全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 2期，2008年 4月 201
二色补血草硫氧还蛋白(Trx)的克隆和表达分析
张大伟，杨传平，王玉成 *，班巧英，马辉
东北林业大学林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室，哈尔滨 150040
提要：从二色补血草 cDNA文库中分离出1个硫氧还蛋白基因全长 cDNA序列。基因全长1 138 bp，其中，5非翻译(UTR)
区 128 bp，3非翻译区 212 bp，开放阅读框(ORF)全长 798 bp，编码 265个氨基酸，编码蛋白的分子量为 28.58 kDa，理
论等电点(pI)为 9.68。BlastP分析表明二色补血草Trx与拟南芥Trx序列同源性为52%，与葡萄Trx序列同源性为76%，从
11个物种的氨基酸多序列比对可以看出Trx氨基酸序列保守性较高。实时定量RT-PCR方法检测低温、NaCl和PEG胁迫
不同时间后的基因在二色补血草中表达模式的结果表明，NaCl能诱导Trx基因在二色补血草叶中表达，胁迫24 h后达到
高峰，而聚乙二醇和低温处理则抑制Trx在二色补血草根和叶的表达。
关键词：二色补血草；硫氧还蛋白；基因克隆；实时荧光定量 PCR
Cloning and Expression Analysis of Thioredoxin Gene (Trx) from Limonium
bicolor
ZHANG Da-Wei, YANG Chuan-Ping, WANG Yu-Cheng*, BAN Qiao-Ying, MA Hui
Key Laboratory of Forest Tree Genetic Breeding and Biotechnology, Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin
150040, China
Abstract: The full length cDNA of a novel thioredoxin was cloned from Limonium bicolor cDNA library. The
sequence of thioredoxin was 1 138 bp in length, including 128 bp of 5 untranslated region and 212 bp of 3
untran-slated region. It had an open reading frame (ORF) of 798 bp and encoded a protein with 265 amino acid
residues. The encoded protein molecular weight was 28.58 kDa and its theoretical pI was 9.68. Multiple se-
quence alignment of Trx proteins from 11 plants revealed that the Trx gene share high identities in sequence.We
examined the expression pattern of the Trx gene in leaf and root of L. bicolor treated with NaCl, low temperature
and PEG stresses for differenr time using real time RT-PCR. The results showed that the Trx was induced by
NaCl treatments in leaf of L. bicolor with a expression peak at treatment for 24 h. However, Trx was inhibited
by low temperature and PEG treatment in both leaf and root of L. bicolor.
Key words: Limonium bicolor; thioredoxin; gene cloning; RT-PCR
收稿 2007-10-16 修定 　2008-02-14
资助 教育部科学技术研究重点项目(1 0 7 0 3 7 )、国家自然科
学基金面上项目(30 57150 9)和黑龙江省攻关重点项目
(GB06B303-1)。
* 通讯作者(E-mail：wangyucheng1029@yahoo.com.cn；
T el：0 4 5 1 -8 2 1 9 1 6 2 7 )。
植物遭受盐、干旱和低温胁迫后，初期会造
成植物体离子失衡和渗透紊乱，引发植物的“生
理性干旱”；胁迫的延续或加重还会伴有活性氧
(ROS)的产生和次生性氧化胁迫的发生。以致细
胞的氧化还原内环境发生改变，并且会诱发包括
硫氧还蛋白(Trx)的表达增加在内的一系列应答氧
化胁迫的应急反应。另有实验证明，转基因植物
中ROS清除因子的过量表达或具有更高ROS清除
功能的突变体对环境胁迫具有更强的耐受性
(Bohnert和 Sheveva 1998)。硫氧还蛋白是一种低
分子量的热稳定蛋白，广泛存在于植物、细菌、
酵母和动物体中。它们在多种反应中通过可逆的
双硫键和硫醇变化起氧化还原载体的作用，是酶
活性调节蛋白(Nishiyama等 2001)。Trx在细胞内
主要的功能是还原目标蛋白质的二硫键，具有抗
氧化、细胞因子以及趋化的特性(Sederberg等
2000)，并能够清除因胁迫产生的 ROS。因此认
为，可能与植物抵抗逆境胁迫相关。
二色补血草(Limonium bicolor)又名付氏矶松、
草原千枝梅。多年生草本植物。可在干旱和盐碱
研究报告 Original Papers
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地生长，是碱化较严重地区的理想绿化植物，不
经改良的土壤上可以直接种植，说明它具有良好
的抗干旱和耐盐碱胁迫的能力，是进行植物抗干
旱和耐盐碱基因克隆的理想材料之一。本文克隆
了二色补血草的 Trx基因，并对其在非生物胁迫
逆境下的表达进行了分析，这为以后深入了解Trx
基因功能和其在植物抗逆中的作用积累了基础资
料。
材料与方法
二色补血草[Limonium bicolor (Bunge) Kuntze]
种子种在温室花盆中，生长基质为沙和草炭土(2:
1)。温室的温度为 24 ℃，平均光照强度为 400
µmol⋅m-2⋅s-1，相对湿度在 65%~75%之间，每天
浇水，保证土壤水分充足。种子萌发生长 2个月
后，取二月龄的二色补血草幼苗分别用 0.2 mol⋅L- 1
NaCl，20% (W/V) PEG 6000 溶液浇灌土壤进行盐
和干旱胁迫处理。二色补血草的全株放在 3 ℃的
培养箱中进行低温处理，并以生长在正常条件下
的二色补血草作为对照。在胁迫 0、6、12、24
和 48 h后，分别取处理和对照二色补血草的健康
叶片(地上部分)和根部用蒸溜水清洗，拭干后置
于 -70 ℃中保存备用。
以构建的0.4 mol⋅L-1 NaHCO3 胁迫下的二色补
血草叶组织的 cDNA文库，通过对文库克隆的随
机测序和 EST分析获得 Trx基因的全长 cDNA序
列。用NCBI的ORF (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
gorf/gorf.html)软件寻找 Trx 基因的开放读码框
(OR F)，用 NC BI 的保守功能区域( cons erved
domains)分析程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Structure/cdd/wrpsb.cgi)预测保守区，用 ExPASY
网站(http://us.expasy.org/tools/pi tool)计算蛋白的分
子量及等电点，用 BlastP (http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/BLAST/)进行同源性搜索，选择了 10种与
其相似性高的植物的 T r x 基因氨基酸序列，用
Clustal X1.83程序对烟草、豌豆等11种植物的Trx
蛋白氨基酸序列进行多序列比对和构建系统进化
树。
采用CTAB法(王玉成等2003)提取不同处理时
的二色补血草根、叶中总 R NA，并用 DN as eI
(Promega)消化，去除 DNA。进行反转录，反转
录体系为 5 µg总 RNA，2 µL 10×RT 缓冲液；
40 U RNA酶抑制剂；1.5 µL Oligo d (T) (10 mmol⋅L-1) ；
3 µL dNTP (10 mmol⋅L-1) ；禽成髓细胞瘤病毒
(AMV)反转录酶 2 U；9 bp随机引物 1 µL (10
µmol⋅L-1)，用水补足体积至 20 µL。反应程序为：
25 ℃ 5 min ；42 ℃ 60 min。将逆转录产物稀释 10
倍，用作定量 RT-PCR模板。实时定量 RT-PCR
反应试剂盒为 SYBR Green Realtime PCR Master
mix (Toyobo，J apan)。反应体系为：10 µL
2×SYBR Green Realtime PCR Master mix；引物各 0.3
µL (20 µmol⋅L-1) ；6.9 µL水；2.5 µL模板。定量
PCR 反应条件为：94 ℃预变性 30 s； 94 ℃ 12 s，
58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，78.4 ℃读板 1 s ，45 个
循环。然后在荧光定量 PCR仪上完成 RT-PCR。
用 18 S rRNA (EU039827)和 β-Tublin (EH793552)
基因作为内参基因。用 2∆∆Ct方法进行基因的相对
定量分析(Livak和 Schmittgen 2001)，用Graphpad
Instat 3.0软件进行基因表达数据的显著性分析。
引物序列见表 1。
表 1 荧光定量 PCR的引物序列
Table 1 The primer sequences used in
real time RT-PCR analysis
引物名称 正反向引物序列
Trx基因 5 -TCTGTCACGGATTCCTCAT-3
5 -GTTTCCCAGTGTACTGCTTT-3
18 S rRNA基因 5 -CCGTTCTTAGTTGGTGGAG-3
5 -CTCGTTGAATACATCAGTGTAG-3
β -Tublin基因 5 -GGTTGAGTGAGCAGTTCAC-3
5 -GATAACCAGACCACACCTTAGC-3
实验结果
1 二色补血草 Trx基因的获得和序列分析
通过对二色补血草 cDNA文库克隆的随机测
序，获得的 Trx基因的全长 cDNA序列，全长为
1 138 bp，其中 5非翻译区 128 bp，3非翻译区
212 bp，开放读码框长 798 bp，编码 265个氨基
酸，终止密码子为 TAA。具有硫氧还蛋白非常保
守的活性中心序列氨基酸是胱氨酸 -甘氨酸 -脯氨
酸 - 胱氨酸(图 1)。
2 Trx基因的氨基酸序列分析
用NCBI的保守功能区域(conserved domains)
分析程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/
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子量为 28.58 kDa，理论等电点(pI)为 9.68，为
碱性氨基酸，其中丝氨酸最多，有 4 2 个，占
氨基酸总数的 15.8%。带负电荷的氨基(天门冬
氨 +谷氨酸)有 19个，带正电的(精氨酸+赖氨酸)
共有 33 个。不稳定系数为 51.21，为不稳定蛋
白。
BlastP分析该序列，选取与二色补血草Trx基
因相近 10个物种的 Trx基因序列，用多序列比对
程序(Clustal X1.8)进行分析得到的结果表明：二
色补血草 Trx 基因与其他 10种植物的同源性在
图 1 二色补血草 Trx基因 cDNA序列和氨基酸序列
Fig.1 The cDNA and deduced amino acid sequence of Trx gene
下划线标记的氨基酸为非常保守的活性中心序列。
cdd/wrpsb.cgi)预测基因的保守区，图 2显示，该
基因为Ⅰ类 T r x 家族基因，其保守序列位于第
168~262氨基酸之间。
通过ExPASY网站(http://us.expasy.org/tools/pi
tool.htm)的在线分析，计算该基因编码蛋白的分
图 2 Trx蛋白保守区的预测
Fig.2 The prediction of the conserved domain of Trx protein
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52%~76%之间，但C末端的氨基酸序列具有很高
的保守性，且存在1个高度保守的胱氨酸-甘氨酸-
脯氨酸 -胱氨酸的氨基酸序列(图 1)，但在其N末
端氨基酸序列构成上有较大的差异，而且其氨基
酸序列的长度也基本相似，充分说明了 Trx基因
在不同植物中的保守性。
在这11个物种中，二色补血草Trx与葡萄Trx
序列同源性最高，为 76%，与拟南芥 Trx序列同
源性最低，为 52%。这 11个物种的 Trx 序列绘
制分子进化树如图 3 所示。
3 寒冷、盐和干旱胁迫下的 Trx表达
为了研究二色补血草Trx基因与逆境胁迫的应
答关系，我们用定量 RT-PCR 技术检测 NaCl、
PEG和冷(3℃) 3种逆境胁迫下二色补血草Trx基因
表达的结果(图 4)表明，在盐胁迫下，Trx基因在
叶中的表达量明显高于未做胁迫处理的，并随着
时间进程而明显上升，胁迫 24 h后的表达量最
高，而后急剧下降，在 48 h达到最小值，甚至
低于未做胁迫处理的。我们的 PCR结果显示，Trx
基因在根中各个时间点的表达量无显著性变化(P>
0.05)，但在叶中的诱导表达情况却有所不同，在
NaCl胁迫 12、24、48 h的表达量差异极显著(P<
0.01)，而在 PEG和冷胁迫下的表达量则无显著性
变化(P>0.05)，并且表达量始终低于未做胁迫处
理的。同时 Trx基因在根和叶中的表达水平存在
着显著性差异(P<0.05)，说明NaCl胁迫可以诱导
Trx基因在叶中的表达，而抑制其在根中的表达。
在 PEG和冷胁迫下，Trx基因在根和叶中的表达
水平都存在着显著性差异(P<0.05)，但在根和叶
中的表达量都低于未做胁迫处理的，说明在 PEG
和冷胁迫下，Trx基因在叶和根中的表达都被抑
制，但不同胁迫时间的基因表达量有变化。这些
说明，Trx可对NaCl、冷和PEG的胁迫作出应答。
讨　　论
根据序列分析可以看出，二色补血草 Trx基
因为 I类Trx家族基因，它与其他物种的同源性较
高，达到 52%以上，N端氨基酸序列保守性差，
而 C端氨基酸序列高度保守，说明 C端可能对维
持 Trx蛋白的结构与功能起作用。
已有研究表明，高温、低温和重金属等胁迫
都会诱导 Trx基因的表达(Esposio等 1995)，但在
不同器官中的表达模式存在差异，说明硫氧还蛋
白的表达可增强植物抗这些胁迫的能力。实时定
量RT-PCR研究结果也证明，二色补血草的Trx基
因对NaCl﹑低温和 PEG胁迫具有应答反应。其
中，NaCl能诱导 Trx基因在叶中的表达，NaCl胁
迫 24 h后的 Trx基因表达量最高，是未作胁迫处
理的 5倍(图 4)，Trx基因的诱导表达可能是提高
了二色补血草的耐盐能力，说明其与盐胁迫中的
Na+有应答关系。以往的研究也证明Trx基因与植
物的耐盐等逆境相关，例如，夏德习等(2007)发
现转 Trx基因的拟南芥在 100 mmol·L-1 NaCl盐逆
境下的生长明显好于非转基因植株。孙志宾
图 3 11种植物 Trx家族蛋白的分子进化树
Fig.3 Phylogenetic tree of Trx family in 11 plants
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(2006)在研究不同浓度NaCl对拟南芥萌发率的影
响的试验中也发现，在萌发阶段，转 Trx基因和
非转基因的种子萌发速率都受NaCl的抑制，但转
基因的受抑制程度较非转基因的低。此外，Kim
等(2003)将小麦的Trx基因导入大麦中后，转基因
大麦抗硒污染的能力明显提高，在含有 1 ~ 2
mmol·L-1的硒溶液中，转基因大麦种子的发芽率
分别是 80%和 65%，而非转基因植株的发芽率分
别是 80% 和 10%，并且转基因大麦的根、芽比
图 4 NaCl、冷和PEG胁迫下二色补血草中Trx基因的表达
Fig.4 The expression patterns of Trx in leaf and
root of L. bicolor
NaCl处理为 0.2 mol·L-1 NaCl胁迫时，Trx的表达量随时
间变化而变化的相对量；冷处理为低温(3℃)胁迫时，Tr x 的表
达量随时间变化而变化的相对量；PEG处理为 20% (W/V) PEG
胁迫时，T r x 的表达量随时间变化而变化的相对量；数据为 3
次重复的平均值。
非转基因的长 5~10倍。本文结果也表明，NaCl
在二色补血草的根和叶中的表达模式不同，这暗
示此种基因在二色补血草的根和叶中处于不同的表
达调控体系。
综上所述，本文和前人的研究都显示 Trx基
因可受盐离子诱导表达，并具有耐盐能力。我们
的结果还表明冷和PEG明显削弱了Trx基因在二色
补血草根和叶片中的表达，与盐胁迫的结果相
反。冷和旱胁迫对 Trx基因的影响不同，相对于
盐和旱胁迫而言，NaCl胁迫能促使盐离子在二色
补血草中积累，从而导致 Trx基因上调表达。即
Trx基因的表达可能受离子胁迫高效诱导，这一点
还需进一步研究。
参考文献
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