全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (3): 303~309 303
收稿 2011-12-12　　修定 2012-01-20
资助 国家自然科学基金(31060148)、 新疆维吾尔自治区自然
科学基金(2011211A013)和新疆维吾尔自治区高技术研究
发展项目(201111120)。
* 通讯作者(E-mail: guanli@xju.edu.cn; Tel: 0991-8581106)。
甜瓜叶片中Rubisco的去除及双向电泳体系的优化
钟俐, 马成梅, 梁永增, 李冠*
新疆大学生命科学与技术学院, 乌鲁木齐830046
摘要: 为降低Rubisco的干扰, 建立适合于甜瓜叶片蛋白质的双向电泳技术, 本文比较了不同全蛋白提取方法和上样量对双
向电泳的影响。结果表明, Mg/NP-40/PEG3350/TCA/丙酮提取法可去除样品中绝大多数的Rubisco, 使低丰度蛋白得以检
测, 适合后续分析。以该法提取的蛋白, 采用600、800、1 000和l 200 μg四种上样量进行双向电泳, 上样量为l 000 μg的样
品用pH 3~10的IPG胶条, 在2-DE胶上分辨出质量好、数量多的蛋白质点(562个)。因此, Mg/NP-40/PEG3350/TCA/丙酮法
是适合甜瓜叶片蛋白质提取的方法, l 000 μg是最适上样量。
关键词: 甜瓜; Rubisco; 蛋白质提取; 双向电泳; 上样量
Depletion of Rubisco from Cucumis melon Leaf and Optimization of Two-Di-
mensional Electrophoresis for Proteome
ZHONG Li, MA Cheng-Mei, LIANG Yong-Zeng, LI Guan*
College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China
Abstract: This research compared the effects of different methods of protein extraction of Cucumis melon leaves
and different loading amounts on 2-DE profile. The results indicated that Mg/NP-40/PEG3350/TCA/acetone pre-
cipitation was a suitable method for subsequent analysis attributed to reducing the interference of Rubisco. There
were 562 proteins could be well resolved and detected in the gels when l 000 μg protein of leaves was loading
with pH 3-10 IPG strips. All the results showed that Mg/NP-40/PEG3350 TCA/acetone precipitation was much
more suitable for protein extraction and l 000 μg was the optimum loading amount of Cucumis melon leaves.
Key words: Cucumis melo L.; Rubisco; protein extraction; two-dimensional electrophoresis (2-DE); loading
quantity of sample
蛋白质双向电泳技术(two dimensional gel
electrophoresis, 2-DE)是研究差异蛋白质组学的重
要技术(O’ Faneli 1975)。该技术为在蛋白质水平
上研究和分析比较不同生理条件下生物体的蛋白
质表达提供了很好的平台。双向电泳技术与质谱
技术的结合, 能迅速地鉴定蛋白质及其蛋白表达
量的变化信息, 重复性好, 可信度高。这项技术自
创立以来, 在植物蛋白组学研究中得到了广泛应
用。 研究者运用蛋白质组学的相关技术和方法对
分离到的相关蛋白质进行了大量的鉴定工作, 发
现了许多与病害胁迫密切相关的蛋白质。玉米(李
冠军和付凤玲2006; Sauer等2006)、黄瓜(李凤玉
等2008) 、大豆(Xu等2008)、水稻(Kim等2011)等
植物的蛋白质双向电泳技术已有所报道。此外,
蛋白质组学技术还用于分析非生物因子胁迫下植
物的蛋白响应过程, 如低温(Patton等2007)、高温
(He和Huang 2007)、干旱(Iria等2010)、盐害(霍晨
敏等2004)等。
在植物蛋白质组双向电泳过程中, 某个组织
中如果存在一种或几种超高丰度的蛋白, 不仅会
掩盖一些低丰度蛋白的显示(Herman等2003), 还可
能在电泳过程中影响相邻蛋白的泳动 (Cho等
2008)。甜瓜为葫芦科(Cucurbitaceae)甜瓜属(Cu-
cumis)一年生草本植物。其叶片中Rubisco (1,5-二
磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶, ribulose-1,5-bisphos-
phate carboxylase/oxygenase)含量很高, 约占总蛋
白含量的40%~50%, 对双向电泳造成较大干扰。为
技术与方法 Techniques and Methods
植物生理学报304
了深入研究甜瓜抗病的分子机制, 从蛋白质组水
平上探索其蛋白质及基因的表达差异很有必要,
然而甜瓜蛋白质的双向电泳技术研究目前未见报
道。本研究以甜瓜幼苗叶片为材料, 对双向电泳
结果影响最大的全蛋白质的提取、Rubisco的去除
和上样量进行了优化, 不仅为甜瓜叶片蛋白组学
研究提供科学依据, 也为其他以Rubisco含量丰富
的绿色组织为材料的植物蛋白质的双向电泳技术
提供参考资料。
材料与方法
1 实验材料
供试品种为新疆甜瓜(Cucumis melo L.)主栽
品种伽师瓜(Cucurbitaceae melo var. saccharinus
Naud)。将甜瓜种子浸种催芽后, 播种于蛭石:珍珠
岩按3:1配制的基质的营养钵中, 在光照培养箱
内培养, 培养条件为温度 (25±2) ℃、光照强度为
2 500 μmol·m-2·s-1、光照周期为14 h·d-1, 每周浇一
次Hoagload培养液, 待幼苗长至四叶一心时, 选取
生长一致的甜瓜叶片, 进行全蛋白的提取。
2 试剂和仪器
硫脲、碘乙酰胺(IAA)、载体两性电解质
IPG-buffer、pH 3~10的干胶条、矿物油购于美国
GE公司; 尿素、二硫苏糖醇(DTT)、过硫酸铵
(AP)、TEMED、Tris-base为Sigma公司产品; 考马
斯亮蓝G-250、牛血清白蛋白(BSA)为Amresco公司
产品; 甲醇、磷酸、冰乙酸、甘油、TCA等试剂均
为国产分析纯。溶液的配制及稀释均为超纯水。
试验中用到的仪器如下, GE HealthCare公司
的IPGphor 3聚焦仪和二向电泳系统Ettan DALT
six、Bio-Rad Mini-3垂直电泳槽、Heraeus高速低
温离心机、Labtech UV1000紫外分光光度计、Mi-
crotec scanwizard蛋白扫描分析仪和Image master
7.0 Demo凝胶分析软件。
3 蛋白质干粉的制备
3.1 TCA/丙酮法
参考王海云等(2010)的方法, 略作改进。取
3.0 g甜瓜叶片液氮充分研磨后, 加入25 mL预冷的
10% TCA/丙酮溶液(w/v), –20℃静置过夜; 次日, 4
℃, 10 000×g离心30 min, 弃上清; 沉淀震荡悬浮于
预冷的丙酮溶液中; 静置1 h, 4 ℃, 9 500×g离心15
min, 弃上清, 重复2次; 沉淀用90%的冰浴丙酮溶液
(w/v)悬浮, 静置1 h, 4 ℃, 9 500×g离心15 min, 弃上
清, 沉淀低温冷冻干燥, 得蛋白质干粉, 置于–70 ℃
冰箱保存备用。
3.2 Tris-饱和酚法
参考Carpentier等(2005)、Coumans等(2009)
的方法, 略作改进。取3.0 g甜瓜叶片于液氮中研
磨至细粉状 , 悬浮于缓冲液[含50%苯酚、250
mmol·L-1 Tris-HCl (pH 8.6)、450 mmol·L-1 蔗糖、
50 mmol·L-1 EDTA、2 mmol·L-1 PMSF、2 mmol·L-1
DTT和100 mmol·L-1 KCl]中, 摇匀。静置15 min, 4
℃, 10 000×g离心30 min, 收集酚相。加入3倍体积
0.1 mol·L-1乙酸铵-甲醇溶液, 混匀, –20 ℃过夜, 4
℃, 12 000×g离心20 min, 沉淀用3倍体积0.1 mol·L-1
乙酸铵-甲醇溶液洗涤2次, –20 ℃预冷的90%丙酮
溶液洗2次, 沉淀于4 ℃冷冻干燥。蛋白质干粉–70
℃保存
3.3 磷酸缓冲液直接提取法
取l.0 g新鲜的甜瓜幼叶, 加少量(约10%)的水
不溶性PVP, 迅速用液氮研磨成粉状, 倒进装有预
冷的磷酸缓冲液(pH 7.0)的离心管中, 混匀, 冰浴15
min, 12 000×g离心15 min, 取上清用于蛋白电泳分
析或–70 ℃保存。
3.4 Mg/NP-40/PEG3350/TCA/丙酮提取法
参考Kim等(2001)的方法, 略作修改。取3.0 g
甜瓜叶片, 液氮充分研磨后加入预冷的10 mL Mg/
NP-40溶液[含0.5 mol·L-1 Tris-HCl (pH 8.8)、2% (v/v)
NP-40、1% (w/v) PVPP、20 mmol·L-1 MgCl2和2%
(v/v) β-巯基乙醇], 4 ℃提取2 h, 10 000×g离心20
min; 上清液中加入PEG3350, 使其终浓度为15%;
混匀, 冰上孵育30 min, 10 000×g离心20 min, 其中
上清中加入预冷的10% TCA/丙酮溶液, –20 ℃沉
淀过夜; 7 500×g离心15 min, 沉淀用预冷的丙酮[含
0.07% (v/v) β-巯基乙醇]悬浮, –20 ℃沉淀30 min;
8 000×g离心15 min, 重复3次, 直至上清无色, 用
90%丙酮[含0.07% (v/v) β-巯基乙醇]重新悬浮,
8 000×g离心20 min, 沉淀冷冻干燥后置于–70 ℃冰
箱保存备用。15% PEG3350分级沉淀中加入2 mL
裂解液35 ℃水浴裂解2 h, 10 000×g离心20 min, 上
清中加入预冷的10% TCA/丙酮, –20 ℃沉淀过夜;
6 000×g离心15 min, 沉淀用预冷的90%丙酮溶液
钟俐等: 甜瓜叶片中Rubisco的去除及双向电泳体系的优化 305
[含0.07% (v/v) β-巯基乙醇]悬浮, –20 ℃沉淀30
min; 8 500×g离心15 min, 弃上清; 沉淀冷冻干燥。
4 蛋白质的裂解及含量测定
将15% PEG3350上清与沉淀中分别提取到的
蛋白质干粉以1:25 (m/v)加入裂解液[含7 mol·L-1尿
素、2 mol·L-1硫脲、4% CHAPS、0.5% (v/v) IPG缓
冲液(pH 3~10)、100 mmol·L-1 DTT和痕量溴酚蓝],
35 ℃水浴2 h, 每隔0.5 h振荡混匀1次, 使样品充分
裂解, 20 ℃, 10 000×g离心5 min, 取上清, 用Brad-
ford法测定蛋白质含量, 标准蛋白为BSA。已知蛋
白含量的裂解液直接用于上样或–70 ℃保存。
5 样品的1-DE分析
采用非变性SDS-PAGE法, 电极缓冲液含0.1%
SDS, 0.384 mol·L-1的甘氨酸和0.05 mol·L-1 Tris-HCl
(pH 8.3); 化合聚合法制胶, 12.5%分离胶, 3%浓缩
胶, 浓缩胶电压为80 V, 分离胶电压为130 V。浓度
为1 000 μg·mL-1的样品每孔上样10 μL或20 μL, 电
泳至溴酚蓝标志至凝胶前沿为止。用含40% (v/v)
甲醇和10% (v/v)醋酸的固定液固定15 min, 蒸馏水
漂洗3次, 每次15 min, 考马斯亮蓝染液染色1.5 h,
蒸馏水脱色至背景无色。实验重复3次, Microtec
scanwizard扫描仪扫描照相。
6 样品的2-DE分析
第一向等电聚焦(IEF)采用18 cm, pH 3~10的
IPG胶条。分别吸取含600、800、1 000和1 200 μg
蛋白的样品溶液, 补足裂解液至350 μL, 移至水化
盘中, 将胶条胶面朝下放入样品水化液中, 20 ℃下
跑胶过夜。次日, 取出胶条, 胶面朝上置于聚焦盘
上, 覆盖矿物油, 置于IPGphor 3上, 聚焦条件为20
℃, 50 mA·胶-1, 电压和时间参数为: 500 V (Step 3
h)→1 000 V (Grad 1h)→2 000 V (Grad 1 h)→4 000
V (Grad 1 h) →10 000 V (Grad 1 h) →10 000 V
(Step 5 h)→500 V (Grad 1 h)→500 V (Step 10 h)。
第二向采用胶浓度为12.5%的SDS-PAGE, 等
电聚焦结束后, 迅速取出IPG胶条, 分别于10 mL含
100 mg DTT的平衡液I和10 mL含250 mg碘乙酰胺
的平衡液II [平衡液中含50 mmol·L-1 Tris-HCl (pH
8.8 )、6 mol·L-1尿素、30% (v/v)甘油、2% (w/v)
SDS及痕量溴酚蓝]中平衡15 min, 取出胶条, 用滤
纸小心吸去残余平衡液, 再用电极缓冲液[0.025
mol·L-1 Tris、0.192 mol·L-1甘氨酸、0.1% (w/v)
SDS , pH 8.3)]润洗1 s, 并转移至第二向SDS-PAGE
胶上, 放入Ettan DALT six电泳体系进行电泳, 先10
mA·胶-1, 电泳2 h, 之后改用30 mA·胶-1电泳, 溴酚
蓝前沿至凝胶底部边缘时停止电泳。胶体考马斯
亮蓝染色法染色。每处理重复做3块胶, Microtec
scanwizard蛋白扫描分析仪扫描凝胶图像; Image
Master 7.0软件分析凝胶图像。
实验结果
1 甜瓜叶片全蛋白质最佳提取方法
蛋白质样品的制备决定了双向电泳的分辨
率、重复性和图谱的清晰度。蛋白质提取过程中,
要去除影响蛋白质可溶性和双向电泳重复性的物
质(如核酸、脂类和多糖、盐类小分子)及高丰度
蛋白。本文比较了4种甜瓜叶片蛋白质干粉的制
备方法, 结果表明: 以TCA/丙酮法提取的蛋白质样
品中不能有效去除Rubisco, 其大亚基(large subunit
of Rubisco, LSR)和小亚基(small subunit of Rubis-
co, SSR)在1-DE胶(图1, 泳道1)上可见含量丰富, 尤
图1 甜瓜叶片4种提取方法的1-DE分析
Fig.1 1-DE analysis of melon leaf proteins
extracted with 4 methods
泳道1: TCA/丙酮法; 泳道2: Tris-饱和酚法; 泳道3: 磷酸缓冲
液法; 泳道4: NP-40/PEG3350/TCA/丙酮法。
植物生理学报306
以大亚基为多。双向电泳后得到的蛋白点约有
238个(图3-A), 分析蛋白质点数不多的原因是由于
在上样量一定的条件下, 含量过高的Rubisco使低
丰度蛋白在2-DE胶上未充分显现; 用Tris-饱和酚
法提取的蛋白质所得1-DE图谱条带少, 不能有效
去除Rubisco的大亚基(图1, 泳道2), 2-DE电泳图谱
的蛋白点也较少, 且有明显的拖尾现象(图3-B); 磷
酸缓冲液提取法步骤简单, 成本低, 但蛋白提取得
率偏低, 1-DE图谱蛋白条带少(图1, 泳道3), 双向电
泳等电聚焦时电压上升波动大, 2-DE图谱纵横条
纹多, 干扰大, 蛋白形状不规则且蛋白质点少(图
3-C), 提取效果差。而采用Mg/NP-40/PEG3350预
处理, 然后用TCA/丙酮沉淀法提取的甜瓜叶片蛋
白质经1-DE (图1, 泳道4)和2-DE (图2; 图3-D)可
知: 包括Rubisco的大小亚基在内的3种高丰度蛋白
及极少量的其他蛋白质分布于PEG3350的沉淀中,
绝大多数蛋白质分布于PEG3350的上清液中, 因此
采用Mg/NP-40/PEG3350预处理法使得中低丰度蛋
图2 PEG3350分级提取时在沉淀中提取到的
甜瓜叶片蛋白质的2-DE图谱
Fig.2 2-DE analysis of melon leaf proteins fractionated in the
precipitation of PEG3350
pH 3~10, 18 cm胶条, 上样量为1 000 μg。
图3 甜瓜叶片蛋白质不同提取方法的2-DE图谱分析
Fig.3 2-DE analysis of melon leaf proteins extracted with 4 methods
A: TCA丙酮法; B: Tris-饱和酚法; C: 磷酸缓冲液法; D: Mg/NP-40/PEG3350/TCA/丙酮法。pH 3~10, 18 cm胶条, 上样量均为1 000 μg。
白得以检测, 经2-DE检测到蛋白质点约549个。
选择pH范围合适的IPG胶条对双向电泳的结
钟俐等: 甜瓜叶片中Rubisco的去除及双向电泳体系的优化 307
果影响较大。本研究中甜瓜叶片中的大部分蛋白
质分布在pH 3~10范围内。因此 , 可以选择pH
3~10, 18 cm的IPG 胶条。
2 甜瓜叶片2-DE蛋白质上样量的确定
图4显示, 上样量对双向电泳图谱分辨率有明
显的影响: 当甜瓜叶片蛋白质的上样量为600 μg
时, 蛋白质点虽然无拖尾现象, 但2-DE图谱上只检
出了约100个蛋白质点, 低丰度蛋白数量很少(图
4-A), 上样量为800 μg蛋白检出率与上样量为600
μg的2-DE结果没有明显区别(图4-B), 当蛋白质上
样量为1 000 μg时, 蛋白质点数量多(562个), 形态
好, 呈圆点型, 边界清晰且在胶面上分布均匀, 几
乎无纵向与横向拖尾, 检出的低丰度蛋白质的数
量明显增加(图4-C), 有利于后续的鉴定分析; 而当
蛋白质上样量增加到1 200 μg时, 蛋白质点数虽有
一定增多, 但是由于样品中蛋白含量、杂质及盐
离子浓度的增加, IEF过程中电压上升缓慢, 部分高
丰度蛋白在电泳过程中影响其周围的蛋白质, 使
得一些分子量或等电点相近的蛋白质无法有效分
开(图4-D)。因此, 甜瓜叶片蛋白质上样量为1 000
μg时, 双向电泳图谱效果较好, 过高或过低的上样
量不利于获得高质量的电泳图谱。
讨　　论
蛋白质是生命活动的执行者, 因此可以从细
胞或个体中蛋白质变化的角度解释或阐明生命活
动的基本规律。大多数组织中的大部分蛋白都能
通过2-DE技术得以分离, 除非是含量极低的调节
蛋白或信号分子蛋白(Gorg等2004)。蛋白组学的
限制因子之一是缺乏有效的方法使含量很少的基
因产物得以显示, 究其原因主要在于较低的样品
承载量, 虽然现在有了商品化的IPG胶条, 也只是
在一定程度上缓解了这个问题。样品的提取是
2-DE的关键步骤, 蛋白与非蛋白成分的种类与数
图4 甜瓜叶片蛋白质2-DE上样量分析
Fig.4 2-DE analysis with different proteins loading quantity
蛋白质上样量如下, A: 600 μg; B: 800 μg; C: 1 000 μg; D: 1 200 μg。pH 3~10, 18 cm胶条。
植物生理学报308
量因材料来源的不同而有很大区别(Hille等2001;
Shaw和 Riederer 2003), 因此全蛋白的提取方法也
必须针对材料的特性加以选择和优化。目前应用
于双向电泳的植物全蛋白质提取方法主要有 :
TCA/丙酮沉淀法、Tris-饱和酚法、Trizol沉淀
法、Tris-丙酮-酚法、尿素-硫脲提取法等等, 不论
采用何种方法, 最根本的目的是去除样品中的非
蛋白组分, 获得高纯度、无干扰杂质和尽可能多
的蛋白质(Xie等2007)。
Tris-饱和酚缓冲液提取时蛋白组分在酚相,
核酸在水相, 使蛋白与核酸得以分离, 该法的优点
是能将蛋白水解最小化, 利于膜蛋白的提取, 去除
2-DE过程中干扰IEF的非蛋白组分; 缺点是提取过
程复杂, 步骤多, 导致蛋白样品在制备过程中容易
损失, 所得蛋白量少, 不利于后续分析; 用Tris-饱和
酚法以绿色植物为材料提取蛋白样品时, Rubisco
大亚基含量高, 样品溶解不充分。TCA/丙酮法比
Tris-饱和酚法步骤简单, 能很好地抑制蛋白酶的活
性, 其缺点和Tris-饱和酚法一样, 提取效率低, 不能
有效去除Rubisco, 在IEF上样缓冲液中的溶解性
差。Rubisco大量存在于植物细胞的叶绿体中(Feller
等2008), 对低丰度表达蛋白具有明显的掩盖效应,
而某些低丰度蛋白往往具有重要功能。Kim等
(2001)通过实验证明具有调控功能的信号转导因
子, 如Gα、水稻ADP糖基化因子(ADP-ribosylation
factor, ARF)、GTP连接蛋白等低丰度蛋白均在
15% PEG4000的上清液中, 14-3-3蛋白则分布于
20% PEG4000的沉淀中。Kim等(2001)还发现在
2-DE之前用PEG4000分级提取还有一个优点: 即
相同质量的样品的蛋白质点数量是TCA/丙酮法所
得样品中蛋白点数量的2.7倍, 即PEG法有助于富
集低丰度蛋白。本试验采取Mg/NP-40预分离法可
以提高蛋白质的溶解性, 然后用15%的PEG3350分
级沉淀, 使甜瓜叶片中大部分的Rubisco留在沉淀
中, 而样品中其他蛋白, 尤其是低丰度蛋白主要处
于上清液中, 然后用TCA/丙酮沉淀, 制得的蛋白质
样品取得了较好的2-DE效果, 在后续研究中, 我们
用该体系对接种白粉病前后的甜瓜叶片进行了蛋
白组学分析, 经质谱分析筛选到多个与甜瓜抗病
性相关的差异蛋白, 进一步的分析鉴定及功能验
证实验还在进行中。因此本试验建立的甜瓜叶片
蛋白质双向电泳体系能够满足后续试验中筛选与
甜瓜抗病性相关的信号转导因子及病程相关蛋白
的需要。
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