全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (3): 315~323 315
收稿 2013-10-09　　修定 2013-12-06
资助 浙江省海水养殖科技创新团队项目(2010R50025-25)。
* 通讯作者(E-mail: sunxue@nbu.edu.cn; Tel: 0574-87600170)。
一株杜氏藻的分子鉴定与耐盐特性
王冬梅1,2, 王玮蔚1,2, 孙雪1,2,*, 徐年军1,2
宁波大学1应用海洋生物技术教育部重点实验室, 2海洋学院, 浙江宁波315211
摘要: 杜氏藻属(Dunaliella)是绿藻门的一类极端耐盐的单细胞藻。本文通过核基因ITS序列和叶绿体基因rbcL序列确定了
一株分离自舟山群岛的杜氏藻D3的分类地位, 并比较了4种NaCl浓度对该藻的生长、蛋白质含量、总脂含量和叶绿素荧
光参数的影响, 以期为该藻在今后的科研与应用提供基础资料。结果表明, 该藻与23株杜氏藻的ITS序列之间的遗传距离
在0.026~0.136之间, 与21株同属藻rbcL序列之间的遗传距离在0.005~0.060之间, 由遗传距离和聚类图推断该杜氏藻D3属于
D.viridis。不同NaCl浓度对该藻D3生长影响表明1.00 mol·L-1 NaCl培养藻生长最快, 培养至10 d时, 0.44 mol·L-1、2.00
mol·L-1和3.00 mol·L-1 NaCl培养藻细胞数分别是它的85.9%、93.2%和80.7%; 该藻可溶性蛋白含量在1.00 mol·L-1 NaCl培养
最高; 藻细胞总脂含量在0.44~2.00 mol·L-1 NaCl浓度范围内随盐度升高总脂含量增加, 2.00 mol·L-1 NaCl培养最高(占干重的
22.3%); 叶绿素荧光参数(Fv/Fm、ФPSII、qp)在高盐(3.00 mol·L
-1 NaCl)培养显著降低, 而NPQ则升高。
关键词: 杜氏藻; ITS序列; rbcL序列; NaCl浓度; 生理生化参数
Molecular Identification and Halophilic Charactristics of a Strain of Dunaliella D3
WANG Dong-Mei1,2, WANG Wei-Wei1,2, SUN Xue1,2,*, XU Nian-Jun1,2
1Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology, 2 School of Marine Science, Ningbo University, Ningbo, Zhejiang 315211, China
Abstract: The genus Dunaliella is a kind of halophilic unicellular algae of Chlorophyta. In this paper, a strain
of Dunaliella D3, isolated from Zhoushan islands of Zhejiang Province, was determined its taxonomy based on
the nucleotide sequence of ITS and the chloroplast gene of rbcL. Then, the effects of four kinds of NaCl
concentrations on the growth, protein content, total lipid content and chlorophyll fluorescence parameters of the
Dunaliella were compared, which would provide a foundation for scientific research and application in the
future. The distances ranged from 0.026 to 0.136 based on the ITS sequence of D3 and the other 23 strains of
Dunaliella, and the distances varied from 0.005 to 0.060 based on the rbcL sequence of D3 and the other 21
strains of Dunaliella. The genetic distances and phylogenetic tree confirmed D3 as D. viridis. The effect of
different NaCl concentration on the growth of D3 showed that the algae grew fastest in 1.00 mol⋅L-1 NaCl
medium, and the cell density of 0.44 mol·L-1, 2.00 mol·L-1 and 3.00 mol·L-1 NaCl culture was 85.9%, 93.2% and
80.7% of that of 1.00 mol·L-1 NaCl on the 10th day, respectively. The soluble protein content was the highest in
the 1.00 mol·L-1 NaCl medium. The total lipid content of D. viridis D3 was highest in 2.00 mol·L-1 NaCl
medium, which accounted for 22.3% of the dry weight. The chlorophyll fluorescence parameters of PSII (Fv/
Fm), actual photochemical efficiency of PSII (ФPSII), photochemical fluorescence quenching (qp) deceased, but
non photochemical fluorescence quenching (NPQ) increased in 3.00 mol·L-1 NaCl culture.
Key words: Dunaliella; ITS; rbcL; NaCl concentration; physiological and biochemical parameters
杜氏藻(Dunaliella)是绿藻门(Chlorophyta)、
衣藻目(Chlamydomonadales)、盐藻科(Dunalie-
llaceae)的一类单细胞真核微藻。杜氏藻含有丰富
的β-胡萝卜素、蛋白质、脂质、微量元素和活性
代谢产物, 具有重要的经济价值。在一定条件下
杜氏藻积累的β-胡萝卜素含量可高达干重的14%
左右, 为自然界中所有生物之首(Raja等2007)。杜
氏藻细胞内还可以积累大量甘油, 在饱和NaCl浓
度下可达到细胞重量的55% (Alkayal等2010)。杜
氏藻的适盐范围很广, 可以在含0.05~5.50 mol·L-1
NaCl的培养液中生存(Bental等1988)。因此, 杜氏
藻是研究藻类植物耐盐机制的良好实验材料。
盐度是影响微藻生长的重要环境因子, 不同
微藻都有其适宜生长的盐度范围, 如海链藻(Thal-
植物生理学报316
assiosira sp.)在15‰~35‰盐度范围内生长正常, 而
卡盾藻(Chattonella marina)的最适生长盐度为
20‰~30‰ (朱明等2003; 黄娟等2009)。杜氏藻是
一种广盐性的单细胞浮游植物, 盐生杜氏藻(D.
salina)可以在0.1 mol·L-1 NaCl至饱和NaCl下生存
(Borowitzka和Siva 2007)。D. viridis的耐盐范围是
1.0~3.4 mol·L-1 (Johnson等1968); D. tertiolecta的耐
盐范围是0.6~3.6 mol·L-1 (Borowitzka和Brown
1974)。而盐度也是影响微藻总脂含量的一个重要
因素, 如南极绿藻Chlorophyceae L-4在盐度增加至
150‰时, 总脂含量约提高一倍(缪锦来等2005)。
杜氏藻D. tertiolecta的总脂含量可从0.5 mol·L-1
NaCl培养的60%增加到1.0 mol·L-1 NaCl的67%
(Takagi等2006)。叶绿素荧光参数的变化已被广泛
地用于盐度等逆境胁迫的研究中, 它能够推断出
有关光能利用途径的信息。如PSII最大光能转化
效率(Fv/Fm)下降表明盐度胁迫使PSII反应中心受
损, 抑制了光合作用的原初反应, 阻碍光合电子的
传递过程(van Kooten和Snel 1990)。非光化学淬灭
系数(NPQ)与ATP的形成、积累及光合膜的状态相
关(高丽红等2004)。因此, 可以通过叶绿素荧光参
数的变化情况, 来评价微藻对盐度逆境的适应性,
并可作为筛选耐盐性微藻品种的参考指标。
ITS和rbcL都是常用的藻类系统发生和分子
鉴定的工具。ITS是核基因组编码序列, 位于核糖
体基因18S rDNA和5.8S rDNA之间(ITS1)以及
5.8S rDNA和28S rDNA之间(ITS2), 它的变异性比
较大, 常作为一种分子标记用于属和种水平上的
系统进化分析, 如藻类中的衣藻属和杜氏藻的系
统关系分析(张弛等2000; Tran等 2013a; Assunção
等2012)。rbcL是1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶大
亚基的编码基因, 位于叶绿体中, 其保守性比较高,
常单独或与其他基因序列一起用来解决科级甚至
属级水平的系统学问题。如绿藻门的蕨藻目(Cau-
lerpales)、团藻目(Volvocales)和溪菜目(Pras-
iolales)的系统发生关系分析(Lam和Zechman 2006;
Nozaki等1999; Sherwood等2000)。
本实验室保存了一株从形态上初步鉴定为杜
氏藻的微藻, 该藻经常被多个研究单位用于进行
科研工作。为了确定其种名, 本文采用ITS和rbcL
两种基因序列对其进行了分子鉴定, 并比较了不
同NaCl浓度对该藻生理生化的影响。希望本研究
可以确定该杜氏藻的种名以及生理生化特性, 从
而为该杜氏藻在今后的科学研究和应用提供参考
资料和依据。
材料与方法
1 实验材料与处理
本实验所用杜氏藻(Dunaliella) D3分离自浙
江省舟山群岛, 长期保存于宁波大学海洋生物工
程重点实验室藻种室。经过单藻分离后不断扩大
培养和传代。培养基为MAV3号海水培养基(添加
NaCl使其终浓度为1.00 mol·L-1), 培养温度为25 ℃,
光照强度为40 μmol·m-2·s-1, 光暗周期D:L=12 h:12
h。培养基的盐度分别为0.44 mol·L-1 (约天然海水
折算浓度)、1.00 mol·L-1、2.00 mol·L-1和3.00
mol·L-1 NaCl, 每个浓度设置3个平行。
2 实验方法
2.1 基因组DNA的提取
离心收集对数期的藻细胞, 利用细菌DNA提取
试剂盒进行DNA提取。经琼脂糖凝胶电泳检测DNA
完整性和微量核酸定量仪测定浓度后, 分装备用。
2.2 ITS与rbcL序列的扩增和测序
在NCBI核苷酸数据库中搜索几种杜氏藻D.
tertiolecta (EF473748)、D. bardawil (DQ116744)、
D. parva (DQ116746)、D. salina (EF473741)、D.
primolecta (DQ116745)的ITS基因序列, 根据其保
守区段利用ClustalW程序设计上游引物(DS5: 5′-
GTGTGCTGGTGAAGTGTTTGGATCGGT-3′, 位
于18S rDNA上)和下游引物(DS3: 5′-TCTTTTCC-
TCCGCTTATTGATATGC-3′, 位于28S rDNA上)。
通过D. salina (AY531529)、D. salina (DQ313197)、
D. viridis (DQ313206)、D. peircei (DQ313196)的
rbcL基因序列, 根据其保守区段利用clustalW程序
设计上游引物(DL5: 5′-GCTTTYCGTATGAC-
W C C W C A A C C - 3 ′ )和下游引物 ( D L 3 : 5 ′ -
TACGTGAATACCACCDGAAGCTAC-3′)。以杜
氏藻D3基因组DNA为模板进行PCR扩增, PCR反
应程序为: 94 ℃预变性5 min, 94 ℃变性1 min, 55
℃复性1 min, 72 ℃延伸1.5 min, 共进行35个循环,
72 ℃延伸8 min。将电泳检测大小正确的扩增片
段进行PCR产物纯化、回收与连接转化。最后将
经检测有阳性重组子的菌落交由上海英潍捷基基
因公司进行双向测序。
王冬梅等: 一株杜氏藻的分子鉴定与耐盐特性 317
2.3 序列分析
对所获序列进行拼接, 然后将这两条序列提
交到GenBank申请登录号。运用NCBI网站上
BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对
测序结果, 从GenBank中查找杜氏藻属的ITS与
rbcL序列, 使用MEGA5.10软件中的ClustalW程序
进行序列的完全比对和邻接法(neighbor-joining,
NJ)构建系统发育树, 以自展法(bootstrap method)
进行可信度测试, 重复1 000次。
2.4 生长曲线的制作
将培养至对数期的藻按照15%比例分别接种
到4种不同NaCl浓度的培养基中(0.44、1.00、
2.00、3.00 mol·L-1), 每天定时取样测定藻液的
OD440。通过OD440光密度值与藻细胞密度的线性
关系公式: y=14.83x+0.129 (R2= 0.996)换算成相应
的细胞数, 以藻细胞密度为纵坐标, 培养时间为横
坐标, 绘制藻D3的生长曲线。
2.5 可溶性蛋白含量的测定
采用考马斯亮蓝法分别测定不同NaCl浓度培
养藻株D3的可溶性蛋白质含量(邹奇2000)。
2.6 总脂含量的测定
离心收集培养15 d的藻进行冷冻干燥, 然后准
确称取100 mg冷冻干燥的藻粉, 采用氯仿-甲醇提
取法(Bligh-Dyer法)测定藻株D3的总脂含量(Blight
和Dyer 1959)。
2.7 叶绿素荧光参数的测定
用Water-PAM水样叶绿素荧光仪(Walz, Ger-
many)进行叶绿素荧光参数的测定。测量前将微
藻样品暗适应15 min, 再利用水样叶绿素荧光仪发
出的强饱和光激发, 测量不同盐度培养藻的荧光
参数: PSII最大光能转化效率(Fv/Fm)、PSII实际光
能转化效率(ФPSII)、光化学淬灭系数(qp)和非光化
学淬灭系数(NPQ)。
2.8 数据处理
生理生化数据均采用Excel软件作图, 用SPS-
S19.0软件进行数据分析。
实验结果
1 杜氏藻属ITS序列分析
1.1 24株杜氏藻ITS序列的遗传距离分析
本实验获得的杜氏藻D3的ITS序列长度为
1 224 bp, 包含完整的221 bp的 ITS1序列、159 bp
的5.8S rDNA序列、227 bp的 ITS2序列, 以及部分
18S rDNA (555 bp)和28S rDNA (63 bp)序列。D3
的ITS序列在GenBank中的登录号为KF595151。
将D3与GenBank中查找到的23株杜氏藻的
ITS序列一起使用MEGA5.10软件进行序列的完全
比对, 采用Pairwise distance calculation法, 使用
Kimura 2-parameter model模型对各藻种的遗传距
离进行计算(表未列出)。24株藻的ITS基因的编码
区序列间的遗传距离为0.000~0.143, 其中遗传距
离最小的为GenBank数据库中查找的两组, 一组是
3株D. tertiolecta (EF473748、EF473738、EF47-
3742)与D. salina (EF473741), 另一组是D. bardawil
(DQ116744)、D. primolecta (DQ116745)与D. parva
(DQ116746), 它们的之间的遗传距离为0。遗传距
离最大的为D. salina (JN034031)与D. salina (JX22-
0893), 它们的遗传距离为0.143。本实验材料D3与
其他23株同属藻之间的遗传距离在0.026~0.136之
间, D3与3株D. viridis (DQ377098、HQ882804、
HQ864830) 的遗传距离为0.026~0.030, 说明它与
D.viridis之间亲缘关系较近。
1.2 基于ITS序列的系统树构建
本实验藻D3与在GenBank数据库中查找的23
株杜氏藻的ITS基因序列一起用MEGA5.10软件
中的邻接法构建系统树(图1)。从系统树上可以看
出, 系统发育树可分为三部分, 3株D. tertiolecta
(EF473748、EF473738、EF473742)与2株D. salina
(EF473741、EF473744)、D. bardawil (DQ116744)、
D. parva (DQ116746)、D. primolecta (DQ116745)
聚在一起; 大部分D. salina聚在一起; 实验藻D3分
布在第二部分, 系统发育分析在我们感兴趣的分
支上的可信度为100%, 它与3株D. viridis (DQ377-
098、HQ882840、HQ864830)聚在一起, 说明实验
株D3与D. viridis关系最近。
2 杜氏藻属rbcL序列分析
2.1 22株rbcL序列的遗传距离分析
本实验室获得杜氏藻D3的rbcL序列长度为
1 038 bp, 其在GenBank中的登录号为KF601410。
将D3和GenBank中的其他21株杜氏藻的rbcL序列
使用MEGA5.10软件对各藻株的遗传距离进行计
算(表未列出)。结果表明, 22株藻之间的遗传距
离为0.000~0.071, 其中遗传距离最小的为3株D.
primolecta (DQ313198、AB127992、DQ173090)、3
植物生理学报318
株D. tertiolecta (DQ313204、DQ313205、DQ-
313203)、2株D. bioculata (AB127991、DQ313195),
它们之间的遗传距离为0, D. salina (DQ173085)与
D. viridis (DQ313206)的遗传距离最大, 为0.071。
本实验材料D3与其他21株同属藻之间的遗传距离
在0.005~0.060之间, D3与D. viridis (DQ313206) 及
D. salina (AY531529)的遗传距离分别为0.025和
0.005, 说明它与D. salina及D. viridis的关系较近。
2.2 基于rbcL序列的系统树构建
本实验藻D3与以上21株杜氏藻的rbcL基因序
列一起用MEGA5.10软件构建分子系统树(图2)。
从系统发育树上可以看出, 系统树可分为四部分,
实验藻D3属于第四部分, D3、D. salina (AY531529)、
D. viridis (DQ213206)在系统发育树上聚为一类,
该结果与遗传距离的分析结果一致。D. salina与
D.viridis比较相近 , 结合以上ITS序列对3种藻
(D3、D. salina、D. viridis)的遗传距离分析和系统
发育分析, 我们推断D3为D. viridis。
3 不同NaCl浓度对D. viridis D3生长的影响
D. viridis D3在不同NaCl浓度培养基中的生
长情况如图3所示, 初始接种的藻细胞密度为1.73×
106个·mL-1。经过1 d延滞期后, 不同盐度对藻生长
的影响逐步显现出来, 从3 d开始藻细胞进入了快
速生长的对数期, 其中1.00 mol·L-1 NaCl培养基中
藻细胞增长最快, 其次是2.00 mol·L-1和0.44 mol·L-1
培养基中藻生长较快, 而3.00 mol·L-1 NaCl的培养
基中D3的生长最慢, 与1.00 mol·L-1NaCl 的生长相
比较差异显著(P<0.05)。在10 d, 1.00 mol·L-1 NaCl
培养的细胞密度最高, 为3.288×107个·mL-1。而
0.44、2.00和3.00 mol·L-1 NaCl的细胞密度分别是
图1 基于24株杜氏藻ITS序列构建的系统树
Fig.1 The phylogenetic tree constructed on the ITS sequence of 24 strains of Dunaliella
王冬梅等: 一株杜氏藻的分子鉴定与耐盐特性 319
度, 在高盐3.00 mol·L-1 NaCl培养基中的D.viridis
D3生长会受到抑制。
4 不同NaCl浓度对D. viridis D3可溶性蛋白含量的
影响
从图4中可以看出, 随着D. viridis D3的生长,
可溶性蛋白在不断地积累。D. viridis培养在天然
海水(0.44 mol·L-1 NaCl)中蛋白含量不断增加, 但增
长缓慢。1.00 mol·L-1和2.00 mol·L-1 NaCl浓度培养
其蛋白质含量高于天然海水, 其可能原因是在较
高盐度下, 藻细胞为了维持其正常渗透压与细胞
代谢活动 , 某些盐胁迫蛋白表达增加(Sadka等
1989; 徐坤等1998)。而在3.00 mol·L-1 NaCl培养基
中, 蛋白质含量是同时期最低的, 为1.00 mol·L-1培
养基的45.60%, 这可能与高盐抑制D.viridis的生
长有关。总之, 蛋白含量的变化趋势是从0.44到
1.00 mol·L-1随着NaCl浓度升高蛋白含量增加, 而在
1.00~3.00 mol·L-1范围内随着NaCl浓度增加蛋白含
其的 85.9%、93.2%和80.7%, 可见1.00 mol·L-1
NaCl培养藻生长最快, 其次是2.00 mol·L-1 NaCl。
0.44 mol·L-1 NaCl (天然海水)并不是该藻的最适盐
图3 不同NaCl浓度对D. viridis D3生长的影响
Fig.3 The effect of different NaCl concentrations on the
growth of D. viridis D3
图例单位为mol·L-1, 图4和图5同此。
图2 基于22株杜氏藻rbcL序列构建的系统树
Fig.2 The phylogenetic tree constructed on the rbcL sequence of 22 strains of Dunaliella
植物生理学报320
量下降。在藻生长最快的1.00 mol·L-1 NaCl浓度其
单位细胞的蛋白含量也是最高的。
5 不同NaCl浓度对D.viridis D3总脂含量的影响
如表1所示, D3藻细胞内的总脂含量与胁迫渗
透剂NaCl浓度有密切关系。从0.44 mol·L-1到2.00
mol·L-1 NaCl培养, 随着NaCl浓度的增加总脂含量
也逐渐增加, 可见在一定范围内总脂含量与盐度
呈正相关性。而超过3.00 mol·L-1 NaCl浓度培养基
中总脂含量下降。以1.00 mol·L-1 NaCl培养藻的总
脂含量为100%来计, 0.44 mol·L-1、2.00 mol·L-1和3.00
mol·L-1 NaCl中藻的总脂含量分别是其的68.42%、
117.36%和91.05%。可见, 2.00 mol·L-1 NaCl是该藻
积累脂类最合适的盐度。
表1 不同NaCl浓度对D. viridis D3总脂含量的影响
Table 1 The effect of different NaCl concentrations on the
total lipid content of D. viridis D3
NaCl浓度/mol⋅L-1 总脂含量/%
0.44 13.0±1.00
1.00 19.0±1.00
2.00 22.3±2.08
3.00 17.3±1.52

6 D. viridis D3在不同NaCl浓度培养基中的叶绿素
荧光特性
叶绿素荧光分析技术多用于研究植物光合生
理状况及各种外界因子对其细微的影响。通过叶
绿素荧光参数的变化可以检测微藻盐度胁迫情
况。在盐胁迫培养的前5天, D. viridis D3的PSII最
大光能转化效率(Fv/Fm)变化不明显(图5-A), 但随
着培养天数的增加, 高盐(3.00 mol·L-1 NaCl)使其Fv/
Fm降低。在1.00~3.00 mol·L
-1 NaCl的培养基中PSII
实际光能转化效率(ФPSII) (图5-B)与光化学淬灭系
数(qp) (图5-C)随着盐度的增加呈下降趋势, 高盐胁
迫使荧光参数Fv/Fm、ФPSII、qp降低, 这一结果与大
多数相关研究结果一致(梁英等2006; El-Sheekh
2004)。ФPSII的降低是因为高盐阻碍了藻细胞的同
化能力, 影响其对碳的固定和同化。qp的下降是因
为电子从PSII的氧化侧向PSII反应中心的传递过
程受阻, 从而用于进行光合作用的电子减少, 以热
或其他形式耗散的光能增加。随着培养时间的增
加, 非光化学淬灭系数(NPQ)呈现先上升后下降的
趋势, 但总的趋势是3.00 mol·L-1>2.00 mol·L-1>1.00
mol·L-1>0.44 mol·L-1(图5-D)。可见, 在盐度胁迫下,
藻D3的PSII最大光能转化效率(Fv/Fm)、实际光能
转化效率(ФPSII)、光化学淬灭系数(qp)与非光化学
淬灭系数(NPQ)的变化呈相反趋势。
讨　　论
1 杜氏藻的分子鉴定
核基因组编码的ITS序列作为一种分子标记
应用于杜氏藻的系统发育分析, 如王伟等(2006)利
用该序列将两株杜氏藻进行了准确的命名, Zamani
等(2011)利用ITS序列鉴定出一株新的盐生杜氏藻,
而Gonzalez等(2001)利用ITS序列分析几株杜氏藻
系统关系的过程中发现ITS序列具有丰富的变异
位点。叶绿体的编码基因rbcL具有较高的保守性,
常作为分子标记进行科级甚至属级以上的系统进
化分析, 如Lam和Zechman (2006)利用rbcL基因序
列对蕨藻目的系统发生进行了分析, Sherwood等
(2000)利用18S rDNA和rbcL基因序列对绿藻门溪
菜目的系统发育地位进行了推断。根据杜氏藻的
形态、成长阶段、环境条件的适应性鉴定杜氏藻,
一些品种有可能被误认, 据一些较新的系统发育
研究发现杜氏藻的物种总数可能不超过23种(Tran
等2013b)。Preetha等(2012)通过形态特征、ITS序
列和rbcL序列对印度的几株杜氏藻进行了分类鉴
定。本文通过形态学特征初步推断D3为杜氏藻 ,
又利用ITS和rbcL两种基因序列对杜氏藻D3进
行了系统发生分析, 最终把D3确定为D. viridis。
图4 不同NaCl浓度对D. viridis D3可溶性蛋白含量的影响
Fig.4 The effect of different NaCl concentrations on the
soluble protein content of D. viridis D3
王冬梅等: 一株杜氏藻的分子鉴定与耐盐特性 321
图5 不同NaCl浓度对D.viridis D3叶绿素荧光参数(Fv/Fm、ФPSII、qp、NPQ)的影响
Fig.5 The effect of different NaCl concentrations on the chlorophyll fluorescence parameters (Fv/Fm, ФPSII, qp, NPQ) of D.viridis D3
2 不同NaCl浓度对微藻生长的影响
盐度是影响微藻生长快慢的一个重要环境因
子。不同微藻都有其适宜生长的盐度范围。如海
链藻(Thalassiosira sp.)在盐度15‰~35‰范围内生
长正常, 但盐度高于35‰或低于15‰时, 该藻的生
长明显变慢(朱明等2003)。卡盾藻(Chattonella
marina)的最适生长盐度为20‰~30‰, 盐度超过
30‰时生长速率迅速下降(黄娟等2009)。对较耐
盐的杜氏藻属而言, 不同种的耐盐范围不同, 如D.
salina可以在0.1 mol·L-1 NaCl至饱和NaCl下生存,
最适盐度为2.0 mol·L-1 NaCl (Azachi等2002);
D. viridis仅可以1.0~3.4 mol·L-1 NaCl下生存, 最适
盐度为1.0 mol·L-1 (Johnson等1968); D. tertiolecta可
以在0.6~3.6 mol·L-1 NaCl下生存, 最适盐度为3.0
mol·L-1 NaCl (Borowitzka和Brown 1974)。本实验
结果表明1.00 mol·L-1 NaCl培养藻生长最快, 为D3
藻的最适盐度, 大于3.00 mol·L-1 NaCl长期培养部
分藻体会出现变白现象。
3 不同NaCl浓度对藻类生化组成的影响
盐胁迫不仅可以影响藻类的正常生长, 还可
以引起植物生化组成的变化。Sadka等(1991)发现
盐藻中一种150 kDa的蛋白质在 0.5 mol·L-1 NaCl条
件下生长的细胞中几乎检测不到, 但在3.0 mol·L-1
或更高盐度条件下生长的细胞中成为一种主要的
蛋白。某些微藻的总脂含量在盐胁迫下含量会增
加, 如塔胞藻(Pyramidomonas sp.)的总脂含量由盐
度11‰培养的10.17%上升到150‰培养的25.92%
(缪锦来等2005); 耐盐绿藻杜氏藻(D. tertiolecta)中,
其总脂含量可从0.5 mol·L-1 NaCl培养的60%增加到
1.0 mol·L-1 NaCl的67% (Takagi等2006)。但也有相
反的报道, 如Chlorophyceae L-4在盐度为22‰~
33‰时总脂含量仅为6%左右, 但盐度降低至11‰
时, 总脂含量反而上升至7.3% (缪锦来等2005)。
而本研究的D. viridis D3在一定的NaCl浓度范围
(0.44~2.00 mol·L-1)内, 总脂含量随着NaCl浓度的增
加而增加, 该结果与已有大多数报道结果一致。
而在NaCl浓度为3.00 mol·L-1培养基中, 总脂含量
又低于2.00 mol·L-1的培养基中, 这可能与高盐下其
生长状态较差有关系。
植物生理学报322
4 不同NaCl浓度对微藻叶绿素荧光参数的影响
叶绿素荧光参数的变化已经越来越被广泛地
用于盐度等逆境胁迫研究, 通过对各种荧光参数
的分析, 可以得到相关光能利用途径的信息。在
荧光分析中最常用的参数是PSII的最大光能转化
效率(F v/Fm) , 在胁迫条件下 , 此参数变化较大
(Sarijeva等2007; 王帅和梁英2012)。在1.00~3.00
mol·L-1 NaCl浓度培养基中Fv/Fm、ФPSII、qp 随着盐
度的增加呈下降趋势。高盐下, Fv/Fm下降表明了
盐度胁迫使PSII反应中心受损, 抑制了光合作用的
原初反应, 阻碍光合电子的传递过程, 这与史庆华
等(2004)研究NaCl胁迫对叶绿素荧光参数变化影
响的结论是相同的。qp在一定程度上反映了PSII
的开放程度, 它的下降表明用于进行光合作用的
电子减少(梁英等2006; El-Sheekh 2004)。NPQ是
由于光合膜的两侧逐渐建立起质子梯度和形成膜
高能态所引起的, 它与ATP的形成、积累及光合膜
的状态相关(高丽红等2004)。NPQ的变化与其他
荧光参数呈相反趋势, 随着胁迫浓度的升高与胁
迫时间的延长NPQ呈先上升后下降的趋势, NPQ先
上升表明其PSII的潜在热耗散能力增强, 而后下降
表明其正常生理功能受到严重伤害, 对热能的耗
散能力丧失。叶绿素荧光参数的变化情况可作为
筛选耐盐性微藻品种的参考指标。
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