全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 4期, 2010年 4月 385
收稿 2009-12-09 修定 　2010-03-09
资助 肇庆学院植物学扶持学科项目。
致谢 中国科学院华南植物园林植芳先生给予指导。
* 通讯作者(E-mail: shaoling@zqu.edu.cn; Tel: 0758-2716359)。
教学园地 Teaching
植物生理学实验教学中H2O2可视化检测方法的改进
邵玲 *
肇庆学院生命科学学院, 广东肇庆 526061
活性氧(reactive oxygen species, ROS), 如超氧
阴离子自由基(O2－· )、羟自由基(·OH)和过氧化氢
(H2O2)均是植物尤其是高等植物在有氧代谢过程中
产生的, 植物组织受到环境胁迫时大量富集(Fryer
等 1998; Apel和Hirt 2004)。一般认为H2O2是植物
体内产生的最稳定的活性氧分子, 它可以直接或间
接地导致细胞膜脂的过氧化伤害, 加速细胞的衰老
和解体。因此, 在植物抗性生理教材中, 其含量测
定是采用率较高的实验教学内容。
一般常用的测定H2O2方法主要有: 用硫酸肽
[Ti(IV)]与H2O2反应, 以分光光度计比色测定H2O2
(李玲 2009), 但此法由于需要用丙酮洗涤脱色, 常
引起H2O2降解, 即使平行测定的同一样品, 得出的
结果也有较大的偏差(吕波等 2000)。如改用5%三
氯乙酸(TCA)提取, 活性炭(A.C.)脱色, 经 Ti(IV)-
PAR- H2O2 [PAR: 4-(α-吡啶偶氮)间苯二酚]反应而
比色后, 由于活性炭会吸附部分H2O2, 所测定的数
值偏低(Patterson等 1984)。而根据文献报道的紫
外吸收动力学法(夏金婵等2005; 张小莉等2009), 需
要对材料进行预处理, 以去除有色细胞后才能检测,
这样又破坏了材料原有的生理状态。同时, 定量测
定植物组织中的H2O2含量, 其直观感不强, 常会导
致学生对逆境下H2O2在植物体内存在状况的认识
比较模糊。
H2O2是氧化进程中的主要产物之一。为提高
学生对逆境胁迫下H2O2在植物组织和细胞间快速
生成的感观认识, 我们改用组织化学的方法, 以二
氨基联苯胺(DAB)组织化学染色法检测植株或组织
内H2O2的积聚。此技术的优势之处在于具有组织
特异性, DAB在过氧化物酶(POD)参与下与H2O2在
H2O2产生的部位发生反应而形成红褐色聚合物
(DAB+POD+H2O2→DAB-H2O2 polymers)。因此,
用DAB染色可以检测植物受到环境胁迫时是否有
H2O2积累, 同时根据观察所产生斑点的多寡, 还可
以初步估算 H2O2的积累量(Lin等 2005; 邵玲等
2008)。但也有较多的文献报道(Hu等 2005; 李艳
辉等2008)认为此法也有问题, 即H2O2与DAB反应
生成的棕红色多聚产物只在叶片的叶脉中明显积
累, 而叶肉细胞中几乎观察不到, 这种现象在禾本
科植物叶片中更为明显, 有时会误认为胁迫并不能
诱导叶肉细胞中H2O2的产生。所以, 此法有时并
不能反映胁迫条件下H2O2积累的真实情况(李艳辉
等 2008)。根据以上情况, 我们重新筛选了实验材
料, 并对检测方法进行了改进, 使这一实验便于课
堂操作, 得到的结果清晰。
1 材料与方法
拟南芥(Arabidopsis thaliana)种子为 Lands-
bergerecta (Ler)生态型。将种子清洗消毒, 于 4 ℃
以水浸种 2 d后播种于经灭菌的培养基质上。生
长的光暗周期为 16 h光照 /8 h黑暗, 培养温度为
(22±1) ℃, 光照强度为 80 μmol·m-2·s-1, 相对湿度
70%, 生长期间不受其它逆境因素胁迫。苗龄为35
d后, 取第3位成熟叶片为实验材料, 进行外源H2O2
和高温胁迫处理。
外源H2O2处理时, 将叶片浸泡于100 mmol·L-1
H2O2溶液中, 在 25 ℃的恒温培养箱中黑暗放置 1
h。高温处理时, 将叶片浸泡于纯水并置于 45 ℃
的恒温水浴中, 暗下热胁迫1 h, 以正常生长的叶片
为对照。
DAB-HCl购自Sigma公司, 其它试剂采用国产
分析纯。
叶片中 H 2 O 2 活体组织化学原位检测根据
Thordal-Christensen等(1997)及 Ruuhola和Yang
(2006)的方法进行改进。取处理后的叶片迅速浸
入 0.5 mg·mL-1的DAB (pH 7.0的磷酸缓冲液, 内含
100 μL Triton-X 100)溶液中, 快速真空抽气 5 min,
避光放置 8 h。随后吸去染色液, 洗去叶面残留的
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DAB, 加入 60%乙醇于 80 ℃水浴中加热至叶片叶
绿素完全脱去为止。脱色后的叶片用 5%的甘油
溶液浸泡保存(可置于室温或 4 ℃冰箱内), 制片后
观察、拍照。叶片上红棕色DAB-H2O2多聚化合
物的合成情况分别放在 XTX-2A体视显微镜和
Zeiss AXIO ImagerA1系统显微镜下检测和拍照。
2 实验结果
图 1-a、b、c为 DAB与H2O2反应脱色后拍
照的全叶图。与正常生长的对照叶片(图 1-a)染色
情况相比, 浸泡H2O2的叶片染色程度最深(图 1-b),
高温处理的叶片着色次之(图 1-c)。图 1-a和图 1-
b的正反对比表明, 高温可诱发叶片组织中H2O2的
积累。同时, 叶脉上积聚的DAB-H2O2红棕色复合
物较多, 叶脉纹理清晰。
图 1-d、e、f为拟南芥叶片 DAB-H2O2 染色
后在体视显微镜下放大的局部图, 从图中可清晰区
别主叶脉和各级分支叶脉的染色情况。高温(图 1-
f)下网状叶脉和叶肉组织间H2O2明显积聚, 这些组
织被DAB染色的深度仅次于H2O2处理(图1-e)。不
经高温处理的叶组织间同样有较浅的着色(图1-d),
表明在有氧代谢过程中正常生长的拟南芥同样能产
生微量的 H2O2。
图 1 拟南芥叶片中DAB-H2O2 的染色
a和 d: 对照; b和 e: 外源 H2O2处理; c和 f: 高温处理。
图 2 DAB-H2O2复合物在拟南芥叶片细胞中的定位
a~c: 对照; d~f: 外源 H2O2处理; g~i: 高温处理。a、d、g放大倍数 10×10; b、e、h放大倍数 20×10; c、f、i放大倍数 100×
10, 油镜观察。LV: 叶脉; LS: 叶刺; MC: 叶肉细胞; CP: 叶绿体。
通过进一步提高检测手段, 我们将简易的装片
放置到生物系统显微镜上, 在 10×、20×和 100×等
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放大倍数下, 拟南芥叶肉组织中细胞的排列轮廓及
其染色情况可逐步呈现(图 2)。红棕色复合物除了
明显积聚于叶片的叶脉上以外, 在细胞结构上也有
大量分布, 但在细胞间隙中基本上没有H2O2的积累,
其底色为白色。在放大倍数为 100×的显微视野下
还可观察到, DAB-H2O2复合物主要沉积于叶肉细胞
的细胞壁与叶绿体中。与不经高温处理的叶片细
胞相比, 1 h的高温或H2O2胁迫后, 叶片细胞受到
的伤害明显较大, 叶绿体肿胀, 排列紊乱, 靠近细胞
壁的叶绿体染色程度明显加深, 叶绿体中的红棕色
颗粒显著积累, 表明这一部位存在的H2O2数量很高
(图 2-f、i)。而此时, 不经高温处理的叶片细胞其
叶绿体染色较浅(图 2-c), 叶绿体基本上呈椭圆形,
细胞内分布比较均匀。这表明高温胁迫可诱导拟
南芥叶片细胞中H2O2积累, 并大量分布于维管束组
织和膜质细胞器(主要为叶绿体)中。
3 几点认识和体会
实验课除了验证课堂上的理论知识和掌握基
本实验技能以外, 还应增设情景, 让学生在探究科
学的过程中, 由浅入深, 乘阶而上。DAB组织化学
染色法能够较快速且特异地检测植株或组织内
H2O2的积累部位和程度, 操作简便, 通过目测或显
微镜观察产生的DAB-H2O2红褐色复合物便可了解
H2O2在组织或细胞中的聚集情况及其与胁迫因子
的关系。这在学生专业研究背景尚浅的情况下, 可
加深他们对逆境胁迫下植物体内活性氧发生的理
解。在我们的实验中, 选用拟南芥为材料, 不仅因
为它是植物界的模式植物, 易于培养, 更重要的是
其叶面积较小, 叶片厚度较薄, 细胞离散性较好, 制
作装片简易, 便于镜检。
虽然用DAB方法检测植物中H2O2的报道较多,
但其观察的结果大多停留在组织水平上。如要观
察细胞水平上H2O2的积聚, 则需要做生物切片甚至
是电镜切片(李艳辉等 2008; 刘艳等 2004)。从实
验设备条件、实验技能掌握以及时间分配来说, 都
不适合于课堂实验。因此, 在选准材料后, 我们对
D AB 的染色检测流程进行了一些探索和改良。
Thordal-Christensen等(1997)及 Ruuhola和Yang
(2006)均用浓度为 1 mg·mL-1的DAB染色, MES缓
冲液的 pH为 3.8或 5.8, 脱色和样品保存用 96%的
乙醇。而在本文中, 改用 pH 7.0的磷酸缓冲液, 这
样, 反应可在接近生理条件下进行。而用较低浓度
(0.5 mg·mL-1)的DAB染色, 并用 60%沸乙醇脱色,
则会降低试剂的用量, 节省成本, 同样可以获得良
好的效果。此外, 采用 5%的甘油溶液保存叶片,
既可保证组织细胞结构的正常定位, 又可提高材料
的柔软度和在光学显微镜检测中的通透性。本文
中的实验结果表明, 改进的H2O2组织化学检测的方
法, 不仅能清楚显示出短期热胁迫后H2O2在叶片中
的积累(图 1), 而且可以由表及里, 层层递进, 在操
作较为简便的条件下, 就可以直观地观察到H2O2在
维管束和叶肉细胞, 甚至是叶绿体中实体积聚和分
布的情况(图2)。为了证明高温胁迫诱导叶片H2O2
积累的可靠性, 在实验中我们还用外源H2O2渗透的
方法进行了验证。因此, 改良后的DAB组织化学
方法可以适合于逆境胁迫下植物组织和细胞中
H2O2检测及定位的初步研究的课堂教学。
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