全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 4 期，2009 年 4 月 323
收稿 2008-11-21 修定 　2009-02-23
资助 教育部科学技术研究重点项目(1 0 7 0 3 7 )、国家自然科
学基金面上项目(30 5 71 5 0 9)和黑龙江省攻关重点项目
(GB06B303-1)。
* 通讯作者(E-mail: wangyucheng1029@yahoo.com.cn;
Tel: 0451-82190607)。
二色补血草OEE2基因的克隆和表达
张大伟, 王玉成 *, 杨传平
东北林业大学林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室, 哈尔滨 150040
提要: 从二色补血草中分离出一条含有完整开放读码框(ORF)序列的OEE2基因。该基因全长 994 bp, 其中 5非翻译区 27
bp, 3非翻译区 160 bp, ORF全长 807 bp, 共编码 264个氨基酸, 编码蛋白的分子量为 28.2 kDa, 理论上的等电点为 7.66。
BlastP分析表明, 二色补血草OEE2与马铃薯OEE2序列同源性最高, 与喇叭水仙OEE2序列同源性最低, 从9个物种的氨基
酸多序列比对中可以看出, OEE2的氨基酸序列保守性较高。实时定量RT-PCR方法检测该基因对低温、NaCl和聚乙二醇
(PEG)胁迫的基因表达模式的结果表明, PEG和低温能诱导OEE2基因在二色补血草叶中表达, 这两种处理的OEE2基因表
达量于胁迫48 h后都达到高峰, 而在NaCl胁迫下OEE2在二色补血草根和叶中表达都受抑制。
关键词: 二色补血草; OEE2; 基因表达; 实时定量RT-PCR
Cloning and Expression Analysis of An Oxygen-evolving Enhancer Protein II
Gene (OEE2) from Limonium bicolor (Bunge) Kuntze
ZHANG Da-Wei, WANG Yu-Cheng*, YANG Chuan-Ping
Key Laboratory of Forest Tree Genetic Breeding and Biotechnology, Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin
150040, China
Abstract: The sequence of oxygen-evolving enhancer protein II (OEE2), which contained a complete open
reading frame (ORF), was cloned from a cDNA library of Limonium bicolor. The sequence was 994 bp in
length, including a 27 bp sequence of 5 untranslated region and a 160 bp sequence of 3 untranslated region. It
had an ORF of 807 bp in length, which encoded a deduced amino acids of 264 residues. The molecular weight
of deduced protein was 28.2 kDa with a theoretical pI of 7.66. Multiple sequence alignments of OEE2 proteins
from 9 plant species revealed that the OEE2 proteins shared high identities in amino acid sequence. The BlastP
analysis revealed that amino acid sequence of OEE2 protein from L. bicolor shared the highest amino acid
sequence similarity with that from Solanum tuberosum and the lowest similarity with that from Narcissus
pseudonarcissus among the 9 OEE2 proteins. We examined the expression pattern of the OEE2 gene in leaves
and roots of L. bicolor in response to NaCl, low temperature and PEG stresses at different time points by using
real time RT-PCR. The results showed that OEE2 could be induced by low temperature and PEG treatment in
leaves, its expression reached maximum level after treatment for 48 h by both low temperature and PEG.
However, the expression of OEE2 was inhibited by NaCl treatment in both leaves and roots of L. bicolor.
Key words: Limonium bicolor; oxygen-evolving enhancer protein 2; gene expression; real time RT-PCR
植物光合作用系统 II含有3个外周蛋白, 它们
的比率为 1:1:1 (Andersson等 1984), 其中氧不断变
化的增强蛋白 2 (oxygen-evolving enhancer protein
II, OEE2)由细胞核基因组中 psbP基因编码, OEE2
蛋白与维持Ca2+和Cl-的结合相关(吴守锋等2007),
这种结合在维持光系统II (PSII)的稳定和生物功能
中起作用(谭翠燕等2003), 光合放氧是植物PSII的
功能, 它催化水裂解而放出氧气。因此, OEE2 蛋
白在维持 PSII 的稳定性和保证植物光合作用正常
进行中起作用。已有的一些研究认为OEE家族基
因在植物中的表达与非生物胁迫有关。例如, 有研
究报道 NaCl (Sugihara 等 2000)、NaHCO3 (杨传平
等2004)以及高温和重金属胁迫(周海燕等2006)可
以明显改变OEE基因家族中的OEE1或OEE2基因
表达的变化, 这些提示, OEE 基因家族参与植物的
抗胁迫反应。
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二色补血草又名付氏矶松、草原千枝梅, 是
多年生草本植物。可在干旱和盐碱地生长, 是盐碱
化较严重地区的理想绿化植物, 在不经改良的土壤
上可以直接种植, 说明它具有良好的抗干旱和耐盐
碱胁迫的能力, 是进行植物抗干旱和耐盐碱基因克
隆的理想材料之一。本文克隆了二色补血草的
OEE2 基因, 分析其在非生物胁迫逆境下表达的结
果表明, 该 OEE2 基因的表达受盐、旱、低温等
胁迫的调控, 说明OEE2为胁迫应答基因, 因此, 本
文对这一问题作了探讨。
材料与方法
本文构建了一个二色补血草[Limonium bicolor
(Bunge) Kuntze.] cDNA文库, 共获得了 2 358 条高
质量的表达序列标签(expressed sequence tag, EST)
序列, 通过 EST 分析, 获得了含有完整开放读码框
(open reading frame, ORF)序列的OEE2基因(Wang
等 2008)。
二色补血草种子种在温室花盆中, 生长基质为
沙和草炭土(2:1)。温室的温度为 24 ℃, 平均光照
强度为 0.4 μmol·m-2·s-1, 相对湿度在 65%~75% 之
间, 每天浇水, 保证土壤水分充足。种子萌发生长
2 个月后, 取二月龄的二色补血草幼苗分别用 0.2
mol·L-1 NaCl和 20% (W/V) PEG6000溶液浇灌土壤
进行盐和干旱胁迫处理; 二色补血草的全株放在3 ℃
的培养箱中进行低温处理。以生长在正常条件下的
二色补血草为对照。在胁迫 0、6、12、24 和 48
h后, 分别取处理和对照二色补血草的健康叶片和根
部用蒸馏水清洗, 拭干后置于-70 ℃中保存备用。
以构建的0.4 mol·L-1 NaHCO3 胁迫下的二色补
血草叶组织的cDNA文库为研究对象, 通过对文库
克隆的随机测序和EST分析获得含有完整ORF序
列的 OEE2 基因。用 NCBI 的 ORF (http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)软件寻找 OEE2 基
因的ORF, 用NCBI的Conserved Domains 工具(http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)预测保守区, 用
ExPASY 网站(http://au.expasy.org/tools/protparam.
html)计算蛋白的分子量及等电点(pI), 用 BlastP
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行同源性
搜索, 选择了 8 种与其相似性高的植物的 OEE2 基
因氨基酸序列, 用 ClustalX 1.83 程序对烟草、豌豆
等9种植物的OEE2蛋白氨基酸序列进行多序列比
对和构建系统进化树。
采用CTAB法(王玉成等2003)提取不同处理的
二色补血草根、叶中总RNA, 用DNase I (Promega)
消化, 去除 DNA。进行反转录, 反转录体系为 5 μg
总 RNA、2 μL 10×RT 缓冲液、40 U RNasehit、
1.5 μL Oligo (dT) (10 mmol·L-1)、3 μL dNTP (10
mmol·L-1)、禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶 2
U、9 bp 随机引物 1 μL (10 μmol·L-1), 用水补足体
积至 20 μL。反应程序为: 25 ℃ 5 min; 42 ℃ 60
min。将逆转录产物稀释 10 倍, 用作定量 RT-PCR
模板。实时定量 RT-PCR 反应试剂盒为 SYBR
Green Realtime PCR Master Mix (Toyobo, Japan)。
反应体系为: 10 μL 2×SYBR Green Realtime PCR
Master Mix、引物各 0.3 μL (20 μmol·L-1)、6.9 μL
水、2.5 μL 模板。定量 PCR 反应条件为: 94 ℃预
变性30 s; 94 ℃ 12 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 40 s, 78.4 ℃
1 s, 45 个循环。然后在荧光定量 PCR 仪上完成
RT-PCR。用 18S rRNA (EU039827)和 β-Tublin
(EH793552)基因作为内参基因。用 2-ΔΔCT方法进行
基因的相对定量分析(Livak和Schmittgen 2001), 用
GraphPad InStat 3.0软件进行基因表达数据的显著
性分析。引物序列见表1。
实验结果
1 二色补血草OEE2基因的获得和序列分析
通过对二色补血草 cDNA 文库克隆的随机测
序, 获得了含有完整 ORF序列的 OEE2基因(图 1),
全长为 994 bp, 用 ORF founder 分析表明该基因 5
表 1 荧光定量 RT-PCR 的引物序列
Table 1 The primer sequences used in real time RT-PCR analysis
引物名称 正向和反向引物序列
OEE2 基因 5 TTTGGGAAGCAGAAGACC 3; 5 ACCACCCTCGGAATCAGT 3
18S rRNA 基因 5 CCGTTCTTAGTTGGTGGAG 3; 5CTCGTTGAATACATCAGTGTAG 3
β-Tublin 基因 5 GGTTGAGTGAGCAGTTCAC 3; 5 GATAACCAGACCACACCTTAGC 3
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图 1 二色补血草 OEE2 基因 cDNA序列和氨基酸序列
Fig.1 The cDNA and deduced amino acid sequence of OEE2 gene from L. bicolor
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非翻译区27 bp, 3非翻译区160 bp, ORF长807 bp,
编码 264 个氨基酸, 终止密码子为 TGA, 包含一个
46 bp 的多聚腺苷酸尾(polyA)。
2 OEE2基因的氨基酸序列分析
用 NCBI 的保守功能区域(conserved domains)
分析程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)预测基
因的保守区, 图 2 显示, 该基因为 PsbP 家族基因,
包含有 PsbP 保守序列(位于第 93~264 氨基酸之
间)。
通过 ExPASY 网站(http://au.expasy.org/tools/
图 2 OEE2 保守区预测
Fig.2 The conserved domain of OEE2 protein
protparam.html)的在线分析, 计算该基因编码的蛋
白质分子量为 28.2 kDa, 理论上 pI 为 7.66, OEE2
基因的 264 个氨基酸中 Ser 最多, 有 31 个, 占氨基
酸总数的 11.7%。带负电荷的氨基酸(Asp+Glu)有
25个, 带正电的(Arg+Lys)共有 26个。不稳定系数
为 39.32, 该蛋白是稳定蛋白。
对该序列进行BlastX分析, 并选取与二色补血
草 OEE2 蛋白相近的 8 个物种的蛋白序列, 用多序
列比对程序(ClusalX 1.8)进行分析得到的结果(图3)
表明二色补血草OEE2的氨基酸序列与其它8种植
物的同源性在63%~72%之间, C末端的氨基酸序列
具有很高的保守性, 但在其N末端氨基酸序列构成
上有较大的差异, 而且其氨基酸序列的长度也基本
相似, 说明OEE2蛋白序列在不同植物中具有一定
的保守性。
在这 9个物种中, 二色补血草OEE2蛋白与烟
草(Nicotiana tabacum) OEE2 序列同源性最高, 为
72%, 与喇叭水仙(Narcissus pseudonarcissus) OEE2
序列同源性最低, 为 63%。对该序列进行分子进
化树绘制, 结果如图 4。二色补血草 OEE2 氨基酸
聚类分析结果表明, 二色补血草与烟草最为相似, 其
次为菠菜, 而豌豆、喇叭水仙等聚在一起与二色补
血草进化上相距较远。
3 低温、盐和干旱胁迫下的OEE2表达
为了研究二色补血草 OEE2 基因对逆境胁迫
的应答, 我们用定量RT-PCR技术检测NaCl、PEG
和低温(3 ℃) 3 种逆境胁迫下二色补血草 OEE2 基
因表达(图 5)的结果表明, OEE2 基因在根、叶中
均表达。其中, 在根中各个时间点的表达量无显著
性变化(P>0.05), 并且表达量始终低于未做胁迫处
理的; 但在叶中的诱导表达情况却有所不同, 在低
温和 PEG 胁迫后 48 h 的表达量升高都极显著(P<
0.01)。这可能表明在根和叶中, OEE2 基因可能产
生 2 个不同的作用机理。同时, OEE2 基因在根和
叶中的表达水平存在着显著性差异(P<0.05), 说明
PEG 和低温胁迫可以诱导 OEE2 基因在叶中的表
达, 而抑制其在根中的表达。在NaCl胁迫下, OEE2
基因在根和叶中的表达量都被抑制, 始终低于未做
胁迫处理的, 但不同胁迫时间的基因表达量有变化,
这些说明, OEE2基因的表达受NaCl、低温和PEG
等胁迫的调控。
讨　　论
从序列分析中可以看出, 二色补血草OEE2基
因为 PsbP 家族基因, 它与其他物种的同源性较高
达 63% 以上, 具有高度的保守性, 为研究 PsbP 蛋
白家族的性质和进化具有重要的意义, 其N端氨基
酸序列保守性较差, 而 C 端氨基酸序列高度保守,
说明C端可能对维持OEE2蛋白的结构与功能起作
用。虽然, OEE2与光合作用相关(于勇等2001), 但
在二色补血草的根中也检测到它的表达, 并且其在
根中的表达可受 NaCl、PEG 和低温胁迫所抑制。
因此, 其在根中的作用值得进一步研究。
迄今对OEE家族基因在非生物胁迫情况下的
表达已有一些研究, 其中, OEE1 蛋白由 PSII 中的
OEE亚基和D1蛋白组成, 所以OEE1蛋白含量上升
可能会提高植物的光合效率(茹巧美等2006), 显示
OEE1 蛋白对维持 PSII的稳定和生物功能有作用。
盐胁迫直接影响植物的光合作用, 盐胁迫下, 植物
光合速率下降(王仁雷等 2002)。这些研究表明
OEE 基因家族成员可能参与了植物的抗逆胁迫。
我们的实时定量RT-PCR分析的结果也表明, OEE2
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图 3 9 个不同物种的 OEE2 氨基酸多序列比对
Fig.3 Amino acid multiple sequence alignments of OEE2 from nine different species
加号标记相同的氨基酸, 原点标记氨基酸的保守替换, 横线表示引进缺口。菠菜(Spinacia oleracea): P12302; 豌豆(Pisum sativum):
P16059; 拟南芥(Arabidopsis thaliana): NM_100545; 白芥子(Sinapis alba): P11594; 烟草(Nicotiana tabacum): Q7DM39; 马铃薯
(Solanum tuberosum): P93566; 二色补血草(Limonium bicolor): EU047509; 黄瓜(Cucumis sativus): Q9SLQ8; 喇叭水仙(Narcissus
pseudonarcissus): Q40407。
图 4 9 种植物 OEE2 家族蛋白的分子进化树
Fig.4 Phylogenetic tree of OEE2 family from nine plant species
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图 5 NaCl、低温和 PEG 胁迫下二色补血草
根和叶中 OEE2基因的表达
Fig.5 The expression patterns of OEE2 gene in leaves
and roots of L. bicolor in response to NaCl,
low temperature and PEG stress
NaCl、低温、PEG 处理分别为 0.2 mol·L-1 NaCl、3 ℃、20%
(W/V) PEG 胁迫时, OEE2 的表达量随时间变化而变化的相对量。
基因对 NaCl、低温和 PEG 胁迫有明显的应答反
应。其中, PEG和低温胁迫能诱导OEE2基因可在
叶中表达, 并在胁迫 48 h后OEE2的基因表达量达
到最高(图5), OEE2基因的诱导表达可能与二色补
血草适应这些胁迫相关。但在NaCl胁迫下, OEE2
基因的表达受抑制, 这提示盐胁迫下植物的光合作
用可能受抑, 以致OEE2基因表达下降。本文的结
果表明, 低温和旱胁迫过程中, OEE2 基因表达量
上升后, 植物的光合能力可能增强, 因而植物的抗
低温和抗旱能力增强。
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