全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (11): 1675~1682　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0351 1675
收稿 2014-08-05　　修定 2014-09-29
资助 国家科技支撑计划项目(2012BAD01B0503)和国家自然科
学基金(31270697)。
* 通讯作者(E-mail: yaguangzhan@126.com; Tel: 0451-82191752)。
水曲柳节律基因LHY启动子的克隆和功能分析
王璇2, 曾凡锁1,2, 詹亚光1,2,*, 何之龙2
东北林业大学1林木遗传育种国家重点实验室, 2生命科学学院, 哈尔滨150040
摘要: 以水曲柳基因组DNA为模板, 用SiteFinding-PCR法扩增得到节律基因LHY (late elongated hypocotyl)启动子序列, 长度
为1 360 bp。PLACE启动子预测工具分析表明, 序列中含有转录必备的TATA box、CAAT box以及一些非生物胁迫和激素
响应元件等。构建植物GFP瞬时表达载体pPXGFP-P-LHY, 农杆菌介导转化烟草叶片和白桦悬浮细胞, GFP检测结果表明,
LHY启动子能够启动GFP基因在烟草和白桦细胞中表达, 且对非生物胁迫(低温、高温、盐)产生响应; 构建植物GUS报告
基因整合表达载体pPCXGUS-P-LHY, 农杆菌介导法瞬时转化烟草, GUS染色结果表明, LHY启动子的活性具有不同程度的
时空特性。
关键词: LHY; 启动子; 克隆; 瞬时表达
Cloning and Functional Analysis of the Circadian Gene LHY Promoter in
Fraxinus mandshurica
WANG Xuan2, ZENG Fan-Suo1,2, ZHAN Ya-Guang1,2,*, HE Zhi-Long2
1State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, 2College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract: The LHY promoter fragment (1 360 bp) was isolated and identified from the genomic DNA
of Fraxinus mandshurica using the method of SiteFinding-PCR. Promoter sequence was analysed by PLACE,
and the result showed that this fragment contained TATA box and CAAT box, as well as some elements which
can respond to abiotic stress and hormones. Plant transient expression vector with report gene GFP (named as
pPXGFP-P-LHY) was constructed, and then was transformed into Nicotiana tabacum leaves and Betula
platyphylla cells through the Agrobacterium infection process. The result showed that the promoter of LHY could
activate the expression of GFP gene in N. tabacum leaves and B. platyphylla cells, and this activation could
respond to abiotic stress, such as cold, heat and salinity. Furthermore, another plant expression vector with report
gene GUS (named as pPCXGUS-P-LHY) was constructed too, and after transformation to N. tabacum leaves by
Agrobacterium infection, the activity of LHY promoter showed different in stem and leaf vain tissue.
Key words: LHY; promoter; cloning; transient expression
生物钟节律基因(简称节律基因)是一类新型
的功能基因(转录因子), 其作用是产生和调控生物
昼夜节律的运转(Yakir等2006)。对模式生物拟南
芥的研究表明: LHY (late elongated hypocotyl)、
TOC1 (timing of CAB expression 1)、CCA1 (circa-
dian clock associated 1)相互作用, 在其昼夜节律的
维持中起着至关重要的作用, 其中TOC1启动子中
的相关蛋白结合域是其时钟调控的关键(Pokhilko
等2012; Yerushalmi等2011)。由于节律基因还能够
识别胁迫信号通路基因上游的调控元件并且能够
调控植物对非生物胁迫作出响应, 这类基因对于
植物逆境胁迫的研究具有巨大潜力。在拟南芥中,
三分之二的上调表达基因都和节律基因相关(Mas
2008; Mizuno和Yamashino 2008)。蓝藻是目前发
现的最简单的具有内源性生物钟节律的生物, 在
蓝藻的许多生理过程中都表现出了一定的生物节
律性(Hotta等2007)。节律基因可能在植物的各种
生理活动中起着不可替代的作用, 如: 氨基酸吸收
过程、固氮过程、植物代谢、淀粉合成等一些生
理活动中(Strayer等2000; Harmer等2000; McClung
2006)。节律基因可能是控制它们的“大开关”。如
果能清楚的了解节律基因在植物各种生理活动中
所起的作用, 那么对于控制植物的生理活动将会
有一个大的突破。启动子是植物基因表达与调控
植物生理学报1676
的重要顺式作用元件, 在转录水平上参与下游相
应基因的表达, 对启动子的克隆以及功能研究, 对
植物基因表达调控机制的研究有重要意义。
植物基因启动子克隆的方法很多, 如: 反向
PCR (inverse PCR)、锚定PCR (anchored PCR)、T
接头PCR (T-linker PCR)、交错式热不对称PCR
(thermal asymmetric interlaced PCR)等(刘晓庆等
2011; 杨予涛等2003)。本研究采用SiteFinding-
PCR法, 虽然此方法发明时间并不长, 但是和以上
方法相比较, SiteFinding-PCR法具有简单、快捷、
敏感、有效、能够适应多种植物且成功率较高的
优点(Tan等2005)。
有关节律基因的研究都是以模式生物拟南芥
等为研究对象展开的, 在树木中有关节律基因的
报道很少。本研究是以水曲柳节律基因LHY启动
子为研究对象, 克隆了LHY启动子, 对其序列特征
及潜在的调控元件进行分析, 并构建表达载体以
研究其相关功能。
材料与方法
1 植物材料
水曲柳(Fraxinus mandshurica Rupr.)栽植于东
北林业大学白桦强化种子园; 烟草(Nicotiana ta-
bacum L.)种子接种于MS培养基培育组培苗备用,
白桦(Betula platyphylla Suk.)愈伤组织置于B5液体
培养基(含0.6 mg·L-1 TDZ和0.2 mg·L-1 6-BA)培育
白桦悬浮细胞备用。白桦悬浮细胞和烟草组培苗
均培育于组培室(25 ℃、光照时间为16 h·d-1、光
强20~40 µmol·m-2·s-1、湿度60%)。
2 菌株和质粒
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) LBA-
4404菌株、pPXGFP-P植物瞬时表达载体和pPCX-
GUS-P植物表达载体为本实验室保存, 大肠杆菌
(Escherichia coli) JM109、pMD18-T载体购自大连
宝生物公司。
3 酶和化学试剂
PstI、XmaI、XcmI等限制性内切酶均购买自
NEB公司, LA Taq聚合酶、rTaq聚合酶、T4 DNA
连接酶、RNase A、DNA Marker等购买自大连宝
生物公司, DNA胶回收试剂盒购买自上海生工。
4 水曲柳LHY基因启动子的克隆和生物信息学分析
以水曲柳幼嫩叶片为试验材料, 用CTAB法提
取其基因组DNA (李金璐等2013; 詹亚光和曾凡锁
2005), 以其为模板, 运用SiteFinding-PCR法进行
PCR扩增。首先在LHY基因编码区5′端设计3轮巢
式引物(表1、图1-B); 其次20 µL PCR反应体系(2
µL 10×LA PCR Buffer、2 µL dNTP、2 µL Site-
Finder引物、2 µL水曲柳基因组DNA、0.2 µL LA
Taq、12.8 µL ddH2O)经25 ℃低温退火, 68 ℃延伸
(此过程缓慢升温), 使SiteFinder引物锚定于目标
DNA启动子区未知序列的某一位置, 原始DNA其
中一条链被由SiteFinder引物新扩增出来的单链所
取代; 最后以SiteFinder引物扩增出的双链DNA为
巢式PCR第一轮模板, 接下来每一轮PCR扩增均以
上一轮PCR扩增产物(稀释100~500倍)为模板, 在
20 µL PCR扩增体系(2 µL 10×LA PCR Buffer、2
µL dNTP、2 µL LHY1~3、2 µL SFP1、2、DNA模
板、0.2 µL LA Taq、9.8 µL ddH2O)和PCR扩增条
件(94 ℃预变性3 min; 94 ℃ 45 s, 55 ℃ 45 s, 72 ℃
5 min扩增32个循环; 72 ℃延伸10 min)下经3轮巢
式PCR扩增即可扩增出未知双链DNA序列(图
1-B)。多轮巢式PCR扩增条带间的差异与多轮巢
式引物间距(图1)一致的条带即可初步确定为目的
条带。本研究用3轮巢式引物同时验证扩增结果
减少了假阳性的概率, 增加了旁侧序列克隆的成
表1 引物序列
Table 1 The PCR prime sequences
引物名称 引物序列(5′→3′)
LHY1 GTGCATGGGCCCTACCTTAATTTAT
LHY2 AATCAATTCACTTGTTCATCTCGCT
LHY3 ATGGGAGTTTCAGCAGGTGA
SFP1 CACGACACGCTACTCAACAC
SFP2 ACTCAACACACCACCTCGCACAGC
SiteFinder cacgacacgctactcaacacaccacctcgcacagcgtcctcaagcggccgcnnnnnngcct

王璇等: 水曲柳节律基因LHY启动子的克隆和功能分析 1677
功率(Tan等2005; 郑岑等2009; 罗丽娟和施季森
2003)。PCR产物回收、纯化后连入pMD18-T载
体, 送至北京华大基因测序。
5 LHY启动子表达体系的构建
5.1 LHY启动子pPXGFP-P植物瞬时表达载体的
构建
根据NCBI上查找到的植物瞬时表达载体
pPXGFP-P的序列构建其质粒图谱, 并对其分析。
经分析选取PstI和XmaI进行双酶切实验。根据已
经获得的启动子序列, 设计加入酶切位点和保护
碱基的上游引物5′-tccccccgggCAAAATTATA-
CAATTTCTTTTTAA-3′, 下游引物5′-aaaactgcag-
GTTGTGACTTGAACTGAATGA-3′, 扩增目的片
段。首先在37 ℃条件下分别对pPXGFP-P和LHY
启动子进行双酶切4 h, 回收酶切后的pPXGFP-P和
LHY启动子, 然后在16 ℃ 6 h条件下用T4 DNA连接
酶连接, 经转化、阳性克隆筛选等获得重组的植
物瞬时表达载体。
5.2 LHY启动子pPCXGUS-P植物表达载体的构建
根据NCBI上查找到的植物表达载体pPCX-
GUS-P序列构建其质粒图谱, 并对其分析。经分析
选取了XcmI进行单酶切实验。根据已经获得的启
动子序列, 运用Primer5.0设计特异性上游引物:
5′-ATCTCCAACCCATCCTTTACA-3′, 下游引物:
5′-CAGATCCACCGTTTCCCAAT-3′。利用LA Taq
扩增启动子后使其带有A尾 , XcmI酶切pPCX-
GUS-P后使其酶切位点带有T尾这一特性, 回收扩
增的LHY启动子和酶切后的pPCXGUS-P, 16 ℃过
夜条件下用T4 DNA连接酶连接, 经转化、阳性克
隆筛选等获得重组的植物表达载体。
6 农杆菌介导下LHY启动子的表达
6.1 表达载体导入农杆菌
活化农杆菌LBA4404, 用三亲杂交法(徐威等
2003)将表达载体导入农杆菌。在含利福平(rifam-
picin, Rif) 30 mg·L-1、氨苄青霉素(ampicillin, Amp)/
卡那霉素(kanamycin, Kan) 50 mg·L-1的YEB培养基
上筛选阳性克隆。
6.2 LHY启动子在烟草中的瞬时表达
烟草种子脱毒(75%的乙醇浸泡90 s, 用ddH2O
冲洗3~5次, 置于3%次氯酸钠浸泡3~5 min, 用
ddH2O冲洗3~5次, 置于灭菌滤纸上吸干)后立即接
种于MS培养基, 置于组培室培养, 待长出3~4片叶
片时可用于侵染。
将50 mL工程菌液6 000 g·min-1室温离心5
min, 除上清, 将沉淀悬浮于200 µmol·L-1的AS渗透
培养液中(OD600=0.8), 将制备好的渗透液喷洒于烟
草叶片上, 置于MS培养基26 ℃组培室培养(光照
时间16 h·d-1) 2 d, 取出叶片, 撕取叶表皮制成临时
装片, 置于荧光显微镜下观察实验结果。
6.3 在非生物胁迫下LHY启动子在白桦细胞中的瞬
时表达
将工程菌(OD600=0.8)置于B5液体培养基(含0.6
mg·L-1 TDZ和0.2 mg·L-1 6-BA)中制备终浓度100
mg·L-1培养液, 将生长良好的白桦悬浮细胞置于其
中, 放置在26 ℃组培室(光照时间16 h·d-1) 150
r·min-1摇床上侵染24 h, 分装4份, 1份对照(组培室
培养), 另外3份分别进行低温(4 ℃)、高温(37 ℃)
和NaCl (400 mmol·L-1)胁迫处理2 h; 对照及每个处
理均重复3次。制成临时装片, 置于荧光显微镜下
观察实验结果。
6.4 LHY启动子在烟草中的表达活性分析
取长出3~4叶的整株烟草浸泡于制备好的工
程菌(OD600=0.8)中, 在26 ℃组培室(光照时间16
h·d-1)分别培养1、2、3 d (对照组和实验组均重复3
次)。取出烟草放入GUS检测液中(Jefferson等1987),
置于37 ℃培养箱中染色24 h, 75%乙醇脱色后观察
实验结果。
实验结果
1 节律基因LHY启动子克隆
以水曲柳基因组DNA为模板, 运用SiteFinding-
PCR法, 进行SiteFinder引物锚定; 以SiteFinder锚定
PCR产物为模板, 以SFP1和LHY1为引物进行第1轮
扩增, 扩增结果如图1-A中泳道1所示; 接下来每一
轮PCR扩增均将上一轮PCR扩增产物稀释100倍做
为模板, 以SFP2和LHY2为引物进行第2轮扩增, 扩
增结果如图1-A中泳道2所示; 以SFP2和LHY3为引
物进行第3轮扩增, 扩增结果如图1-A中泳道3所
示。泳道1、2中箭头所示条带大小差异和引物
LHY1、LHY2间距(图1-B)一致, 泳道2、3中箭头所
示条带大小差异和引物LHY2、LHY3间距(图1-B)
一致, 因此图1-A中箭头所指的PCR扩增产物可以
植物生理学报1678
初步确定为LHY启动子片段, 回收三轮PCR扩增产
物, 连入pMD18-T载体, 经转化、阳性克隆筛选、
测序获取其序列。测序得到的序列经NCBI同源比
对和PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)在
线分析、预测确定其为LHY启动子片段。以测序
得到的LHY启动子片段为模板设计多轮巢式引物,
继续巢式PCR扩增, 共克隆LHY启动子1 360 bp。
2 节律基因LHY启动子顺式作用元件的鉴定及分析
经PLACE在线分析、预测水曲柳LHY基因启
动子元件。分析结果表明, LHY基因启动子中含有
重要的转录必备RNA聚合酶结合位点TATA box、
CAAT box以及一些压力响应元件(如抗旱响应元
件)和激素响应元件(如赤霉素、茉莉酸等的调控
元件), 此外, 还有和节律相关的Circadian元件、光
响应元件(AE-box、BOX1、GAG-motif、LAMP-
element等) (表2), 对这些元件的研究可以更准确的
揭示LHY启动子在水曲柳生物节律中所扮演的
角色。
表2 LHY基因启动子顺式作用元件分析
Table 2 Analysis of LHY promoter cis-acting elements
顺式调控元件 基序序列 生物学功能
5′UTR Py-rich Streteh TTTCTCTCTCTCTC 赋予高转录水平的顺式作用元件
AE-box AGAAACAT 光响应元件
ARE AAACCA 厌氧感应不可少的顺式作用元件
BOX4 ATTAAT 参与光反应的保守DNA模块
BOX1 GTCCATCTAACCTACCAC 光响应元件
BOXIII atCATTTTCACt 蛋白结合位点
CAAT-box CCAAT 启动子增强区常见顺式作用元件
CAT-box GCCACT 与分生组织表达相关的顺式元件
CCAAT-box CAACgg 具有MYBHv1约束力元件
CGTCA-motif CGTCA 参与茉莉酸反应顺式作用元件
G-Box CACGTG 光反应的顺式作用元件
G-box CACGTA 光反应顺式作用元件
GAG-motif AGAGAGT 光响应元件
GARE-motif AAACAGA 赤霉素响应元件
GCN4-motif TGAGTCA 参与胚乳表达的顺式作用元件
GT1-motif GGTTAAT 光响应元件
LAMP-element ACAGAATCTTATCC 光响应元件
MBS CAACTG 参与抗旱诱发的MYB结合位点
P-box CCTTatg 赤霉素响应元件
SKn-1-motif GTCAt 胚乳表达所需的顺式作用元件
TATA-box TATAAATT 核心启动子转录起始元素
TCCC-motif TCTCCtt 光响应元件
Unnamed-1 catgtCACGTGccaactg CG-1因子结合位的
Unnamed-4 agaaatgCCACGTGGacgaatac GBF3因子结合位点
TGACG-motif TCTCctt 参与茉莉酸反应的顺式作用元件
Circadian CAAAGATATC 参与生物钟调控的顺式作用元件

图1 水曲柳LHY基因启动子PCR扩增电泳和引物结合位点简图
Fig.1 PCR products of the promoter of the ashtree LHY gene and sketch map of primers
A: PCR扩增电泳。M: DL2000 Marker; 泳道1、2、3中箭头所指分别为1、2、3轮巢式PCR扩增产物。B: 引物结合位点简图。
LHY1、LHY2、LHY3箭头所指为3轮巢式PCR引物序列, 引物LHY1与LHY2、LHY2与LHY3的间距分别为230和90 bp, 上划线下的序列为
SiteFinder引物(箭头上方对应的序列为SFP1和SFP2引物序列)。
王璇等: 水曲柳节律基因LHY启动子的克隆和功能分析 1679
3 pPXGFP-P和pPCXGUS-P植物表达载体的构建
与鉴定
图2-A、B中显示出pPXGFP-P、pPCXGUS-P
酶切前后的差异, 初步断定它们线性化成功。T4
DNA连接酶连接后的启动子和表达载体, 构建成
功的植物表达载体分别命名为pPXGFP-P-LHY
(抗Amp)和pPCXGUS-P-LHY (抗Kan)。连接产
物转化至JM109大肠杆菌感受态细胞中, 37 ℃
暗培养24 h, 挑取单菌落分别接种在含有Amp/
Kan (50 mg·L-1)的LB液体培养基中, 37 ℃培养6~
8 h, 碱裂解法提取质粒, 以质粒为模板进行PCR
扩增, 检测结果如图2-C所示, 连入pPXGFP-P和
连入pPCXGUS-P的启动子序列长度和预期结果
一致。
4 瞬时GFP活性检测
瞬时表达载体pPXGFP-P中含有GFP报告基
因, 在荧光显微镜下用蓝光激发可观察到绿色荧
光。图3显示, 在低倍镜下, 被pPXGFP-P-LHY工程
菌侵染的烟草叶片, 用蓝光激发可以明显观察到
绿色荧光, 而对照烟草叶片用蓝光激发则完全观
察不到绿色荧光。由此说明重组入瞬时表达载体
pPXGFP-P-LHY中的启动子LHY启动了表达, 具有
图2 pPXGFP-P与pPCXGUS-P重组质粒验证
Fig.2 Verification of recombinant pPXGFP-P and pPCXGUS-P
A: pPXGFP-P酶切验证。M: DL5000 Marker, 3: 质粒pPXGFP-P酶切前; 4: 质粒pPXGFP-P酶切后。B: pPCXGUS-P酶切验证。M:
DL5000 Marker; 1、2分别为质粒pPCXGUS-P酶切前、后。C: PCR扩增验证。M: DL2000 Marker; 1: pPCXGUS-P-LHY农杆菌菌液PCR产
物; 2: pPXGFP-P-LHY农杆菌菌液PCR产物; 3: LHY启动子大肠杆菌菌液PCR扩增产物。
启动活性。这对研究上游调控元件的表达机制提
供了方法和可能。
对照(图4-A)显示, 在荧光显微镜下用蓝光激
发可观察到白桦细胞发出微弱的自发荧光, 而被
pPXGFP-P-LHY农杆菌侵染后的白桦细胞在蓝光
激发下则发出明显的绿色荧光(图4-B), 说明重组
入表达载体pPXGFP-P-LHY中的启动子LHY启动
了表达。在非生物胁迫下, 启动子仍可启动表达,
但是表达水平总体呈现降低趋势, 从荧光的明亮
程度看, 与对照相比较, 在低温(图4-C)和高温(图
4-D)胁迫下表达水平显著降低, 且高温胁迫降低趋
势更加明显; 在盐(图4-E)胁迫下表达水平相对升
高了。对水曲柳节律基因LHY启动子元件分析显
示其包含CAAT-box元件(响应高温胁迫), G-box广
泛响应各种非生物胁迫(如低温、盐胁迫等), 可能
上/下调LHY启动子活性, 这可能和LHY启动子中的
相关保守元件的互作和对外源信号的响应相关。
5 GUS酶活性分析及组织特异性
为了检测整株烟草中GUS报告基因的表达。
pPCXGUS-P空载体转入整株烟草中经GUS染色显
示, 烟草未呈现蓝色(图5-A), 说明在烟草中pPCX-
图3 荧光显微镜下烟草叶片的GFP检测
Fig.3 GFP test of N. tabacum leafs under fluorescence
microscope
A: pPXGFP-P-LHY农杆菌侵染后的烟草叶片; B: pPXGFP-P
空载农杆菌侵染后的烟草叶片(对照)。
植物生理学报1680
GUS-P空载体中GUS报告基因没有表达。pPCX-
GUS-P-LHY工程农杆菌侵染整株烟草1 d后, 经
GUS染色显示, 烟草茎、叶脉中可观察到少许蓝色
(图5-B); pPCXGUS-P-LHY工程农杆菌侵染整株烟
草2 d后, 经GUS染色显示, 烟草茎中可观察到大面
图4 荧光显微镜下白桦细胞的GFP检测
Fig.4 GFP test of B. platyphylla cells under fluorescence microscope
A~E: 蓝光激发下的白桦细胞; F~J: 自然光下的白桦细胞; A、F: pPXGFP-P空载农杆菌侵染(对照); B、G: pPXGFP-P-LHY农杆菌侵
染; C、H: pPXGFP-P-LHY农杆菌侵染后又经低温处理; D、I: pPXGFP-P-LHY农杆菌侵染后又经高温处理; E、J: pPXGFP-P-LHY农杆菌
侵染后又经NaCl处理。
积蓝色、叶脉中可观察到少许蓝色(图5-C); pPCX-
GUS-P-LHY工程农杆菌侵染烟草3 d后, 经GUS染
色显示, 烟草茎、叶脉中可观察到大面积蓝色, 根
中少许蓝色(图5-D); 由此说明, LHY基因启动子具
有组织特异性, 在茎和叶脉中具有强启动活性。
图5 pPCXGUS-P-LHY在烟草中瞬时表达的GUS染色
Fig.5 pPCXGUS-P-LHY transient expression in N. tabacum by GUS histochemical staining
A为pPCXGUS-P空载侵染烟草(对照); B、C、D分别为pPCXGUS-P-LHY工程农杆菌侵染1、2、3 d GUS染色后的烟草。
王璇等: 水曲柳节律基因LHY启动子的克隆和功能分析 1681
讨　　论
本研究用SiteFinding-PCR法分离水曲柳LHY
启动子, 该方法是根据已知序列设计多个嵌套的
特异性引物进行巢式PCR, 特异地扩增基因组旁侧
未知序列的PCR法。SiteFinding-PCR方法的关键
就是SiteFinder引物的3′端GCCT寡核苷酸能否在
较低的退火温度下和基因组DNA完成退火。可以
根据不同的植物适当的调整SiteFinder引物的3′端
寡核苷酸的组成和数量(Terauchi和Kahl 2000; 方
进等2001), 因而此方法可用于扩增多种植物的旁
侧未知序列。本研究运用SiteFinding-PCR法分离
得到了水曲柳节律基因LHY基因上游1 360 bp启动
子调控序列。
研究表明 , 在光调控启动子中包含一些如
G-box、GT1-motif等光诱导必需元件, 被称为光响
应元件。GT1-motif元件在光响应启动子中的位
置、数量等影响着植物的生物钟节律(Maruyama等
2012)。对LHY启动子序列进行生物信息学分析, 预
测其重要顺式作用元件, 发现LHY启动子序列含有
多个光响应元件, 如G-box、GT1-motif、LAMP-el-
ement等, 2个茉莉酸响应元件TGACG-motif, 1个赤
霉素响应元件P-box, 1个胚乳表达调控元件SKn-1-
motif, 1个厌氧诱导元件ARE。说明水曲柳节律基
因LHY可能是与逆境胁迫有关的启动子。这对水
曲柳抗逆性的研究有重要意义。通过DNA重组技
术融合了GFP和GUS报告基因, 实现了LHY启动子
在烟草和白桦悬浮细胞中的瞬时表达。对烟草、
白桦悬浮细胞的GFP和GUS检测揭示LHY启动子
可激活GFP和GUS报告基因的表达, 说明其具有启
动活性。对拟南芥启动子的研究表明, CCAAT-
box元件响应高温胁迫, 报告基因GUS活性检测显
示下调表达, 本研究图4-D结果与其一致; G-box元
件响应多种非生物胁迫(低温、盐胁迫等), 该元件
需要其他元件如ABRE、CE3等互作才能实现报告
基因上/下调表达(Chow等2012; Sibéril等2001; Ya-
maguchi-Shinozaki和Shinozaki 2005)。水曲柳LHY
启动子中各个元件的互作以及这些元件能否促进/
抑制基因的转录效率, 元件调控启动子活性的机
制都有待进一步研究。
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