全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (4): 347~350 347
收稿 2010-10-13　　修定 2011-01-19
资助 国家自然科学基金(30972387)和教育部新世纪优秀人才计
划(NCET-08-0751)。
* 通讯作者(E-mail: wangyucheng1029@yahoo.com.cn; Tel:
0451-82190607)。
二色补血草LbDREB基因在酵母中的抗逆性分析
王留强, 班巧英, 贺琳, 王玉成*
东北林业大学林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室, 哈尔滨150040
摘要: 利用酵母表达系统研究了二色补血草的DREB基因(LbDREB)对不同胁迫的抗性。将LbDREB构建到酵母表达载体
pYES2中, 转化到酿酒酵母INVSc1菌株中, 并以转空pYES2质粒的酵母INVSc1 (pYES2)作为对照, 通过比较两种酵母在不
同胁迫下的存活率来研究LbDREB基因对NaCl、KH2PO4、Na2CO3、NaHCO3、低温、干旱、CuSO4和CdCl2胁迫的抗性。
结果表明, LbDREB转化的酵母在各种胁迫下的存活率均明显高于转空pYES2的对照酵母, 说明LbDREB基因除了具有传统
认为的抗旱、耐盐、抗寒的作用外, 还具有抗KH2PO4、Na2CO3、NaHCO3、CuSO4和CdCl2等胁迫的能力。
关键词: 二色补血草; DREB基因; 抗逆; 酵母表达
Stress Tolerance Analysis of LbDREB Gene from Limonium bicolor Kuntze in Yeast
WANG Liu-Qiang, BAN Qiao-Ying, HE Lin, WANG Yu-Cheng*
Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement and Biotechnology, Ministry of Education, Northeast Forestry University,
Harbin 150040, China
Abstract: To investigate the stress tolerance of LbDREB, the recombinant plasmid pYES2-LbDREB was con-
structed by inserting the LbDREB gene into the yeast expression vector pYES2. The recombinant plasmid
pYES2-LbDREB was transformed into yeast Saccharomyces cerevisiae INVSc1, and the INVSc1 strain trans-
formed with empty pYES2 was used as the control. The recombinant yeast INVSc1 harboring LbDREB
(pYES2-LbDREB) and the control INVSc1 harboring empty pYES2 were respectively treated with NaCl, KH2-
PO4, Na2CO3, NaHCO3, frezzing, drought, CuSO4 and CdCl2, and their survial rates were compared. The results
showed that the survival rates of the recombinant yeast INVScl (pYES2-LbDREB) were obviously higher than
those of the control strain under these stress conditions. It indicated that beside the known tolerance to salt,
drought and cold, the LbDREB was also tolerant to NaCl, KH2PO4, Na2CO3, NaHCO3, frezzing, drought, CuSO4
and CdCl2 stress.
Key words: Limonium bicolor; DREB gene; stress tolerance; yeast expression
DREB (dehydration-responsive element binding
protein)转录因子能与DRE/CRT顺式作用元件特异
性地结合, 进而调控一系列逆境胁迫应答有关基
因的表达, 增强植物的抗逆能力(谢永丽等2005)。
因此, DREB在植物对干旱、高盐及低温等胁迫的
抗性调控中起十分重要的作用(王红蕾2008)。目
前, 人们从多种植物中分离克隆了DREB基因并对
其进行功能研究。例如, Liu等(1998)通过酵母单
杂交的方法, 从拟南芥cDNA文库中分离到了3个
DREB基因DREB1A、DREB1B和DREB1C; 并在干
旱处理的拟南芥cDNA文库中克隆到2个受干旱和
高盐胁迫诱导的DREB基因DREB2A和DREB2B。
随后, 人们对其他植物中的DREB类基因家族进行
了不断地深入研究。Jaglo等(2001)分别从油菜
(Brassica napus L.)、黑麦(Secale cereale L.)、小麦
(Triticum aestivum L.)和番茄(Lycopersicon esculen-
tum Mill.)中分离得到与拟南芥DREB1B同源的
DREB类转录因子, 并对其表达模式作了进一步研
究。Shen等(2003)分别从干旱处理的小麦cDNA文
库和高盐处理的山菠菜(Atriplex hortensis L.)
cDNA文库中筛选出TaDREB1和AhDREB1, 并对其
进行了表达模式研究和抗性分析。但目前, 主要
研究报告 Original Papers
植物生理学报348
针对DREB基因如何参与植物在低温、高盐和干
旱时的抗性调控研究, 但对于它是否参与了植物
对其他胁迫的抗性调控研究得还比较少。
本文从二色补血草中克隆出DREB基因(Lb-
DREB), 将其构建到酵母表达载体pYES2中, 并转
化酿酒酵母INVSc1, 获得重组酵母INVSc1 (pYES2-
LbDREB), 利用重组酵母对LbDREB进行了NaCl、
KH2PO4、Na2CO3、NaHCO3、低温、PEG6000、
CuSO4和CdCl2等不同胁迫的研究, 为LbDREB基因
作为植物抗逆工程的理想基因提供依据。
材料与方法
根据二色补血草(Limonium bicolor Kuntze)
LbDREB基因(GenBank登录号FJ872558)序列设计
引物, DrSL: 5′ GTACGGATCCACCATGGCTA-
CAGCTATTGATATTTAC 3′; DrSR: 5′ CTGC-
GAATTCTCAATCGATCTCCATAGACGGAAAAT
3′。两端引物分别带有BamHI和EcoRI酶切位点,
以二色补血草的cDNA为模板, 扩增LbDREB基因
的完整开放阅读框(ORF)序列。与pYES2载体(In-
vitrogen)连接, 构建重组质粒pYES2-LbDREB。将
pYES2-LbDREB及空载体pYES2 (作为对照)用乙
酸锂沉淀法(Sakuma等2002)转化酿酒酵母INVSc1
(Saccharomyces cerevisiae), 分别命名为INVSc1
(pYES2-LbDREB)和INVSc1 (pYES2)。
挑取INVSc1 (pYES2-LbDREB)和INVSc1
(pYES2) 2种酵母菌株接种于SC-Ura培养基(含有
2%葡萄糖)中, 30 ℃摇床振荡过夜培养, 然后于
SC-Ura培养基(含终浓度2%半乳糖为碳源及诱导
底物)诱导培养。INVSc1 (pYES2-LbDREB)分别
诱导培养12、24、36、48和60 h, 以及抑制培养
(葡萄糖为碳源) 36 h。INVSc1 (pYES2)诱导培养
36 h及抑制培养36 h作为对照。提取上述处理的
菌体总RNA (Sakuma等2002), 再利用DIG-dNTP替
换普通PCR的dNTP, 用引物HybL (5′ ATGGCTA-
CAGCTATTGATATTTAC 3′)和HybR (5′ AAGT-
CACCTCTCAGCTTGTACG 3′)对LbDREB基因进
行PCR扩增, 将所得产物作为探针。利用Northern
杂交技术研究外源LbDREB基因子在不同诱导时
间表达, 并确定最佳诱导表达时间, 其步骤参照分
子杂交试剂盒(DIG High Prime DNA Labeling and
Detection Starter Kit II, Roche)使用说明。
挑取酵母INVSc1 (pYES2-LbDREB)和IN-
VSc1 (pYES2)单克隆于SC-Ura培养基中扩大培养
24 h (Northern杂交表明诱导培养24 h时基因表达
量最高), 离心菌体, 将10 mL诱导培养基(SC-Ura培
养基+2%半乳糖)中菌体浓度OD600调整为0.4, 30
℃诱导表达24 h后, 测其2种酵母的菌体浓度OD600
值, 再统一调整到OD600值为2, 取2种等量的酵母菌
体进行不同的胁迫处理。其中菌体重悬于 5
mol·L-1 NaCl溶液中于4 ℃处理24 h, 10% (W/V)
KH2PO4、300 μmol·L
-1 CuSO4溶液胁迫3 h, 20%
(W/V) PEG6000、600 μmol·L-1 CdCl2溶液于30 ℃
胁迫24 h, 低温胁迫则将菌体重悬于无菌水中
于-20 ℃放置24 h, 其间菌液每隔6 h冻融1次, 以上
胁迫处理的菌液和未胁迫处理的菌液均依次稀释
1、100、1 000、10 000倍。而用6%、8%和10%
Na2CO3、NaHCO3溶液30 ℃分别胁迫0.5 h和3 h,
且菌液不稀释。取3 μL菌液直接点样在SC-Ura
(含有2%葡萄糖)的固体培养基上, 30 ℃恒温培养
48 h, 比较INVSc1 (pYES2) 和INVSc1 (pYES2-Lb-
DREB)的生长状态, 每种胁迫实验重复3次。
结果与讨论
1 重组酵母INVSc1 (pYES2-LbDREB)的转化及
检测
将载体pYES2和pYES2-LbDREB转化酿酒酵
母INVSc1, 用SC-Ura培养基筛选阳性转化子。用
引物LbDREBL (5′ ATGGCTACAGCTATTGAT-
ATTTAC 3′)和LbDREBR (5′ TCAATCGATCTC-
CATAGACGG 3′)对INVSc1 (pYES2-LbDREB)酵
母单菌落进行PCR扩增验证, 其扩增片段与预期的
1 071 bp长度相吻合(图1), 证明重组质粒pYES2-
LbDREB转化酵母成功。
图1 重组酵母INVSc1 (pYES2-LbDREB)的PCR鉴定
Fig.1 Identification of expression vector
pYES2-LbDREB by PCR
P: LbDREB双酶切产物; 1~4: 重组酵母INVSc1 (pYES2-
LbDREB) PCR产物; M: DNA分子标记DL2000。
王留强等: 二色补血草LbDREB基因在酵母中的抗逆能力分析 349
2 外源LbDREB基因在酵母中的诱导表达
利用Northern杂交分析外源LbDREB基因在不
同诱导时间的表达。结果(图2)表明, 酵母INVSc1
(pYES2)没有表达LbDREB, 而重组酵母INVSc1
(pYES2-LbDREB)在诱导培养后LbDREB基因明显
表达, 且表达量呈现先上升再下降的趋势, 在诱导
24 h达到高峰。由此确定, 转基因酵母的最佳诱导
培养时间是24 h。
当(图3-A), 表明可以比较它们对胁迫的耐受性。
在NaCl和KH2PO4胁迫下, 两种酵母均能够生
长, 但重组酵母INVSc1 (pYES2-LbDREB)的存活率
明显高于对照酵母INVSc1 (pYES2) (图3-B、C)。说
明在相同盐胁迫条件下, 二色补血草LbDREB基因的
表达可明显提高酵母细胞对盐胁迫的耐受能力。
低温胁迫的结果(图3-D)表明, 重组酵母IN-
VSc1 (pYES2-LbDREB)存活率明显高于对照IN-
VSc1 (pYES2)。说明LbDREB具有抗低温能力, 它
在酵母中表达增强了酵母的抗冻能力。
PEG6000胁迫的结果(图3-E)显示, 胁迫下两
种酵母均能够生长, 但重组酵母INVSc1 (pYES2-
LbDREB)生长情况明显优于对照酵母INVSc1
(pYES2), 说明INVSc1 (pYES2-LbDREB)比IN-
VSc1 (pYES2)更能抵抗PEG6000胁迫。
CuSO4胁迫的结果(图3-F)表明, 两种酵母均能
够生长, 但INVSc1 (pYES2-LbDREB)的存活率明
显高于INVSc1 (pYES2)。在CdCl2胁迫下, INVSc1
(pYES2-LbDREB)存活率也明显高于INVSc1
(pYES2) (图3-G)。说明由于LbDREB基因在酵母
中的表达, 增强了酵母的抗重金属耐受能力。
在Na2CO3和NaHCO3胁迫下酵母的生长结果
图2 酵母Northern 杂交图谱
Fig.2 Northern blot analysis of recombinant yeast
1: 酵母INVSc1 (pYES2)抑制培养36 h; 2: 酵母INVSc1
(pYES2)诱导培养36 h; 3: 重组酵母INVSc1 (pYES2-LbDREB)
抑制培养36 h; 4~8: 重组酵母INVSc1 (pYES2-LbDREB)分别诱
导培养12、24、36、48、60 h。
3 重组酵母INVSc1 (pYES2-LbDREB)对逆境胁
迫的抗性分析
在未胁迫情况下, 重组酵母INVSc1 (pYES2-
LbDREB)和对照酵母INVSc1 (pYES2)生长状态相
图3 酵母INVSc1 (pYES2-LbDREB)和INVSc1 (pYES2)在不同非生物胁迫条件下的生长
Fig.3 Growth of INVSc1 (pYES2-LbDREB) and INVSc1 (pYES2) yeast under different abiotic stress conditions
1×、102×、103×、104×分别代表稀释0、100、1 000、10 000倍。LbDREB: 重组酵母INVSc1 (pYES2-LbDREB); pYES2: 对照酵母
INVSc1 (pYES2)。A: 非胁迫; B: 5 mol·L-1 NaCl胁迫24 h; C: 10% KH2PO4胁迫3 h; D: 低温(-20 ℃)胁迫24 h; E: 20% (W/V) PEG6000胁迫24 h;
F: 300 μmol·L-1 CuSO4胁迫3 h; G: 600 μmol·L
-1 CdCl2胁迫24 h; H: 6%、8%、10% Na2CO3胁迫0.5 h; I: 6%、8%、10% NaHCO3胁迫3 h。
植物生理学报350
(图3-H、I)表明, 当Na2CO3溶液浓度为6%和8%时,
INVSc1 (pYES2)几乎无法生长 , 而 INVSc1
(pYES2-LbDREB)却有很高的存活率。说明由于
LbDREB基因的表达, 使重组酵母INVSc1 (pYES2-
LbDREB)对Na2CO3和NaHCO3胁迫的耐受能力明
显增强。
植物感受干旱、高盐以及低温等逆境胁迫时,
体内会发生一系列的生理及生化变化, 从而引发
细胞内胁迫相关信号通路的激活或抑制, 以适应
相应的逆境胁迫(谢永丽等2005)。目前, 人们对多
种不同植物的DREB基因在逆境胁迫下的表达模
式及对抗逆的调控进行了研究。我们通过酿酒酵
母表达系统研究了LbDREB基因抗逆性的结果表
明, LbDREB转基因酵母对不同胁迫处理的抗逆性
明显提高, 据此推测DREB基因在植物抗逆调控中
起重要作用。在低温和高盐胁迫下, LbDREB转基
因酵母较对照酵母的存活率明显提高(图3-B、D),
这与谢永丽等(2005)研究的抗逆BeDREB1基因在
低温诱导时过量表达、BeDREB2基因在高盐诱导
时过量表达, 以及Dubouzet等(2003)的抗逆水稻
OsDREB1A基因诱导超表达, 使转基因拟南芥植株
对冷冻和高盐胁迫耐性明显增强的结果相似。同
时, 在PEG6000胁迫下, 转LbDREB基因的酵母的
生长量明显优于对照酵母(图3-E), 这与Qin等
(2007)抗逆的转OsDREB1B基因拟南芥的耐旱性有
明显提高的结果一致。一个值得注意的现象是,
10%的Na2CO3与NaHCO3处理下的酵母的生长明
显优于6%和8% Na2CO3与NaHCO3处理的(图3-H、
I), 这与其他的盐胁迫结果不同。其可能原因是这
两种盐与其他盐(如: NaCl、KH2PO4等)不同, 均为
碱性盐, 其高浓度可能反而有助于酵母的生长, 具
体原因还有待研究。我们研究还发现, 二色补血
草LbDREB基因还具有明显的抗重金属(CuSO4、
CdCl2)能力。以上结果充分证明LbDREB基因具有
优良的抗逆能力, 对该基因的深入研究不仅有助
于揭示二色补血草的抗逆机理, 而且为植物抗逆
基因工程育种提供优良的候选基因。
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