全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 12 期，2009 年 12 月1186
收稿 2009-09-23 修定 　2009-11-09
资助 黑龙江省留学归国人员科学基金(LC08 C0 7)。
* 通讯作者(E-mail: junwang1966@yahoo.com.cn; Tel:
0 45 1-82 1 91 82 9)。
山葡萄中类黄酮 3’-羟化酶基因(F3’H) cDNA的克隆和分析
刘海峰 1,2, 杨成君 1, 赵权 1, 李波 1, 王军 1,*
1 东北林业大学林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室, 哈尔滨 150040; 2 延边大学农学院, 吉林龙井 133400
提要: 用RT-PCR和SMART RACE技术克隆了山葡萄F3’H基因的全长 cDNA序列。其GenBank 登陆号为FJ645766, F3’H
cDNA全长1 844 bp, 包括开放阅读框1 530 bp, 编码509个氨基酸, 该基因表达产物相对分子质量为56.14 kDa, 等电点为
8.24, 是不稳定蛋白。该基因属于 P450超基因家族, 不包含信号肽。氨基酸序列与欧亚种葡萄(AJ8803537)、矢车菊
(FJ753550)、金鱼草(DQ272592)、大豆(AB061212)和玉米(EU966228)等植物的F3’H氨基酸序列的同源性系数分别为98%、
77%、72%、74%和 57%。
关键词: 山葡萄; cDNA克隆; 类黄酮 3’-羟化酶
cDNA Cloning and Analysis of Flavonoid 3’-hydroxylase (F3’H) in Vitis
amurensis Rupr.
LIU Hai-Feng1,2, YANG Cheng-Jun1, ZHAO Quan1, LI Bo1, WANG Jun1,*
1Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement and Biotechnology, Ministry of Education, Northeast Forestry University,
Harbin 150040, China; 2Agricultural College, Yanbian University, Longjing, Jilin 133400, China
Abstract: The full-length cDNA sequences of F3’H genes in Vitis amurensis were cloned by the technique of
RT-PCR and SMART RACE. The landing Genbank No. is FJ645766 and the full-length of F3’H cDNA is 1 844
bp with open reading frame of 1 530 bp, which encodes 509 amino acids. The deduced amino acid of F3’H gene
was unstable protein with the molecular mass of 56.14 kDa and isoelectric point of 8.24. The F3’H gene
belongs to the P450 supergene family, without a signal peptide. The amino acid sequence of F3’H in Vitis
amurensis had the homology with F3’H of Vitis vinifera (AJ8803537), Centaurea cyanus (FJ753550), Antirrhi-
num majus (DQ272592), Glycine max (AB061212) and Zea mays (EU966228), and the homology coefficient
was 98%, 77%, 72%, 74% and 57% respectively.
Key words: Vitis amurensis; cDNA cloning; flavonoid 3’-hydroxylase
类黄酮 3’- 羟化酶(flavonoid 3’-hydroxylase,
F3’H)属于细胞色素P450单加氧酶, 具有催化多种
依赖 NADPH 或 NADH 的底物氧化反应的功能
(Buchanan 等 2004)。在葡萄花色苷的合成过程
中, 类黄酮 3’- 羟化酶分别将 4’,5,7- 三羟基黄烷酮
(naringenin)和二氢莰非醇(dihydrokaempferol)转化
成圣草酚(eriodictyol)和二氢槲皮素(dihydroqu-
ercetin)后形成不同的花色素。类黄酮 3’- 羟化酶
和类黄酮 3’5’- 羟化酶(flavonoid 3’5’-hydroxylase,
F3’5’H)之间比例也可能控制葡萄果皮中花色苷的
组成和果皮颜色(Jeong等2006; Castellarin等2007),
类黄酮3’-羟化酶是葡萄花色苷生物合成中的关键
酶之一。
山葡萄原产于我国东北和俄罗斯远东地区, 是
我国特有的种质资源, 其浆果含有大量的花色苷。
目前有关山葡萄分子生物学的研究较少, 有必要对
其花色苷生物合成途径中的关键酶进行研究。众
多的研究已分别从玉米、矢车菊、金鱼草、葡
萄等多种植物中分离鉴定了 F3’H, 但山葡萄中的
F3’H 的研究尚未见报道。本文采用 RT-PCR 和
SMART RACE 技术从山葡萄果皮克隆了 F3’H 的
cDNA全长序列, 同时对序列进行了生物信息学分
析, 为将来研究 F3’H 表达调控方式与花青素在果
皮中特异性合成和积累的关系, 从而在分子水平上
阐明山葡萄花青素高含量的原因和机制建立基础。
材料与方法
山葡萄品种 ‘ 双丰 ’(Vitis amurensis Rupr. cv.
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‘Shuang Feng’)采自中国农业科学院特产研究所
国家山葡萄种质资源圃。在果实成熟期采摘, 采后
立即置于液氮中冷冻, 于 −80 ℃冰箱中保存, 取果
皮为材料。实验所用大肠杆菌(Escherichia coli)
DH5-α、pMD18-T载体、胶回收试剂盒和Ex Taq
聚合酶购于 TaKaRa 公司; 反转录酶 SuperScriptⅡ
购于 Invitrogen公司; RACE试剂盒购于Clontech公
司。其它试剂为国产分析纯, DNA 测序由上海生
工生物公司完成。
山葡萄果皮总RNA提取采用改良的CTAB法
(Li 等 2006)。根据 GenBank 中已报道的 F3’H 基
因的核苷酸序列和氨基酸序列, 通过多序列比对确
定其共有的保守区, 利用 Primer 5.0 设计一对简并
引物 VAmF3’Hs: 5 CT(C/T)TT(C/A)Tg(C/T)gT(T/
G)CTCCT(C/T)TACC 3, VAmF3’Ha: 5 CA(C/T)(C/
T)gTCg(A/g)CA(T/C)TA(T/A)CCTT 3。采用
SuperScript II 反转录酶合成 cDNA, 利用简并引物
进行 PCR, 扩增目的基因片段。PCR 反应采用 50
μL 体系, 其中含 0.4 μL Taq DNA 聚合酶、1×Taq
缓冲液、5 mmol·L-1 MgCl2、200 μmol·L-1 dNTP、
60 ng 引物和 150~200 ng 模板 cDNA。扩增程序
为94 ℃预变性5 min; 94 ℃ 30 s, 57 ℃ 1 min, 72 ℃
2 min, 35 个循环; 最后 72 ℃延伸 7 min。对目的
基因片段进行纯化, 连接pMD18-T载体, 转化大肠
杆菌DH5-α感受态细胞, 蓝白斑筛选, 挑取阳性克
隆测序。
用 SMART™ RACE cDNA Amplification Kit方
法进行 RACE cDNA 扩增。根据保守区测序结果,
设计基因特异引物GSP1 (3-RACE引物) (5 gCCAT
ATCCgACAggAggAggTTg 3)和GSP2 (5-RACE引
物) (5 gggCgTTggTAgTACACACgTTCA 3), 两引
物之间有重叠。除 5-RACE 和 3-RACE 退火温度
分别为 63 ℃、65 ℃外, 反应体系、扩增程序、回
收和转化方法同前。测序后应用Vector NTI Suite
9.0 软件去除载体序列, 将 5 RACE 和 3 RACE 测
序结果拼接获得 cDNA 全长。
应用DNAStar软件对获得的F3’H全长cDNA
序列进行开放阅读框(ORF)分析并将其推导为相应
的氨基酸序列。蛋白质氨基酸相似性比对在NCBI
的 BlastP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastp)中分
析; 不同植物 F3’H 基因氨基酸序列的多序列比较
应用 ClustalW 1.82 (http://www.ch.embnet.org/soft-
ware/ClustalW.html)进行分析; 蛋白质的分子质量、
等电点及基本性质用 Protparam (http://au.expasy.
org/tools/protparam.html)预测; 信号肽分析利用
Signalp 3.0 Server 程序(http://www.cbs.dtu.dk/ser-
vices/Signalp), 疏水性分析和二级结构预测分别在
网站(http://us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)和
(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?
page=/NPSA/npsa_hnn.html)进行。
结果与讨论
1 RT-PCR合成山葡萄F3’H基因保守区的cDNA
改良的CTAB法提取山葡萄果皮中的总RNA,
RNA质量较高。以总RNA反转录合成的 cDNA为
模板, 用F3’H简并引物VAmF3’Hs和VAmF3’Ha进
行 PCR扩增, 获得了约 810 bp的特异片段, 与预期
片段大小相近。产物经连接转化, 筛选测序后获得
保守序列片段, 用NCBI/BLAST程序进行同源搜索,
结果与欧亚种葡萄(Vitis vinifera) F3’H的相似性为
98%。因此初步认定该片段为山葡萄F3’H基因的
片段 。
2 cDNA全长序列克隆及生物信息学分析
参照RACE试剂盒说明, 以逆转录分别合成的
5-RACE-Ready-cDNA和3-RACE-Ready-cDNA为
模板, GSP与UPM为引物, 分别进行 5 RACE和 3
RACE扩增, GSP1与UPM为引物扩增得到约1 314
bp的条带, GSP2与UPM为引物扩增得到约 556 bp
的条带。将 5 RACE 和 3 RACE 测序结果应用
Vector NTI Suite 9.0软件去除载体序列后拼接获得
cDNA全长。应用DNAStar和 Protparam程序对获
得的新基因全长 cDNA序列进行开放阅读框分析,
并将其推导为相应的氨基酸序列。结果显示, 该基
因全长 1 844 bp, 包括开放阅读框 1 530 bp、86 bp
5 非转译区(5 UTR)和 199 bp 的 3 非转译区(3
UTR), 起始密码子 ATG 位于 87~89 bp, 终止密码
子 TAG 位于 1 614~1 616 bp。基因的开放阅读框
编码 509 个氨基酸, 分子量为 56.14 kDa, 等电点为
8.24。负电荷残基(Asp+Glu)数为 51 个, 正电荷残
基(Arg+Lys)数为 54 个。不稳定系数为 35.43, 为
不稳定蛋白质。将该基因命名为 “ VAmF3’H” ,
GenBank 登录号为 FJ645766。
在蛋白保守区数据库(cons-erved domain data-
base, CDD), 用 NCBI的BlastP对山葡萄VAmF3’H
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进行蛋白保守区预测, 结果表明与该基因匹配的蛋
白保守区为细胞色素 P450超基因家族, 从第 29个
氨基酸到第 473 个氨基酸, 共匹配 445 个氨基酸。
用推导的氨基酸序列与蛋白质数据库进行同
源性比较, 其氨基酸序列与欧亚种葡萄(AJ 880
3 53 7)、矢车菊 (F J 7 53 55 0)、金鱼草( DQ 2 7
2592)、大豆(AB061212)和玉米(EU966228)等植物
的 F3’H 氨基酸序列的同源性系数分别为 98%、
77%、72%、74% 和 57%。多序列比对结果见
图1。
图 1 F3’H 氨基酸序列的多序列比对
Fig.1 Multiple alignment of deduced amino acid sequences of F3’H
F3’H 蛋白的 GenBank 登录号如下: 山葡萄(FJ645766)、欧亚种葡萄(AJ8803537)、矢车菊 (FJ753550)、金鱼草(DQ272592)、
大豆(AB061 212 )和玉米(EU966 228 )。下划线为 F3 ’H 保守域。
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起始于第 28 位的 “LPPGP” 序列是细胞色素
P450 的主要保守域, 是 F3’H 在微粒体膜上最佳定
位的枢纽, 连接膜的锚定位点和酶蛋白的球体部分,
在不同的物种中高度保守(Ya maza ki 等 19 93 ;
Murakami 等 1994)。起始于第 301 位的 “AGTDT”
序列也是高度保守序列, 该序列与底物的选择和结
合有关, 被认为促使形成氧分子的结合域(Chapple
1998; Kraus 和 Kutchan 1995)。起始于 437 位的
“FGAGRRICAG”是细胞色素酶类所必需的C端血
红素结合区, 这段序列受半胱氨酸的调节, 以其为
中心, 左右各氨基酸围绕半胱氨酸形成特定结构
(Chapple 1998), 在不同的物种中也是非常保守。
用MEGA 4 软件对该基因及其它植物的F3H
氨基酸序列进行多序列比对, 绘制分子进化树的结
果(图 2)表明, VAmF3’H 基因与欧亚种葡萄、山
竹、翠蝶花的 F3’H 基因在进化关系上较近, 与玉
米、高粱、洋葱、油草等亲源关系较远。
应用 SignalP 3.0 Server (www.cbs.dtu.dk/ser-
图 2 F3’H 构建的分子进化树
Fig.2 Molecular phylogenetic tree of the deduced amino acid sequences of F3’H
F3 ’H 蛋白的 G e n Ba n k 登陆号如下: 山葡萄( F J 6 4 5 7 6 6 )、欧亚种葡萄( A J 8 8 0 3 5 3 7 )、翠蝶花( A B 2 2 1 0 8 2 )、圆叶牵牛
(EU03 2 62 6)、三花龙胆(AB1 93 3 1 3)、金鱼草(DQ 27 2 59 2)、紫苏(AB04 5 59 3)、油菜(EU40 2 42 0)、大豆(AB06 1 21 2)、油草
(AB 4 8 0 6 9 1 )、洋葱(AY 5 4 1 0 3 5 )、高粱(D Q 7 8 7 8 5 6 )、玉米(EU 9 6 6 2 2 8 )、菊苣(FJ 7 5 3 5 4 8 )、山柳菊(D Q 3 1 9 8 6 6 )、非洲菊
(DQ 21841 7)、蓝眼菊(DQ 25071 1)、紫茎泽兰(EF13771 4)、矢车菊 (FJ75355 0)和山竹(FJ197 132 )。
vices/SignalP)和隐马氏模型(hidden markov models)
对山葡萄VAmF3’H 进行信号肽预测的结果表明, 该
基因不具有信号肽。蛋白质疏水性分析结果表明,
VAmF3’H 疏水性最大值为 2.722, 最小值为-2.100
疏水性平均值为 0.014, 不具有明显的亲、疏水性。
二级结构分析表明, VAmF3’H的二级结构主要以α-
螺旋和不规则盘绕为蛋白最大量的结构元件。
参考文献
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