全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (11): 1117~1120 1117
生物分子相互作用分析法测定甜菜组织中的钙调素
陈贵华1, 张少英1,*, 赵军锋2
1内蒙古农业大学农学院, 呼和浩特010019; 2河北师范大学生物科学学院, 石家庄050000
摘要: 以甜菜为实验材料, 经甜菜坏死黄脉病毒(beet necrotic yellow vein virus, BNYVV)侵染后, 用生物分子相互作用分析
(biomolecular interaction analysis, BIA)技术测定植物组织中钙调素(calmodulin, CaM)含量, 分析在BNYVV侵染下植物组织
中CaM的变化。该方法可以实时检测生物分子之间的相互作用, 受杂质影响小, 可简化样品的前处理, 能够快速高通量分
析大量的蛋白质样品, 灵敏度高, 准确性好。
关键词: 分子相互作用; CaM; 甜菜
Determination of Calmodulin in Beta vulgaris L. Tissues by Biomolecular In-
teraction Analysis
CHEN Gui-Hua1, ZHANG Shao-Ying1,*, ZHAO Jun-Feng2
1College of Agronomy, Inner Mongolia Agriculture University, Hohhot 010019, China; 2School of Life Sciences, Hebei Normal
University, Shijiazhuang 050000, China
Abstract: The sugar beet (Beta vulgaris) were used as experimental material. The calmodulin content and its
changes in tissues were determined by biomolecular interaction analysis (BIA) technology after infected by
beet necrotic yellow vein virus (BNYVV). The technology can detect the real-time interaction between mole-
cules, less affected by impurity, simplify sample pre-treatment, and analysis a large number of high-throughput
protein rapidly. The technology is high sensitivity and good accuracy.
Key words: molecular interactions; CaM; sugar beet (Beta vulgaris)
测定植物组织中钙调素(calmodulin, CaM)的
含量对于研究Ca2+-CaM系统如何调控植物细胞代
谢具有重要的意义(Snedden和Fromm 2001)。目前
CaM含量的测定方法有酶法、酶联免疫法和放射
免疫法。其中酶法的灵敏度不高, 而酶联免疫法
和放射免疫法虽灵敏度较高, 但其受杂质影响较
大, 结果重复性差, 精确度不高(黄号栋等2003; 叶
正华等1990)。生物分子相互作用分析(biomolecu-
lar interaction analysis, BIA)技术是基于一种表面
等离子共振的物理光学现象的生物传感技术, 不
必使用荧光标记和同位素标记, 保持了生物分子
的天然活性, 可以实时灵敏动态地检测生物分子
的相互作用, 能够快速高通量定量分析大量的蛋
白质样品, 灵敏度高, 准确性高(高志贤2004)。
甜菜丛根病是由甜菜坏死黄脉病毒(beet ne-
crotic yellow vein virus, BNYVV)引起的, 本研究以
甜菜为试验材料, 用BIA技术测定在BNYVV感染
下组织中CaM含量, 得到更为精确的CaM含量变
化情况。
材料与方法
1 材料
用BNYVV分别摩擦接种侵染甜菜(Beta vul-
garis L.)抗病品种‘内甜抗201’和感病品种‘包育
202’幼苗, 置于智能培养箱中, 在27 ℃、湿度70%、
30 µmol·m-2·s-1光照条件下培养, 在0、2、3、4、5
和6 d分别取甜菜叶片, 测定CaM的含量。
2 CaM含量的测定
2.1 BIA技术原理
生物分子相互作用分析(BIA)技术是基于一
种表面等离子共振(surface plasma resonance, SPR)
的物理光学现象的生物传感技术。当一束平面单
技术与方法 Technique and Method
收稿 2011-07-15　　修定 2011-10-19
资助 国家自然科学基金“甜菜抗丛根病信号转导与调控机制的
研究”(30760125)和现代农业产业技术体系建设专项资金
(CARS-03-04)。
* 通讯作者(E-mail: syzh36@yahoo.com.cn; Tel: 0471-
4309027)。
植物生理学报1118
色偏振光在一定的角度范围内照射到镀在玻璃表
面的金属银或金的薄膜上发生全反射时, 入射光
的波向量与金属膜内表面电子(称为等离子体)的
振荡频率相匹配时, 光线既被耦和进入金属膜, 引
起电子发生共振, 即表面等离子体共振。此时光
线提供的能量导致金属膜表面电子发生共振, 电
子吸收该能量使被反射光的强度达到最小, 这种
最小化发生时的入射光角度称为SPR。SPR是随
金属表面的折射率的变化而变化, 这一变化(reso-
nance units, RU)又和金属表面结合的生物分子质
量成正比。
2.2 仪器与试剂
仪器有BIAcore 2000分子相互作用仪、CM5
芯片(瑞典Pharmacia Biosensor AB公司)、MilliQ II
型纯水系统、Labofuge 400R型冷冻离心机(德国
Heraeus公司)。
CaM标准品和CaM抗体为Sigma公司产品、氨
基偶联试剂盒(Pharmacia Biosensor AB公司)的主要
成分为碳二亚胺盐酸盐[1-ehyl-3-(3-dimethy-
laminopropyl)-car-bodimide,EDC]、N-羟基磺基琥
酰亚胺(N-hydroxysuccinimide, NHS)和乙醇胺(Eth-
anolamine)溶液。
流动相缓冲液HBS (pH 7.4) (Pharmacia Bio-
sensor AB公司), 主要成分为10 mmol·L-1的4-(2-羟
基)哌嗪-1-乙基磺酸[4-(2-hydroxyethyl)piperazine-
lethane-sulfonic acid, HEPES]、150 mmol·L-1的
NaCl、3.4 mmol·L-1的EDTA、0.005% (V/V)的表面
活化剂P20, 50 mmol·L
-1 NaOH为再生缓冲液。
2.3 CaM的提取与测定
取甜菜叶片0.5 g, 加5 mL样品提取液(150
mmol·L-1 NaCl、2 mmol·L-1 EGTA、50 mmol·L-1
Tris-HCl、1 mmol·L-1巯基乙醇、0.25 mmol·L-1
PMSF和20 mmol·L-1 NaHCO3, pH 7.4), 于4 ℃下充分
研磨, 至于5 mL离心管中, 95 ℃水浴3 min, 10 000×g
离心45 min, 上清液即为CaM粗提液。
分别用pH 4.0、pH 4.5、pH 5.0和pH 5.5的醋
酸钠稀释抗体至10~50 µg·mL-1, 流过芯片表面, 找
出最适pH值。用最适pH值的醋酸钠稀释抗体到30
µg·mL-1, 用EDC、NHS活化CM5芯片后, 使稀释好
的样品流过芯片表面, 达到目标RU值后, 用乙醇胺
封闭。封闭芯片第三道作为对照; 等样品流过芯
片表面结合稳定后, 用50 mmol·L-1 NaOH再生缓冲
液把样品从芯片上洗脱下来, 以便再次利用, 找出
最适再生条件; 把CaM标准品用流动相缓冲液稀
释5个以上浓度, 分别与芯片表面的抗体结合, 获
得标准液传感图(图1)及标准曲线(图2)。把待测样
品分别流过芯片(每过1个样品, 再生1次), 稳定后
得到相应RU值, RU值越大结合能力越强。结果用
Blaevaluation软件分析数据, 得到相应的结果。
以上所用试剂及样品需脱气并过0.22 µm滤
膜处理。
结果与讨论
1 在BNYVV浸染下甜菜叶片CaM传感图
从传感图(图3和4)可见, 在BNYVV侵染不同
时期, 甜菜‘内甜抗201’的CaM结合情况差异较
大, 在第4天其结合量达到峰值。而甜菜‘包育202’
在侵染的不同时期其CaM结合的量较低, 差异不
显著。
图1 植物CaM标准液传感图
Fig.1 Kinetic curves of the standard CaM
图2 CaM标准曲线
Fig.2 Standard curve of CaM
陈贵华等: 生物分子相互作用分析法测定甜菜组织中的钙调素 1119
图3 在BNYVV侵染下甜菜‘内甜抗201’CaM传感图
Fig.3 Kinetic curves of CaM in sugar beet ‘Neitiankang 201’ after infected by BNYVV
绿色、蓝色、紫色、灰色、淡绿色、淡蓝色、淡紫色曲线从上至下依次为BNYVV侵染4、5、6、3、2、1、0 d, 下图同此。
图4 在BNYVV侵染下甜菜 ‘包育202’CaM传感图
Fig.4 Kinetic curves of CaM in sugar beet ‘Baoyu 202’ after infected by BNYVV
2 BNYVV浸染对甜菜抗病、感病品种CaM含量
的影响
由结果(图5和6)可见, BNYVV侵染后, 甜菜感
病品种‘包育202’的CaM含量很低, 在第4天达到峰
值, 变化幅度不大。而抗病品种‘内甜抗201’ CaM
含量较高 , 在侵染后第4天 , CaM含量达到峰值
[128.86 µg·g-1 (FW)], 随后CaM含量略微下降, 其下
降的速度较慢, 并且CaM含量峰值在甜菜叶片病斑
出现之前。
植物组织中CaM含量较低 , 分离纯度高的
CaM难度较大(郑海金等1994), 目前大多采用酶联
免疫方法测定CaM含量, 此方法影响因素较多, 结
果重复性差。BIA技术受杂质的影响较低, 蛋白质
芯片的结合特异性高、亲和力强, 因此对生物样
品的要求较低, 可以简化样品的前处理, 只须对样
本进行沉降分离后即可加于芯片上进行分析和检
测。对于等电点3~7之间的蛋白质均可采用BIA技
术进行分析, BIA技术能高通量分析大量的蛋白质
样品, 检测器能跟踪检测待测液中的分子与芯片
表面分子结合和解离的整个过程(高志贤2004), 与
传统的酶联免疫方法相比, BIA技术使用相对简
单, 灵敏度高, 准确性好。采用BIA技术, 我们测定
植物生理学报1120
了在BNYVV侵染下甜菜细胞中CaM含量的变化,
使用BIA技术能实时灵敏动态地检测分子间的相
互作用, 且无需使用标记样品, 从而保持了生物分子
的活性, 测定结果重复性好, 结果更加稳定可靠。
参考文献
高志贤(2004). 蛋白芯片技术研究进展及其应用. 现代仪器, (3):
1~5
黄号栋, 杨静, 龚明(2003). 用磷酸二酯酶定量检测植物钙调素方法
的改进. 植物生理学通讯, 39 (2): 156~160
叶正华, 郭季芳, 孙大业(1990). 应用磷酸二酯酶定量测定植物钙调
素. 植物生理学通讯, (1): 54~56
郑海金, 胡建成, 陈鑫阳(1994). 植物钙调素的分离纯化及其特性研
究. 兰州大学学报(自然科学版), 30 (3): 97~101
Snedden WA, Fromm H (2001). Calmodulin as a versatile calcium
signal transducer in plants. New Phytol, 151 (1): 35~36
图5 BNYVV对甜菜‘包育202’ CaM含量的影响
Fig.5 Effects of BNYVV on CaM content in
sugar beet ‘Baoyu 202’
图6 BNYVV对甜菜‘内甜抗201’ CaM含量的影响
Fig.6 Effects of BNYVV on CaM content in
sugar beet ‘Neitiankang 201’