA-C基因在根部
组织的表达受抑制。Na2CO3胁迫24 h时的LbVHA-C基因在根和叶部组织中的表达都强烈受抑制, 随后在根和叶组织的表
达量逐步升高。
关键词: 二色补血草; V-H+-ATP酶C亚基基因; 实时定量RT-PCR; 基因表达
Cloning and Expression Analysis of LbVHA-C Gene from Limonium bicolor
(Bunge) Kuntze
JIANG Li-Li, YANG Chuan-Ping, XU Chen-Xi, MA Hui, WANG Yu-Cheng*
Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement and Biotechnology, Ministry of Education, Northeast Forestry University,
Harbin 150040, China
Abstract: A novel vacuolar H+-ATPase gene (LbVHA-C) was cloned from a cDNA library of Limonium bicolor.
Sequence analysis showed that the LbVHA-C gene was 729 bp in length, including 498 bp of open reading
frame (ORF), and encodes a protein of 165 amino acids with a predicted molecular mass of 16.6 kDa and pI of
8.62. The expression of LbVHA-C gene of L. bicolor in response to NaCl, NaHCO3 and Na2CO3 were investi-
gated by real-time RT-PCR. The result showed that the expression of LbVHA-C gene was strongly induced by
NaCl in leaves of L. bicolor, but not highly changed in roots. Under NaHCO3 stress, the expression of LbVHA-
C gene was inhibited in roots. And the expression of LbVHA-C gene were also strongly inhibited in both roots
and leaves under NaCO3 stress for 24 h, then the expression increased.
Key words: Limonium bicolor; vacuolar H+-ATPase gene (LbVHA-C); real time RT-PCR; gene expression
二色补血草又名付氏矶松、草原干枝梅, 是
蓝雪科补血草属的二年生草本植物, 多生于滩地、
湖盆、石质山坡、流动沙丘等干旱荒漠生境, 可
在强的盐碱化(pH 值 8.5~9)土地上正常生长, 是一
种泌盐植物, 有较强的抗旱和耐盐能力, 是碱化较
严重地区的理想绿化植物, 不必改良土壤即可以直
接种植(韩军丽和赵可夫2001; 鲁丽丽等2006)。此
外, 膜质子泵是一种推动质子跨膜运动的ATP酶系
统, 广泛存在于细胞中(王延枝和许献忠 1993)。迄
今, 已知的膜质子泵ATP酶分为三类: 质膜上的P-
ATP 酶(plasma membrane H+-ATPase)、线粒体上
的 F-ATP 酶(F-type ATP synthase)以及液泡膜上的
V-ATP酶 (vacuolar H+-ATPase) (蔡惠罗1994; 祝雄
伟等 1997)。C 亚基是目前 V-H+-ATP 酶中研究得
最为广泛的亚基之一, 是V-H+-ATP酶 V0域的组成
部分, V-H+-ATP 酶可以水解 ATP所释放出来的能
量, 将 H+ 泵到液泡中, 从而维持胞质中 pH的平衡,
形成跨膜的电化学势梯度, 并参与质子通道的形成,
在驱动质子转运中起作用(Magnin 等 1995; Perera
等 1995)。V-H+-ATP 酶为细胞生理活动的正常进
行, 以及各种离子和代谢物的转运提供必不可少的
研究报告 Original Papers
植物生理学通讯 第 45 卷 第 12 期，2009 年 12 月1156
条件(Ratajczak 2000; 夏朝晖和陈珈1998), 因此, 其
在生命活动中的功能日益引起人们的普遍关注
(Magnin 等 1995; Zhang 等 2004)。
本文从二色补血草中克隆了一条V-H+-ATP酶
基因, HMMTOP预测显示该蛋白共有4个跨膜螺旋
区, 提示其在跨膜运输中起作用。用实时定量PCR
技术研究了不同胁迫条件下该基因在二色补血草叶
片及根部组织中的表达, 从而为进一步研究LbVHA-
C 基因的抗逆功能提供了基础资料。
材料与方法
二色补血草[Limonium bicolor (Bunge) Kuntze]
种子种植在温室的花盆中, 其生长基质为草炭土与
沙(1:3), 温室的相对湿度为70%~75%, 平均温度24
℃, 日平均光照时间14 h, 光照强度为340 μmol·m-2·s-1。
以二月龄的二色补血草幼苗为试材, 分别用 0.2
mol·L-1 NaCl、0.2 mol·L-1 NaHCO3 和 0.2 mol·L-1
NaCO3溶液浇灌进行胁迫处理, 同时以生长在正常
条件下的二色补血草作为对照。在胁迫后 0、6、
12、24、48 h 后, 每个处理至少取 20 株二色补血
草的叶片和根部组织, 用双蒸水清洗, 充分混合后,
迅速置于液氮中冷冻, 并置于-70 ℃下保存, 供基
因表达分析用。
以构建的 0.4 mol·L-1 NaHCO3 胁迫 48 h 下二
色补血草叶组织的 cDNA 文库(Wang 等 2008), 通
过对文库的随机测序和 EST分析获得 V-ATP酶C
亚基(LbVHA-C)基因的全长 cDNA 序列。采用
NCBI的开放阅读框寻找程序(ORF founder)确定该
基因的开放阅读框, 用NCBI的Conserved Domains
工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/
wrpsb.cgi)对蛋白的分子量和理论等电点进行在线
计算(http://us.expasy.org/tools/pitool.htm)。用
ProScale 程序(http://www.expasy.org/cgi-bin/
protscale.pl)预测蛋白的疏水性。利用 HMMTOP
软件预测该蛋白的跨膜区。通过 BLASTX 程序对
NCBI的NR数据库进行同源性比对, 并对具有同源
性的不同植物来源的LbVHA-C蛋白用Clustal X1.83
进行多序列比对。用 Prosite 软件在线分析该蛋白
质的基本结构域。
采用 CTAB 法(王玉成等 2003)提取二色补血
草总 RNA, 并用 DNA 酶 I (Promega)消化, 去除
DNA。然后取 5 μg 总 RNA, 加入 2 μL 10×RT 缓
冲液、1 μL RNA 酶抑制剂、1.5 μL oligd (T) (10
mmol·L-1)、 3 μL dNTP (10 mmol·L-1)、2 U AMV
反转录酶(杭州博日公司)、1 μL 9 bp 随机引物(10
mmol·L-1), 用水补足体积 20 μL。反应程序为: 25
℃ 5 min; 42 ℃ 60 min。将逆转录产物稀释 10 倍,
用作定量 RT-PCR 模板。
实时定量RT-PCR反应试剂盒为SYBR Green
Realtime PCR Master mix (Toyobo Co., Ltd, Osaka,
Japan)。反应体系为: 10 μL 2×SYBR Green Real-time
PCR Master Mix、引物各 0.3 μL (20 mmol·L-1)、
6.9 μL水、2.5 μL 模板; 体积共 20 μL。定量 PCR
反应条件为: 94 ℃预变性30 s; 94 ℃ 12 s, 58 ℃ 30
s, 72 ℃ 40 s, 78.4 ℃读板 1 s, 45 个循环。然后在
荧光定量 PCR 仪上完成 RT-PCR。用 18S rRNA
(EU039827)和β-Tublin (EH793552)基因作为内参基
因。引物(上海生物工程公司合成)序列见表 1。用
2-ΔΔCT方法(Livak和Schmittgen 2001)进行基因的相
对定量分析。
结果与讨论
1 LbVHA-C基因全长cDNA的获得及序列分析
通过对二色补血草 cDNA 文库克隆的随机测
序, 获得了二色补血草液泡膜 H+-ATP 酶 C 亚基基
因(LbVHA-C)的 cDNA 序列(GenBank 登录号
GQ404375), 去除载体和 polyA 后该序列全长 729
bp, 开放阅读框自 158 位的 ATG 起, 止于 655 位的
TAA, 全长 498 bp, 共编码 165个氨基酸, 蛋白的分
子量为 16.6 kDa, 理论等电点为 8.62。负电荷氨
基酸总数( As p+ G l u)是 7 ; 正电荷氨基酸总数
(Arg+Lys)是 9。
表 1 实时定量 PCR 所用引物序列
Table 1 The primer sequences for real-time RT-PCR
引物名称 引物序列
VHA-C 5 ATGTCTTCTACCTTCAGTGGCG 3 5 CTTTGGTTGCTGGGCATTGG 3
18S rRNA 5 CCGTTCTTAGTTGGTGGAG 3 5 CTCGTTGAATACATCAGTGTAG 3
β-Tublin 5 GGTTGAGTGAGCAGTTCAC 3 5 GATAACCAGACCACACCTTAGC 3
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4 LbVHA-C蛋白序列的保守性分析
由于不同种属间V-H+-ATP酶C亚基的同源性
大大超过了 65%。因此, 认为它是目前已知的最
为保守的膜蛋白(Perera 等 1995)。本文中, BlastX
同源性搜索, 在GenBank的Nr数据库中共有100个
与其匹配的序列, 同源性都很高。随机选择的 8个
不同物种 V-H+-ATP 酶 C 亚基的氨基酸序列, 并用
多序列联配程序[Clustalx (1.83)]对这9个物种的氨
基酸序列进行多序列比对结果(图3)的表明, 二色补
血草V-H+-ATP酶C亚基蛋白与其他8个物种的同
源性很高, 最高的为 100%, 最低的为 95%, 而且氨
基酸个数差别不大, 说明二色补血草 V-H+-ATP 酶
C 亚基氨基酸序列在进化上非常保守的。
2 LbVHA-C蛋白的疏水性预测
用 ProScale程序预测蛋白的疏水性(图 1)。可
以看到, 1~160 个氨基酸的区域共有 5 个较强的疏
水区, 由此认为该蛋白为疏水蛋白, 属于膜蛋白。
3 LbVHA-C蛋白的跨膜区预测
以往的研究表明, V-H+-ATP 酶 C 亚基是一个
疏水亚基, 分子量约为 16 kDa, 其 2/3 的氨基酸残
基构成 4 个跨膜的 α 螺旋(Perera 等 1995)。与此
相似, 本文用 HMMTOP 软件预测该蛋白的跨膜区
的结果表明, 二色补血草 V-H+-ATP 酶 C亚基分别
在氨基酸残基 13~35、55~77、94~116 和 131~153
之间共有4个跨膜α螺旋区(图2), 说明该蛋白具有
典型的 V-H+-ATP 酶 C 亚基结构。
图 1 二色补血草 V-H+-ATP 酶 C 亚基疏水性预测
Fig.1 Prediction of hydrophobic in V-H+-ATPase from L. bicolor
图 2 二色补血草 V-H+-ATP 酶 C 亚基跨膜区预测
Fig.2 Predictability of transmembrane domain of V-H+-ATPase from L. bicolor
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5 LbVHA-C 基因应答盐碱胁迫的表达模式
以往的研究表明, V-H+-ATP 酶 C 亚基是对逆
境胁迫反应最敏感的亚基, 在胁迫发生后, C 亚基
的数量以及其mRNA的水平都明显而迅速的增加,
说明 C 亚基在植物响应逆境胁迫过程中具有举足
轻重的作用(Tyagi 等 2005; Tsiantis 等 1996; Chen
等 2002)。在本文中, 为了研究 V-H+-ATP 酶 C 亚
基在 NaCl、NaHCO3、Na2CO3 胁迫处理下二色补
血草中的表达模式, 我们进行了实时荧光定量RT-
PCR, 用 18S rRNA 和 β-Tublin作内参, 数据为 3次
重复的平均值(图 4)。
总之, 在 NaCl 胁迫的 6~48 h 内, 叶组织中的
LbVHA-C 基因被强烈诱导, 并在胁迫 48 h 内始终
保持高的表达水平, 是胁迫前的 630~1 782 倍; 而
根部组织中, LbVHA-C 基因的表达与胁迫前(0 h)
的差异不大(图 4-a)。这与Tsiantis等(1996)抗逆的
图 3 9 种植物 V-H+-ATP 酶 C 亚基蛋白的多序列比对
Fig.3 Multiple sequence alignments of V-H+-ATPase protein from 9 plant species
LiVA-C: 二色补血草(Limonium bicolor); SuVA-C: 碱蓬(Suaeda maritime, 登录号 AAP15165); MeVA-C: 冰花(Mesembryanthemum
crystallinum, 登录号 CAA64455); CiVA-C: 蜜柑(Citrus unshiu , 登录号 BAA75542); NiVA-C: 烟草(Nicotiana tabacum, 登录号
CAA65063); AvVA-C: 白骨壤(Avicennia marina, 登录号 AAK01292); TrVA-C: 小麦(Triticum aestivum, 登录号 ABG23316); OrVA-
C: 水稻(Oryza sativa, 登录号 BAB63620); ToVA-C: 念珠藻(Tortula ruralis, 登录号 AAL09329)
NaCl胁迫下, 冰草(Mesembryanthemum crystallinum)
的 V-H+-ATP 酶 C亚基在叶片中受强烈诱导, 并且
该基因主要在叶片组织中表达。以及夏朝晖等
(2000)等抗逆的高盐胁迫下, 燕子掌(Crassula
agenten)的 V-H+-ATP酶 C亚基的蛋白表达量在叶
片中显著增加的结果相似。据此可以推测其可能在
植物耐盐中起作用。在NaHCO3 胁迫 6 h, LbVHA-C
基因的表达在叶片组织中受到轻微的抑制, 并且在
胁迫6~48 h内的表达量变化较小; 但NaHCO3胁迫
使得该基因在根部组织中的表达受到强烈抑制(图
4-b)。Na2CO3胁迫使 LbVHA-C基因产生明显地差
异表达。在 Na2CO3 胁迫 12~24 h 时, 叶及根部的
表达量均下降(图 4-c)。因此说明, LbVHA-C 基因
可对NaCl、NaHCO3 和Na2CO3胁迫作出应答。因
此认为, 该基因可能与抗各种盐胁迫相关, 在二色
补血草抗逆胁迫中起作用。
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图 4 实时定量 RT-PCR 分析二色补血草中 V-H+-ATP 酶 C 亚基基因在根、叶中的表达模式
Fig.4 The expression pattern of LbVHA-C gene in leaf and root of L. bicolor by real-time RT-PCR analysis
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