全 文 ：商品佛手和香椽 rDNA ITS-RFLP鉴别研究
高晓霞1 ,陈晓颖1 ,罗源生2
(1.广东药学院 药物分析教研室 ,广东 广州 510006;2.广东广弘药材有限公司 ,广东 广州 510893)
摘 要:目的:利用 ITS-RFLP技术对佛手及其近缘种香橼的商品药材进行快速的分子鉴定。方法:限制性
内切酶AluI和MspI分别对商品佛手和香橼的 ITS1和 ITS2目的片断进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析 。
结果:5个商品佛手样品购自药材市场 , ITS-RFLP 酶切图谱显示可以对其进行分子鉴定。结论:利用 ITS-RFLP
方法可很好地快速区分佛手与香橼 。
关键词:佛手;香橼;rDNA ITS序列;JTS-RFLP方法
中图分类号:R927 文献标识码:B 文章编号:1007-4813(2007)02-0037-02
作者简介:高晓霞(1972～ ),女 , 吉林长春市人 , 博士学位 ,讲师。研究方向:中药制剂分析和中药材指纹图谱研究。
本文将利用已建立的 ITS-RFLP 技术 ,对商品佛
手和香橼进行 RFLP分析 ,根据酶切后的电泳结果准
确 、快速地鉴别商品佛手 。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 佛手与香橼新鲜植物材料由广东
省中药研究所华南中药种植资源库于 2005年 4月 28
日提供。本研究中编号为 S1-S5的 5份佛手市售药
材购自广州清平药材市场 ,经鉴定其中 S1和 S4为佛
手(Citrus medical L.var.sarcodactylis(Noot.)Swingle),
S2 ,S3和 S5为香橼(C.medical L.)。
ExTag DNA 聚合酶(TakaRa),琼脂糖(Promega),
限制性内切酶 Alul 、Mspl(TaKaRa)。PE-480PCR扩增
仪(PE),台式高速离心机(Sigma),恒压恒流电泳仪
(Life Technologies),凝胶成像仪(Kodak EDAS120)。
1.2 方法 新鲜植物叶片各 0.1g ,采用改良的 CTAB
法提取总 DNA[ 1] 。PCR反应在 20μL 体系中含 10×
Buffer 2μl , 10mmol L dNTP 0.5μl , 25mmol L Mg2+
2.4μL , 10μmol L 引物各 1μL , DMSO 1μL , ExTaq(5U
μL)0.1μL , DNA 模板(适宜浓度)2μL , 灭菌三蒸水
(3dH2O)10μL。PCR扩增条件为 94℃变性 4min ,94℃
1min , 50℃2min , 72℃2min , 循环 30 次;72℃延伸
10min ,以 3dH2O代替模板 DNA作空白对照 。扩增产
物经1.0%琼脂糖凝胶电泳进行分析 。 rDNA ITS 区
通用扩增引物 18Sp48和26Se37由上海生工生物工程
有 限 公 司 合 成。 18Sp48:5-AGAAGTCGTAA-
CAAGGTTTCCGTAGG-3;26Se37:5-TTCTCCGCTTATT-
GATATGC-3。
RFLP 分析中所用的限制性内切酶为AluI和 Ms-
pI。10μL反应体系 ,含 10×Buffer 1μL ,限制性内切酶
0.5μL ,PCR纯化产物 5μL , BSA 1μL(如限制性内切酶
buffer需要加 BSA时),3dH2O补足至 10μL ,37℃恒温
水浴 3 ～ 6h。取 5 ～ 8μL 用 2%琼脂糖凝胶电泳检查
酶切结果 ,人工比较分析 RFLP带型图谱。
2 结果
限制性内切酶 AluI 的识别位点为 ag ct ,MspI 的
识别位点为 c cgg ,在佛手和香橼 rDNA ITS-RFLP初步
分析其中内切酶酶切图谱是有差异的。
应用已建立的 rDNA ITS-RFLP 方法对 5份佛手
和香橼市售商品药材进行鉴定研究 。在研究中 ,由于
部分商品药材较难获得 PCR产物 ,设计了 5Sp15r 和
5SF31引物[ 2] ,分别扩增 ITS1(18Sp48 , 5Sp15r)和 ITS2
(5SF31 ,26Se37)片断 ,获得的 PCR产物经测序分析为
柑橘 属 植 物 rDNA ITS 序 列。 5Sp15r:5-GAT-
GCGAGAGCCGAGATATCCGTTG-3;5Sf31:5-GCATCG-
ATGAAGAACGCAGC-3。
Webcutter2.0程序(http: rna.lundberg.gu.se cut-
ter2 )分析结果表明 ,限制性内切酶 AluI 的酶切位点
在佛手和香橼的 ITS1区 ,MspI 酶切图谱的差异主要
在 ITS2区。分别利用 AluI对样品的 ITS1 ,MspI 对样
品的 ITS2扩增产物进行 RFLP 鉴定(图略)。
3 讨论
ITS-RFLP 技术结合 PCR和 RFLP的优点 ,对外形
上较易混淆种类的鉴定具有快速 ,重现性好 ,且价廉
省时等优点 。本文是在佛手和香椽新鲜叶片经 PCR
产物直接测序 , ITS-RFLP 分析的基础上 ,对市售的商
品佛手作进一步的鉴定研究。
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第23卷第2期
2007 年 4月
长 春 中 医 药 大 学 学 报
Journal of Changchun University of Traditional Chinese Medicine
Vo1.23
2 , 2007
DOI :10.13463/j.cnki.cczyy.2007.02.022
住院患者抗菌药物使用情况调查分析
孙 静1 ,韩文志2＊
(1.吉林大学第二医院 ,吉林 长春 130041;2.吉林大学口腔医学院 ,吉林 长春 130041)
摘 要:目的:通过对我院住院患者使用抗菌药物的现状分析 ,为临床合理用药提供参考 。方法:调查
2006年 6月全部出院病历资料 ,统计住院患者抗菌药物的应用情况 ,并按抗菌药物的使用指征 、名称 、剂量 、用
法 、疗程及药敏实验和细菌培养等因素进行分析。结果:共有 8类 78个抗菌药物产品 ,其中 ,以头孢菌素类最
多见 ,其次为喹诺酮类和青霉素类 。患者抗菌药物的平均应用率达 76.90%,联合用药率达 20.18%。结论:目
前住院患者的抗菌药物应用率较高 ,应引起重视。
关键词:抗菌素 临床应用;头孢菌素 临床应用;住院患者
中图分类号:R978.5 文献标识码:B 文章编号:1007-4813(2007)02-0038-02
作者简介:孙 静(1963～ ),女 , 吉林梅河口市人 , 副主任药师。研究方向:临床药学。
＊通讯作者:韩文志 ,男 , 副主任药师。 E-mail:SX6009@yahoo.com.cn Tel:(0431)88796019
目前 ,抗菌药物是临床新品种最多 ,使用最广泛
的一类药物 ,因不合理使用而导致的一系列问题日见
突出 ,如耐药菌增多 ,院内感染发病率增高 ,医疗费用
膨胀等[ 1] 。2004年 8月 ,国家卫生部下发了《抗菌药
物临床应用指导原则》 ,对抗菌药物临床使用提出了
严格要求 。为了解我院住院患者抗菌药物使用现状 ,
本文分析了我院 2006年 6月的全部出院病历 ,现就
回顾性调查分析情况 ,报道如下。
1 材料与方法
1.1 资料来源 我院所有临床科室 2006 年 6 月期
间出院患者的所有病历 ,共计 2571份。
1.2 调查方法 详细登记与统计 2571 份病历患者
的姓名 、性别 、年龄 、住院号 、住院科室 、住院天数 、出
院诊断 。然后逐份查阅病历 ,对治疗记录单中长期医
嘱及临时医嘱中的抗菌药物使用情况进行逐一统计
记录 ,内容包括抗菌药物名称 、剂量 、用法 、疗程及是
否有病原学检查和药敏实验(局部用药 、抗结核药及
抗真菌药用药不计)。
中药材商品往往由于采集 、加工 、贮存等因素 ,其
中的DNA都会或多或少的降解 ,较难获得PCR产物。
许多学者在进行植物研究中意想不到地获得真菌的
基因序列 ,如张婷等[ 3] 在药用植物石斛的 PCR-RFLP
鉴别研究中发现干燥时间较长或者商品石斛进行
PCR扩增时仅得到真菌序列。分析主要的原因可能
是:CTAB法和其它相似的DNA提取方法所获得的植
物基因组 DNA不能区别植物和真菌的 DNA;另外 ,在
很多基于分子技术的研究中 PCR引物往往是“通用”
引物 ,扩增结果使得真菌和植物的目的片断均被扩增
出来。植物表面的真菌可以利用不同的表面灭菌技
术去除 ,而植物内生真菌不能应用这种技术除掉 ,应
该尽量应用特异性的 PCR引物 ,从而克服植物内生
真菌的干扰 。本研究中植物总 DNA提取前参照 Ro-
drigues组织培养表面消毒技术去除植物表面的孢子
和菌丝体;另外研究中应用的三对 PCR引物 ,均为被
子植物通用引物 ,可以避免植物内生真菌对 PCR扩
增结果的干扰。
本文利用了 ITS-RFLP 技术鉴别药用植物佛手和
香橼 ,虽然此方法操作简便 、快速 、更利于实际应用 ,
但该方法仅局限于外观形态易混淆的物种 ,需要结合
形态学鉴定方法 。
参考文献:
[ 1]严寒静 , 高晓霞 ,陈晓颖.陈皮总 DNA提取方法的研究[ J] .
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[ 2]曾 明 , 马雅军 ,郑水庆 , 等.中药葛根及其近缘种的 rDNA-
ITS 序列分析[ J] .中国药学杂志 , 2003 , 38(3):173-175.
[ 3]张 婷 , 徐珞珊 , 王峥涛.药用植物束花石斛 、流苏石斛及
其形态相似种的 PCR-RFLP 鉴别研究[ J] .药学学报 , 2005 ,
40(8):728-733. (收稿日期:2006-09-30)
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2007 年 4月
长 春 中 医 药 大 学 学 报
Journal of Changchun University of Traditional Chinese Medicine
Vo1.23
2 , 2007