全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 9期，2009年 9月896
收稿 2009-07-27 修定 　2009-08-24
资助 国家重点基础研究发展计划项目(2 005CB12 1106 )。
致谢 沈允钢老师和陈根云博士及其研究组内同事、研究生
关于本文的批评、建议和讨论。
* 通讯作者(E-mail: dqxu@sippe.ac.cn; Tel: 021-54924231)。
叶绿素含量的测定及其应用中的几个问题
许大全 *
中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所, 上海 200032
Several Problems in Measurement and Application of Chlorophyll Content
XU Da-Quan*
Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai
200032, China
提要: 本文讨论了叶绿素含量测定及应用中比较普遍存在的几个问题, 指出按叶片鲜重计量叶绿素含量的弊端和按叶面积
计量的好处。
关键词: 叶绿素含量; 光合速率; 叶片鲜重; 叶面积
叶绿素是绿色植物体内的基本色素, 在光合作
用的光能吸收、传递和转化中起不可或缺的作
用。因此, 在植物生理学特别是光合作用研究中,
经常涉及叶绿素含量的测定。虽然这只是相关研
究中一个最基本、最简单的测定, 但其中需要注意
的问题却不少。从大量已经发表的文章和未发表
的文稿中发现, 这些问题相当普遍, 很有必要提出
来讨论, 以便引起有关测定者的注意。
1 按叶片鲜重计量叶绿素含量
除了藻类细胞和针叶植物以外, 在文献中常见
的叶绿素含量单位有两种: 一是以单位叶面积表示
的, 二是以单位叶片鲜重表示的。比较起来, 还是
以单位叶面积表示的较为合理、适用, 因为它不受
叶片含水量变化的干扰, 而且也便于与以单位叶面
积表示的光合速率联系起来分析两者关系。以单
位叶片鲜重表示的叶绿素含量尤其不适用于不同生
长光强、不同供水条件下生长的植物材料。在以
单位叶面积表示的叶绿素含量相同时, 如果以单位
叶片鲜重表示, 含水量高的叶片叶绿素含量值会低
于那些含水量低的叶片。在水分胁迫条件下, 这种
偏差尤其大。遗憾的是, 许多人没有意识到这个问
题, 总是通过称鲜重取样提取和测定叶绿素含量。
也许他们以为这样做简便。其实, 准确称量一定重
量的叶片绝对不比取一定面积的叶片来得快。
同样道理, 叶片内其他物质例如淀粉、氨基
酸和蛋白质等的含量也以单位面积表示为好。如
果以单位叶片鲜重表示, 不仅会受叶片含水量不同
的干扰, 而且会缩小该物质含量变化的幅度, 因为
计算时分母(叶片鲜重)内包含该物质的重量。以
单位叶片干重表示, 虽然避免了叶片含水量变化的
干扰, 可是在其他组分含量不变的情况下也因为计
算时分母(叶片干重)内包含该物质重量而缩小该物
质含量变化的幅度。
2 提取步骤繁琐
不少实验教材(例如, 中国科学院上海植物生理
研究所和上海市植物生理学会 1999; 侯福林 2004;
滕利荣和孟庆繁 2008; 李玲 1999, 2009)介绍的方
法都包括叶片称重、研磨、冲洗、过滤和定容
及稀释等繁琐步骤。定容的体积至少 10 mL, 既
费时间, 又浪费溶剂, 也不适于科学研究中大批量
样品的测定。
其实, 用确知面积的模板或打孔器切取 1 cm2
左右叶片, 切成细丝(大约 5 mm × 1 mm)后投入含
5 mL 80%丙酮的试管中(避光、密封)过夜, 即可
完全提取(叶片细丝变成白色), 从而避免上述那些
繁琐步骤。
当然, 如果希望大大缩短提取时间, 也可以用
小型的试管匀浆器研磨总面积为 1 cm2的叶片细
丝。不过, 这样就要增加研磨、冲洗和离心(用滤
技术与方法 Techniques and Methods
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纸过滤会损失一些色素, 导致偏低的测定结果, 因
此最好以离心代替过滤)等步骤。
3 结果远离正常范围
除了氮肥缺乏、缺少叶绿素的突变体、患失
绿症或叶片衰老等特殊情况外, 绝大多数叶片的叶
绿素含量都在 4~6 mg·dm-2 或 400~600 mg·m-2的范
围内(Berry和Downton 1982; 许大全和薛德林1985;
Chen等 2005)。如果测定结果远离这个范围, 就要
核查是否在测定或计算中出现了错误。
健康而尚未衰老的阳生植物叶片的叶绿素a/b
比值通常为3左右, 阴生植物叶片的该比值会低一
些, 而缺乏叶绿素b的突变体的该比值可能会大于
10 (Xu等 1993)。最近有人报告, 10种树木叶片的
叶绿素 a/b比值在 1.6~2.3之间(任芳菲等 2009), 明
显偏低。与此相类似的是, 对钾利用能力不同的 2
个基因型水稻在钾缺乏和正常供钾条件下叶片的叶
绿素 a/b比都为 0.5左右(Jia等 2008), 太低, 不可
信。可能是分光光度计精度不够, 或者测定或计算
方法有问题。所以, 在对样品的叶绿素提取液进行
比色测定时, 应该选用对测定光波长分辨率高的分
光光度计, 这对于叶绿素 a/b比值的测定至为重
要。另外, 用于比色测定的叶绿素提取液的浓度过
高, 也会导致叶绿素a/b比值的明显降低(陈根云等,
未发表资料)。
在这里还需顺便指出, 有人报告水曲柳和樟子
松的表观光合量子效率分别高达 0.83和 0.26 (任
芳菲等 2009), 是理论值 0.125 (许大全 2007)的几
倍, 令人难以置信。除非改写人们早已熟知的光合
作用机制, 否则光合效率不可能那么高。看来, 如
果缺乏必要的基础知识, 就不会知道所测结果是否
正确, 也难以对结果作出恰当的分析。
4 在叶绿素含量不同的情况下仍按单位叶绿素计
量光合活性和仍按等量叶绿素确定样品用量
在细胞、原生质体、叶绿体及类囊体等的光
合功能研究中, 常常用单位叶绿素或单位时间的氧
释放量表示光合活性; 在通过电泳分析有关蛋白的
种类与数量变化时, 也常常用叶绿素计量上样量。
在一般情况下, 这样做无可非议。但是, 如果在相
互比较的样品中涉及叶绿素含量的变化, 例如涉及
叶绿素含量明显降低的突变体或涉及因某种(或某
些)处理引起叶绿素含量减少的情况, 这样做就会造
成叶绿素含量少的样品光合活性高于叶绿素含量高
的样品的假象; 若按等量叶绿素上样, 会掩盖叶绿
素含量少的突变体某些蛋白含量比野生型少的真
相, 甚至造成比野生型多的假象。在这种情况下,
用来自同样叶面积的样品上样是合理的选择(Chen
和Xu 2006)。当然, 藻类细胞和松类植物的针叶
例外, 需要另想合适的方法。
5 片面理解叶绿素含量与光合速率的关系
有些人根据叶绿素是光合作用必不可少的色
素的常识, 想当然地认为叶片光合速率与叶绿素含
量总是呈正相关, 于是作出叶绿素含量高(或低)导
致高(或低)光合速率或叶绿素含量高时光合速率就
高的结论。其实, 仅仅在弱光下, 光合速率会随叶
绿素含量的增加而增高, 存在良好的线性关系, 而
在饱和光下光合速率往往与叶绿素含量的多少无
关。例如, 在有限光下, 叶绿素含量仅为野生型三
分之一左右的水稻黄绿叶突变体叶片的光合速率明
显低于其野生型, 而在饱和光下, 两者的光合速率
一样(Chen和 Xu 2006)。这是因为过量的光可以
补偿叶绿素不足对光合作用的不利影响。另外, 在
饱和光下, 那些叶绿素含量低的阳生叶片光合速率
往往明显高于叶绿素含量高的阴生叶片, 这是因为
阳生叶片单位面积内光合机构的关键组分反应中
心、电子传递体和碳同化酶等含量高(Anderson等
1988)的缘故。
6 文献引用不当
绝大多数叶绿素含量测定所依据的都是Arnon
(1949)的方法。虽然后来陆陆续续有了一些改进,
但是基本原理和步骤还是大同小异的。因此在引
用文献时大多数人还是引用Arnon的那篇文献, 以
示对他创造性劳动的承认与尊重。可是, 有不少初
学者不是引用该方法的创造者或重要改进者及其原
始研究论文, 而是引用一些教科书的编写者及有关
介绍或者一些现成的测定叶绿素方法的沿用者及其
研究论文。这样做有失公平, 因为后者对叶绿素含
量测定方法没有实质性的贡献。
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编者附言
在许大全先生的这一篇文章中谈到的许多问题(其中不乏常识性问题), 虽然是针对叶绿素含量测定
而言, 但与此相类似的问题或多或少地在其他的植物生理和生化指标的测定、计算、表示和相关问题
研究中普遍存在。常见问题如下: 除叶绿素之外的其他物质含量和酶活性用鲜重而不是以干重或酶蛋白
量为单位进行计算; 光照强度不是用量子辐照(μmol·m-2·s-1)而是用勒克斯(Lux)表示; 比较不同光质光的生
理效应只注意光的波长(nm)不同或光的颜色不同而不考虑不同光质光之间的生理辐射能是否一样或相近,
等等。多年来, 我们在审定稿件过程中曾一再向投稿人指出(对此, 我们在征稿简约中还特地增订了一些
有关这一方面要求的条文), 但始终未得到一些投稿人的重视。为此, 借刊出许大全先生的这篇文章之机
会, 特此指出, 希望大家本着严肃、严谨和严格的精神重视这些问题。