全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 8期，2009年 8月 807
收稿 2009-05-12 修定 　2009-06-12
资助 河南省重点科技攻关项目(0 223 013 100 )。
* 通讯作者(E-mail: qliyou@henau.edu.cn; Tel: 0371-
6 3 5 5 5 1 7 5 )。
检测双孢蘑菇培养料中微量 1- 氨基环丙烷 -1- 羧酸(ACC)的离子色谱法
周巍巍, 黄涛, 高玉千, 戚元成, 申进文, 邱立友 *
河南农业大学生命科学学院, 郑州 450002
Ion Chromatography for Determination of Trace Amount 1-Aminocyclopropane-
1-Carboxylic Acid (ACC) in Mushroom
ZHOU Wei-Wei, HUANG Tao, GAO Yu-Qian, QI Yuan-Cheng, SHEN Jin-Wen, QIU Li-You*
College of Life Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
提要: 建立了一种快速简便直接检测双孢蘑菇培养料中微量 1-氨基环丙烷 -1-羧酸(ACC)含量的离子色谱法。此法使用
Dionex ICS-3000 离子色谱仪与AminoPac PA-10 离子交换柱, 以0.25 mol·L-1 NaOH、1.00 mol·L-1 NaAc和水作为洗脱液进行
梯度洗脱, 流速 0.25 mL·min-1, 柱温 30 ℃, 进样量25 μL。在此条件下, 信噪比为 3时, ACC的保留时间为9.284 min, 最低检
测限是0.0330 μg·mL-1, 标准曲线线性符合系数为0.9990, 线性范围在0.10~2.00 μg·mL-1。三个加标水平下的回收率分别为
106.00%、91.71% 和 96.08%。该方法可用于检测双孢蘑菇培养料中的ACC含量, 检测结果为 3.6620 μg·g-1 (FW)。此法也
适用于其他食用菌和土壤微生物的研究。
关键词: 离子色谱法; 1-氨基环丙烷 -1-羧酸; 双孢蘑菇培养料
1-氨基环丙烷 -1-羧酸(1-aminocyclopropane-
1-carboxylic acid, ACC)是高等植物合成乙烯的直
接前体。已发现有很多微生物(包括细菌、放线
菌、霉菌和酵母菌)能产生乙烯, 但一般认为其乙
烯合成途径与高等植物不同, 不是由甲硫氨酸经
ACC途径, 而是由甲硫氨酸经2-酮 -4-甲基硫代丁
酸(2-keto-4-methylthiobutyric acid, KMBA)途径或
由谷氨酸经2-酮戊二酸途径(Fukuda等 1993)进行
的。但越来越多的证据表明, 微生物中也具有和高
等植物相同的乙烯合成途径(Coleman和 Hodges
1986)。土壤微生物能够利用ACC为碳源或氮源
并产生乙烯(Frankenberger和 Phelan 1985)。与添
加L-甲硫氨酸、KMBA和碳化钙(CaC2)相比, ACC
是土壤微生物合成乙烯的最有效底物(Khalid等
2006)。草地早熟禾(Poa pratensis)的病原菌小麦根
腐病菌(Bipolaris sorokiniana)具有由甲硫氨酸合成
乙烯的 2条途径(Coleman和 Hodges 1986)。双孢
蘑菇和香菇(Lentinula edodes)均能在灭菌的培养料
中生长并产生乙烯(Wood和 Hammond 1977; Ohga
1998), 但这2种担子菌是通过哪种途径合成乙烯还
不清楚。因此, 定量测定培养基和菌体中的 ACC
含量可有助于确定微生物是否具有由甲硫氨酸经
ACC合成乙烯的途径。
植物根际促生菌ACC脱氨酶产生菌应用于植
物生产可以有效地增强植物的抗逆性和提高产量,
这已经过ACC脱氨酶缺失突变株、转基因植株和
大田试验证实(Glick等 1994; Li等 2000; Arshad等
2007)。但迄今在植物根际土壤和植物组织中还没
有直接的ACC含量变化的证据。植物和微生物合
成的ACC并非全部用于生成乙烯(Yang和Hoffman
1984; Jia等 2000)。此外, 由于离体的组织会大量
合成乙烯以响应损伤和干燥, 所以植物组织中乙烯
含量的测定是相当困难的(Smets等 2003)。因此
在研究乙烯的生物合成途径、影响ACC生成乙烯
的因素、ACC脱氨酶产生菌对植物乙烯合成的影
响以及乙烯对微生物和植物生长发育的影响时, 定
量测定 ACC含量十分必要。
测定ACC含量的方法有多种, 可分为间接法
和直接法二类。间接法将ACC转化为乙烯或是将
ACC衍生化后，再用气相色谱仪(Boller等 1979)、
毛细管电泳(Smets等 2003)、液相色谱与气相色
谱联用(Hall等 1989)等进行测定。直接检测ACC
的方法有毛细管电泳(Kazmierczak和Kazmierczak
2007)和高效液相色谱-电喷雾/串联质谱(Petritis等
2000; 马莹莹等 2008)等。间接法测定ACC的结果
技术与方法 Techniques and Methods
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往往偏低, 而直接法所用的提取方法繁琐、样品需
用量大, 不便于大量样品的同时测定或设备复杂。
为此本文建立了可以直接测定双孢蘑菇培养料中微
量 ACC含量的方法。
材料与方法
1 仪器与试剂
Dionex ICS-3000离子色谱仪(美国Dionex公
司), AminoPac PA-10离子交换柱, 在线脱气装置四
元梯度泵, 自动进样器 25 μL定量环, ED50电化学
检测器。
分析纯NaOH (美国Sigma公司)、色谱纯甲醇
(德国Merck公司) 和ACC标准品(美国Sigma公司),
MCX 固相萃取小柱(60 mg·3 mL-1, 美国Waters公司)。
2 ACC标准溶液的配制
准确称取0.5000 g ACC 标样溶解在超纯水中,
定容至 50 mL, 再逐级稀释, 分别配成 2.00、1.00、
0.75、0.50、0.25、0.10和 0 μg·mL-1共 7个浓
度标品。
3 双孢蘑菇培养料中ACC的提取和预纯化
参考 Jia等(2000)和马莹莹等(2008)文中的方
法并作修改。双孢蘑菇(Agaricus bisporus)2796菌
株培养料过 20目筛后准确称取 1 g, 用液氮反复冻
融并研磨, 以10 mL超纯水超声提取30 min, 8 000×g
离心 20 min, 取上清液并调 pH至 4.0, 用 20 mL氯
仿洗涤一次, 取水相, 过MCX固相萃取小柱。分
别用 2 mL甲醇和 1 mL超纯水洗柱, 最后用 1 mL 1
mol·L-1氨水(溶剂为甲醇)洗脱, 收集并用氮气吹干,
超纯水定容于 1 mL离心管中, 上机前用 0.22 μm
的滤头过滤, 以流动相复溶后用离子色谱仪检测。
4 色谱条件
0.25 mol·L-1 NaOH、1.00 mol·L-1 NaAc和水
作为洗脱液进行梯度洗脱, 梯度淋洗条件见表 1。
柱温 30 ℃, 进样量 25 μL, 信噪比 3。检测方式为
积分脉冲安培检测。实验数据的采集和处理均由
Chromeleon 6.80色谱工作站控制。
表 1 分离 1-氨基环丙烷 -1-羧酸的梯度淋洗程序
时间 /min 水 /% 0.25 mol·L-1 NaOH /% 1.00 mol·L-1 NaAc /% 梯度曲线类型
0.0 7 6 2 4 0
2.0 7 6 2 4 0 1
8.0 6 4 3 6 0 8
11.0 6 4 3 6 0 8
18.0 4 0 2 0 4 0 8
21.0 4 4 1 6 4 0 5
23.0 1 4 1 6 7 0 8
42.0 1 4 1 6 7 0 8
42.1 2 0 8 0 0 5
44.1 2 0 8 0 0 5
44.2 7 6 2 4 0 5
60.0 7 6 2 4 0 5
实验结果
1 流动相流速的选择
流动相流速对检测灵敏度和分离效果均有影
响。流速低时, 检测灵敏度高, 分离效果好, 但分
离时间较长; 流速高时, 分离时间缩短, 检测灵敏度
和分离效果有所降低。改变流速条件发现, 选择流
速为 0.25 mL·min-1时, ACC 标准样的保留时间为
9.284 min (图 1)。
2 标准曲线的绘制和最低检测限
用Surveyor 自动进样器将7个浓度的ACC 标
样分别进样25 μL, 每个浓度重复3次, 在信噪比为
3时ACC保留时间为 9.284 min, 仪器对ACC的最
低检测限是 0.0330 μg·mL-1。用仪器所带的专业软
件计算得到色谱峰的峰面积, 绘制进样浓度与峰面
积标准曲线(图 2)。标准曲线的线性回归方程为
y=18.051x+0.1352, 线性符合系数为 0.9990, 达到极
显著水平(P<0.01), 线性范围在 0.10~2.00 μg·mL-1,
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在此范围内可以根据该曲线对样品中的ACC 进行
定量分析。
3 标准样品的回收率
样品处理前分别加入相当于样品中ACC含量
的 50%、25%和 10%的标准样品, 重复 3次, 分
别进行ACC提取和预纯化后的ACC含量测定, 计
算标准样品的回收率, 三个水平标准样品的回收率
分别是 106.00%、91.71% 和 96.08% (表 2)。
4 双孢蘑菇培养料中ACC含量的测定
从图3可见, ACC峰与其它杂质能够很好地分
开, 测得峰面积值后, 从标准曲线中查出ACC浓度,
计算后得到培养料中的ACC含量为 3.6620 μg·g-1
( FW )。
图 1 ACC标准溶液的离子色谱图
图 2 ACC标准曲线
进样量为 25 μL。
表 2 双孢蘑菇培养料中添加 3个水平ACC
标准样品的回收率(n=3)
加标量 /μg 回收量 /μg 回收率 /%
0.1250 0.1325 106.00
0.0625 0.0573 91.71
0.0250 0.0240 96.08
图 3 测定双孢蘑菇培养料中ACC的色谱图
讨　　论
采用离子色谱法直接测定双孢蘑菇培养料中
的ACC含量与其它间接法和直接法测定的ACC相
比, 样品用量少, 前处理简便, 杂质干扰小, 适用于
食用菌和土壤微生物的研究。
自 1975年离子色谱问世以来, 在生物科学研
究中这一技术已广泛用于生物可电解物质、糖
类、维生素、抗生素、蛋白质、多肽和氨基酸
等的分析检测(李云燕2005), 但用于ACC的检测尚
未见报道。ACC是非蛋白质组分氨基酸, 易溶于
水, 在碱性介质中以羟基阴离子状态存在, 因此可
采用离子色谱法进行检测。此外, 从双孢蘑菇培养
料中提取纯化ACC时, 选用氯仿萃取、MCX阳离
子交换柱提取纯化和室温下加压氮气吹干的方法,
可有效提高ACC的提取效率, 减少离子色谱时的杂
峰数(马莹莹等 2008)。将样品用液氮冻融 2~3次,
有利于破坏菌体细胞壁结构, 提高ACC的提取率和
检出率。
双孢蘑菇在菌丝生长和出菇阶段均合成较高
浓度的乙烯, 尤其是出菇阶段的乙烯合成量常是爆
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发性的增加, 乙烯的合成与覆土无关(Turner 等
1975; Wood和Hammond 1977)。本文应用离子色
谱法从双孢蘑菇培养料中检测出较高含量的ACC
[3.6620 μg·g-1 (FW)], 显著高于覆土(未发表资料),
因此认为, 双孢蘑菇可能存在高等植物中的由甲硫
氨酸经 ACC合成乙烯的途径。
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