全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (11): 1113~1119 1113
收稿 2012-10-19 修定 2012-11-07
资助 农业部“948”项目(2003-Z36)。
* 通讯作者(E-mail: mzbao@mail.hzau.edu.cn; Tel: 027-87282435)。
基因型与培养条件对羽衣甘蓝小孢子胚胎发生的影响
戴希刚1,2, 施雪萍1, 包满珠1,*
1华中农业大学园艺林学学院, 武汉430070; 2江汉大学生命科学学院, 武汉430056
摘要: 本文详细地研究了小孢子发育时期、基因型与培养条件对羽衣甘蓝小孢子胚胎发生的影响, 建立了一个稳定、高频
地获得小孢子胚胎的有效体系。结果表明, 不同基因型材料相同大小的花蕾其小孢子发育时期存在很大差异, 需针对不同
基因型材料选取适合大小的花蕾。供试的37个基因型中, 有20个获得了胚状体, 占供试材料的54.1%, 其中基因型‘桃舞’获
得了最高的出胚率, 为123.6个·皿-1。自交系的出胚率比商业品种和F1代杂种的出胚率要低得多, 且自交代数越高, 小孢子
的胚胎发生能力就越弱。在热激培养48 h后加液培养对小孢子的发育能起到积极作用, 向培养基中添加激素和活性炭对小
孢子的胚胎发生无促进作用。
关键词: 羽衣甘蓝; 小孢子培养; 胚胎发生; 基因型; 培养条件
Effects of Genotype and Culture Condition on Microspore Embryogenesis of
Ornamental Kale (Brassica oleracea var. acephala)
DAI Xi-Gang1,2, SHI Xue-Ping1, BAO Man-Zhu1,*
1College of Horticulture and Forestry Sciences, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2College of Life Sci-
ences, Jianghan University, Wuhan 430056, China
Abstract: We have developed an efficient and reliable protocol for deriving microspore embryogenesis in
ornamental kale by evaluating the effects of genotype and culture condition on microspore embryogenesis.
There were significant differences on the microspore development stage in the same size buds of different
genotypes. So the suitable size buds should be selected in view of the different genotypes. Of all the 37
genotypes, 20 genotypes (54.1%) produced embryos. The genotype ‘Peachy Dancing’ showed the highest
embryogenesis frequency with yield of 123.6 embryos per dish. The embryogenesis frequency of inbred lines
was lower than that of commercial cultivar and F1 hybrid, and the embryo yield decreased with increased
generation of inbreeding. Medium addition enhanced embryo yield, and additions of plant growth regulator,
active charcoal or colchicines into NLN medium had no effect on microspore embryogenesis.
Key words: ornamental kale; microspore culture; embryogenesis; genotype; culture condition
羽衣甘蓝(Brassica oleracea var. acephala)是
十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种, 两年生草本
植物, 耐寒性强, 可耐–6 ℃左右低温, 观赏期随低
温期的长短可达4个月, 具有较高的观赏价值。最
近十年已成为我国广大地区冬季及早春时节用于
绿化美化的重要景观植物。羽衣甘蓝属异花授粉
植物, 杂种优势十分明显, 当前生产上广泛应用F1
代杂种。利用游离小孢子培养技术, 在羽衣甘蓝
育种工作上经1~2个有性世代即可获得纯合育种
材料, 从而大大地节省了时间、人力和物力, 缩短
育种周期, 加速育种进程。自从Lichter (1982)首次
成功地在甘蓝型油菜上通过小孢子培养形成植株
以后, 这一技术在许多十字花科植物上得到了不
断的改进和发展。迄今为止, 小孢子培养在芸薹
属的近20种植物上获得成功(Takahata和Keller
1991; Osolnik等1993; Duijs等1992; Dias 2001; 严
准等1999; 何杭军等2004)。羽衣甘蓝游离小孢子
培养在国内己有报道(冯辉等2007; Zhang等2008;
Dai等2009)。但是, 这些报道只是围绕某一或少数
几个因素进行研究, 且小孢子胚产量低, 完善、高
效的羽衣甘蓝小孢子培养体系还没有建立起来。
本文利用一系列不同基因型的羽衣甘蓝来研究小
孢子发育时期、基因型和培养条件对其小孢子胚
胎发生的影响, 以期建立一个稳定、高频地获得
羽衣甘蓝小孢子胚胎的有效体系。
植物生理学报1114
材料与方法
1 试验材料
实验材料包括羽衣甘蓝21个商业品种、10个
自交品种及6个杂交组合。来源及主要特征见表
l。实验材料每年9月上旬播种育苗, 10月初定植大
田, 株行距30 cm, 次年3月抽薹开花, 3月中旬到4
月上旬花期取材。常规田间管理。
表1 37个羽衣甘蓝实验材料的名称、主要特征及来源
Table 1 The name, main character and source of 37 materials of ornamental kale
材料 特征 来源
‘名古屋-红’ 半矮生, 叶卷皱, 心叶红色, 外叶绿色 浙江虹越花卉有限公司
‘名古屋-桃红’ 半矮生, 叶卷皱, 心叶桃红色, 外叶绿色 农友种苗
‘白珊瑚’ 中生, 叶齿裂, 心叶白色, 外叶绿色 浙江虹越花卉有限公司
‘红珊瑚’ 中生, 叶齿裂, 心叶红色, 外叶深绿色 农友种苗
‘东京-白’ 半矮生, 圆叶, 心叶白色, 外叶绿色 浙江虹越花卉有限公司
‘日落’ 茎干高立, 圆叶, 心叶红色, 外叶绿色 浙江虹越花卉有限公司
‘白鸥’ 矮生, 叶缘皱缩, 心叶白色, 外叶绿色 农友种苗
‘红鸥’ 矮生, 叶缘皱缩, 心叶红色, 外叶深绿色 农友种苗
‘大阪-白’ 半矮生, 叶缘波形, 心叶白色, 外叶绿色 农友种苗
‘大阪-红’ 半矮生, 叶缘波形, 心叶红色, 外叶深绿色 农友种苗
‘白舞’ 矮生紧凑, 叶缘波形, 心叶白色, 外叶绿色 农友种苗
‘红舞’ 矮生紧凑, 叶缘波形, 心叶红色, 外叶深绿 农友种苗
‘桃舞’ 矮生紧凑, 叶缘波形, 心叶桃红, 外叶深绿 农友种苗
‘白孔雀’ 中生, 叶深裂, 心叶白色, 外叶绿色 农友种苗
‘红孔雀’ 中生, 叶深裂, 心叶红色, 外叶深绿色 农友种苗
‘朝代-白’ 半矮生, 叶缘波浪形, 心叶白色, 外叶绿色 农友种苗
‘朝代-红’ 半矮生, 叶缘波浪形, 心叶红色, 外叶深绿 农友种苗
‘帝王-桃红’ 矮生, 叶卷皱, 心叶红色, 外叶绿色 农友种苗
‘京华-红’ 包卧, 圆叶, 心叶红色, 外叶深绿色 农友种苗
‘红鹰二号-白’ 半矮生, 叶缘小褶, 心叶白色, 外叶绿色 农友种苗
‘红鹰二号-红’ 半矮生, 叶缘小褶, 心叶红色, 外叶深绿色 农友种苗
Q45 半矮生, 叶卷皱, 心叶红色, 外叶深绿色 ‘名古屋-红’ F2代
Q46 半矮生, 叶微皱, 心叶黄绿色, 外叶绿色 K13-2 (西南农大) F2代
Q1-2 半矮生, 叶微皱, 心叶红到绿色, 外叶绿色 ‘名古屋-红’ F3代
Q11-1 中生, 叶卷皱, 心叶红到绿色, 外叶深绿 ‘名古屋-红’ F3代
Q20-1 半矮生, 叶微皱, 心叶绿色, 外叶深绿色 ‘名古屋-红’ב大阪-白’ F3代
Q28-1 中生, 叶微皱, 心叶红色, 外叶深绿色 K13-2ב名古屋-红’ F3代
Q42 半矮生, 叶卷皱, 心叶黄绿色, 外叶绿色 K17ב名古屋-红’ F3代
Q2003 半矮生, 叶皱褶, 心叶外叶均为深绿 ‘名古屋-红’ב大阪-白’ F5代
Q2704 矮生, 叶散, 缘小褶, 心叶黄绿, 外叶深绿 ‘名古屋-红’ F5代
Q4606 半矮生, 叶卷皱, 心叶红到绿, 外叶绿色 K17 F5代
P1 中生, 叶皱褶, 心叶黄绿色, 外叶深绿色 Q2003×Q2704
P2 中生, 叶散, 缘卷皱, 心叶红到绿, 外叶绿 Q4606×Q2704
P3 中生, 叶卷皱, 心叶红到绿, 外叶绿色 Q2704×Q4606
X18 中生, 叶卷皱, 心叶红色, 径大, 外叶深绿 ‘名古屋-红’DH系ב大阪-红’ DH系
X35 半矮生, 叶微皱, 心叶桃红, 外叶深绿色 ‘桃舞’ב名古屋-红’ DH系
X48 中生, 叶波浪形, 心叶红色, 外叶深绿色 ‘晚霞’ב名古屋-红’ DH系
2 小孢子的分离与培养
自供试植株主花序或一级分支花序上采摘健
康的花序, 选取适当大小的花蕾, 置于灭过菌的三
角瓶中, 用70%酒精进行表面消毒1 min, 再将其浸
泡于0.1% HgCl2溶液中10 min, 然后用无菌水冲洗
3次(每次5 min)。消毒好的花蕾转移到到50 mL圆
底试管中, 加入少量B5 (Gamborg等1968)液体培养
基(含13%蔗糖, 不含激素, pH 5.8), 用玻璃棒碾碎
戴希刚等: 基因型与培养条件对羽衣甘蓝小孢子胚胎发生的影响 1115
花蕾使小孢子释放出来, 小孢子悬浮液用45 μm尼
龙网过滤到10 mL的玻璃离心管中(所有器皿均灭
过菌), 滤液经离心机100×g离心5 min, 弃上清液,
加B5培养基重新悬浮后再以100×g离心5 min, 重复
2次, 直至小孢子悬浮液清澈透明。去上清液后,
用NLN (Lichter 1982)液体培养基悬浮小孢子。
NLN培养基经过0.22 μm过滤器(Nalgene®, 美国)过
滤灭菌。小孢子悬浮液分装到75 mm×15 mm培养
皿中, 每皿6 mL, 小孢子密度保持在4×104个·mL-1
(血球计数板计数), 培养皿以石蜡膜(Parafilm®)封
口。将盛有小孢子悬浮液的培养皿于32.5 ℃下热
激处理48 h后转至25 ℃下黑暗培养, 待出现肉眼
可见的胚状体后, 置于摇床上振荡(60 r·min-1)培养,
4周后统计胚产量。
3 小孢子发育时期对小孢子胚胎发生的影响
以基因型‘名古屋-红’和X35为研究对象。分
别选取大小为2.0~2.5 mm、2.5~3.0 mm、3.0~3.5
mm、3.5~4.0 mm和4.0~4.5 mm的花蕾, 将分离出
的小孢子培养于NLN-16培养基中, 并同时用显微
镜观察各花蕾大小对应的小孢子发育时期情况,
以此来研究小孢子发育时期对胚胎发生的影响。
4 不同基因型对小孢子胚胎发生的影响
为了研究不同基因型的小孢子胚胎发生情况,
将37个基因型的羽衣甘蓝小孢子在含16% (W/V)蔗
糖的NLN培养基(NLN-16)上持续培养3~4个星期。
5 培养条件对小孢子胚胎发生的影响
5.1 加液培养对胚胎发生的影响
将4种基因型‘名古屋-桃红’、‘白舞’、X18和
X35的游离小孢子培养于NLN-16 (含16%蔗糖的
NLN)培养基中, 32.5 ℃热激48 h后, 打开培养皿,
再向每皿中加入等体积的NLN-16或NLN-13 (含
13%蔗糖的NLN)培养基, 之后转移到25 ℃下继续
培养。以没有添加培养基的处理作对照。在本实
验中蔗糖起始浓度为16%的处理再加入等体积的
16%或13%蔗糖培养基称为加液培养。
5.2 激素对胚胎发生的影响
以基因型‘名古屋-红’和P3为研究对象, 将游离
小孢子培养于加有不同浓度(0.05和0.1 mg·L-1)BA的
NLN-16培养基中, 以不加激素的培养基为对照, 分
析激素BA对羽衣甘蓝小孢子胚诱导率的影响。
5.3 活性炭(AC)对胚胎发生的影响
以基因型‘名古屋-红’、‘桃舞’和‘帝王-桃红’
为研究对象, 将游离小孢子培养于添加了浓度为
100、200、300和400 mg·L-1活性炭的NLN-16培养
基中, 以不添加活性炭的NLN-16作对照。活性炭
溶液的配法: 1 g活性炭、0.5 g琼脂糖和100 mL双
蒸水, 灭菌后使用。
6 数据统计分析
小孢子胚胎发生频率即胚产量以每皿出胚的
个数(个·皿-1)计数, 本试验中, 均采用单因素试验,
每个处理设3次重复(每个重复5皿)。所得数据采
用SAS软件进行方差分析与多重比较(LSD法 ,
P<0.05), 以平均值±标准偏差列入表格, 后面所跟
不同小写字母表示数据之间有显著差异。
实验结果
1 小孢子发育时期对小孢子胚胎发生的影响
表2显示了小孢子不同发育时期对其胚胎发
生的影响。在基因型‘名古屋-红’中, 花蕾大小在
3.0~3.5 mm时, 小孢子的发育时期大部分处在单核
靠边期至双核早期, 其小孢子胚胎发生率也最高,
为44.1个·皿-1; 花蕾在2.5~3.0 mm大小时小孢子处
在单核早期到单核中期阶段, 此时的小孢子有一
定的胚胎发生率; 当花蕾大小为2.0~2.5 mm时, 小
孢子大部分在单核早期, 甚至四分体期, 其小孢子
胚胎发生率极低; 花蕾大小为4.0~4.5 mm时, 此时
的小孢子多处双核晚期到三核期, 小孢子的胚胎
发生率也非常低, 仅为0.9个·皿-1。基因型X35中,
小孢子胚胎发生能力最强的花蕾大小为3.5~4.0 mm,
此时的小孢子都处在单核中期到双核早期, 其中
双核靠边期到双核早期的居多; 花蕾在2.0~2.5 mm
时, 小孢子基本都还处在四分体时期, 所以其小孢
子完全没有胚胎发生现象。综合考虑, 羽衣甘蓝
单核中期到双核早期的小孢子胚胎发生率都较高,
应该选择该阶段的小孢子进行游离小孢子培养。
比较两个基因型各不同花蕾大小的小孢子胚胎发
生率的结果表明, 不同基因型材料的相同大小的
花蕾其小孢子发育时期存在很大的差异, 从表1中
可知, 适合基因型X35胚胎发生的花蕾要比适合基
因型‘名古屋-红’的大。因此, 在对羽衣甘蓝进行
游离小孢子培养时, 需针对不同基因型的材料选
取适合大小的花蕾。
2 不同基因型对小孢子胚胎发生的影响
供试材料的基因型被认为是游离小孢子培养
植物生理学报1116
成功与否的最重要的影响因素, 不同基因型小孢
子的胚胎发生能力存在很大差异。不同基因型小
孢子胚胎发生能力结果见表3。在供试的37个羽
衣甘蓝基因型中, 有20个获得了胚状体, 占供试材
料的54.1%。其中不同的基因型间出胚率差异很
大, 胚胎发生能力最强的基因型是‘桃舞’, 其平均
出胚率是123.6个·皿-1, 其次是‘名古屋-红’, 平均出
胚率是53.7个·皿-1。在出胚的这些基因型中, ‘红
鸥’、‘朝代-白’、Q45、P3和X35的胚产量也都较
高, 在20~30个·皿-1左右, 其余基因型的胚产量都较
低。‘东京-白’、‘白孔雀’、Q11-1、Q42和P1的胚
胎发生能力都非常低, 其出胚率都还不足1.0个·皿-1。
在20个出胚的基因型中有12个是商业品种(占商业
品种的57.1%), 4个自交种(占自交种的40%), 4个杂
交组合(占杂交组合的66.7%)。在10个自交种中,
出胚率高的2个基因型Q45和Q46均为F2代自交系,
5个F3代自交系中仅有Q11-1和Q42两个基因型出
胚, 且出胚率极低, 而在3个F5代自交系中均没有见
到胚状体出现。这一现象说明自交代数越高, 其
小孢子胚胎发生能力就越弱。由表3还可以观察
到, 属同一系列的羽衣甘蓝不同品种间小孢子胚
胎发生率也存在很大差异, 如‘名古屋-红’和‘名古
屋-桃红’, ‘白珊瑚’和‘红珊瑚’, ‘白舞’、‘红舞’和
‘桃舞’, ‘朝代-白’和‘朝代-红’等。图1显示6种基因
型的羽衣甘蓝小孢子胚胎发生情况。
3 培养条件对小孢子胚胎发生的影响
3.1 加液培养对胚胎发生的影响
4个不同基因型(X35、‘名古屋-桃红’、X18和
‘白舞’)被用来研究加液培养对胚胎发生的影响(表
4), 在这4个基因型的加液培养中, 向NLN-16中添
加NLN-16 (NLN-16+NLN-16)均对小孢子胚胎发
生表现出积极作用 , 出胚率比对照提高了3~7
倍。虽然在基因型X18中, NLN-16+NLN-13的胚
胎发生反应比NLN-16+NLN-16好, 但是二者之间
没有显著差异, 而且NLN-16+NLN-13的胚胎发生
表2 小孢子发育时期对羽衣甘蓝小孢子胚胎发生的影响
Table 2 Effect of different microspore stage on embryogenesis in ornamental kale
基因型 花蕾长度/mm
小孢子发育时期
胚产量/个·皿-1
四分体 单核早期 单核中期 单核晚、双核早期 双、三核期
‘名古屋-红’ 2.0~2.5 + + 0.2±0.4d
2.5~3.0 + + 17.4±5.9c
3.0~3.5 + 44.1±7.7a
3.5~4.0 + + 25.8±6.8b
4.0~4.5 + 0.9±1.3d
X35 2.0~2.5 + 0b
2.5~3.0 + 0.8±0.8b
3.0~3.5 + + 3.0±0.7b
3.5~4.0 + + 18.6±5.1a
4.0~4.5 + + 1.4±1.7b
同一基因型中同列不同英文字母表示差异显著(P<0.05)。
表3 羽衣甘蓝37个不同基因型的小孢子胚胎发生能力
Table 3 Capacity of microspore embryogenesis in 37 different
genotypes of ornamental kale
基因型 胚产量/个·皿-1 基因型 胚产量/个·皿-1
‘名古屋-红’ 53.7±7.6b ‘红鹰二号-白’ 0f
‘名古屋-桃红’ 2.0±0.8f ‘红鹰二号-红’ 0f
‘白珊瑚’ 5.9±3.2f Q45 24.4±6.7d
‘红珊瑚’ 0f Q46 10.6±4.2e
‘东京-白’ 0.4±0.7f Q1-2 0f
‘日落’ 0f Q11-1 0.2±0.4f
‘白鸥’ 3.3±2.2f Q20-1 0f
‘红鸥’ 33.3±11.8c Q28-1 0f
‘大阪-白’ 0f Q42 0.3±0.5f
‘大阪-红’ 1.4±1.0f Q2003 0f
‘白舞’ 3.0±0.8f Q2704 0f
‘红舞’ 0f Q4606 0f
‘桃舞’ 123.6±16.8a P1 0.7±0.9f
‘白孔雀’ 0.5±1.0f P2 0f
‘红孔雀’ 0f P3 25.4±4.9d
‘朝代-白’ 23.2±3.8d,e X18 1.2±0.8f
‘朝代-红’ 0f X35 19.2±6.1e
‘帝王-桃红’ 3.2±1.3f X48 0f
‘京华-红’ 0f
同列不同英文字母表示差异显著(P<0.05)。
戴希刚等: 基因型与培养条件对羽衣甘蓝小孢子胚胎发生的影响 1117
率在基因型X35、‘名古屋-桃红’和‘白舞’中显著
低于NLN-16+NLN-16, 因此 , 可以认为NLN-
16+NLN-16为羽衣甘蓝小孢子培养最适加液处理
方式。基因型 ‘名古屋 -桃红 ’和X18中 , NLN-
16+NLN-13的胚胎发生反应都明显高于对照NLN-
16, 而在X35和‘白舞’中NLN-16+NLN-13的胚胎发
生率却明显低于对照NLN-16。在基因型X35中试
验了NLN-13+NLN-13的效果 , 结果表明NLN-
13+NLN-13显著低于NLN-16+NLN-16甚至对照。
3.2 激素对胚胎发生的影响
本试验通过在NLN-16培养基中添加不同浓
度的细胞分裂素BA来研究激素对羽衣甘蓝小孢子
胚胎发生的影响, 结果见表5。在两个被试的基因
型(‘名古屋-红’和‘桃舞’)中, 加入0.05和0.1 mg·L-1
的BA后并没有提高小孢子的胚胎发生率, 反而严
重降低了小孢子的胚产量。因此, 向NLN-16中添
加细胞分裂素BA会阻碍小孢子的分裂, 对小孢子
胚胎发生起消极作用。0.1 mg·L-1的BA比0.05
mg·L-1的BA对小孢子的胚胎发生阻碍性更大。
3.3 活性炭对胚胎发生的影响
在NLN-16培养基中添加活性炭(AC)对小孢
子胚胎发生的影响情况见图2。对于基因型‘帝王-
桃红’, 添加AC虽然增加了小孢子的胚胎发生率,
但是与不添加活性炭的对照差异不显著。对于基
因型‘名古屋-红’、‘桃舞’和X35而言, 不管添加多
大浓度的AC都对小孢子的分裂有强烈的抑制作
表4 加液培养对羽衣甘蓝小孢子胚胎发生的影响
Table 4 Effect of medium addition on embryogenesis
in ornamental kale
基因型
加液培养(起始培养
胚产量/个·皿-1
基+添加培养基)
X35 NLN-16 (对照) 17.2±6.2b
NLN-16+NLN-16 51.2±7.1a
NLN-16+NLN-13 3.8±2.3c
NLN-13+NLN-13 0.3±0.5c
‘名古屋-桃红’ NLN-16 (对照) 2.0±1.3c
NLN-16+NLN-16 14.5±4.5a
NLN-16+NLN-13 9.3±3.1b
X18 NLN-16 (对照) 0.8±1.2b
NLN-16+NLN-16 3.5±2.4a
NLN-16+NLN-13 5.3±2.0a
‘白舞’ NLN-16 (对照) 2.8±0.8b
NLN-16+NLN-16 13.3±2.2a
NLN-16+NLN-13 0.5±0.8c
同一基因型中同列不同英文字母表示差异显著(P<0.05)。
用, 且培养出的胚状体质量较差, 部分出现褐化。
因此, 我们认为AC对羽衣甘蓝小孢子胚胎发生并
不起作用, 它对多数羽衣甘蓝基因型的小孢子胚
胎发生反而起抑制作用。
讨 论
1 基因型的影响
芸薹属多种作物小孢子培养研究表明, 游离
小孢子培养的胚胎发生是一个十分复杂的过程,
图1 羽衣甘蓝几种不同基因型的小孢子胚胎发生情况
Fig.1 Microspore embryogenesis in different genotypes of ornamental kale
A: ‘名古屋-红’, B: ‘桃舞’, C: P3, D: ‘朝代-白’, E: ‘红鸥’, F: Q46。所有标尺均为1 cm。
植物生理学报1118
在诱导小孢子胚胎发生中涉及多种外部因素, 如
供体植株生长条件、生理状态及基因型, 培养基
组成和培养条件的影响等。另外, 供体的基因型
也是影响小孢子胚胎发生率的关键性因素。基因
型对小孢子胚状体发生能力的影响作用体现在两
个方面: 一是基因型的反应范围, 二是胚胎发生频
率。不同基因型的供体材料在同样试验条件下,
胚胎发生能力不同。桑玉芳等(2007)在对19个基
因性的甘蓝进行小孢子培养中, 有16份由胚胎发
生, 出胚率在0.30~8.45胚·蕾-1之间, 其中有6个出胚
率低于1。在本试验中, 羽衣甘蓝不同基因型间的
胚胎发生能力有很大差异。在试验的37个基因型
中, 只有20个有胚胎发生, 在这些出胚的基因型中,
最高的123.6个·皿-1, 最低的只有0.3个·皿-1。同一
系列(如‘白舞’、‘红舞’和‘桃舞’)的羽衣甘蓝不同
品种间小孢子胚胎发生率也存在很大差异。在10
个自交种中, 出胚率高的两个基因型均为F2代自交
系, F3代自交种出胚率极低, 而F5代自交种均没有
出胚。这表明自交代数越高, 其小孢子胚胎发生
能力越弱。而自交系的胚胎发生能力又远比其亲
本要差, 如文中Q45、Q1-2、Q11-1相比于其亲本
‘名古屋-红’。自交易导致植物衰退, 当植物连续
自交达3代以上, 会出现发育畸形、生殖能力和结
实率明显下降现象(Aslam等1990), 因此, 我们推断
多代自交使得植物生殖能力退化, 导致植物进行
游离小孢子培养时小孢子分裂能力下降, 因而胚
胎发生能力也随之减弱。因此我们推断羽衣甘蓝
种质越纯合, 其小孢子胚胎发生率就会越低。本
试验中还发现, 由不出胚的F5代自交系经过组配杂
交获得的杂交种(P1、P2和P3)又重新获得了胚胎
发生能力。余凤群和刘后利(1995)的研究也表明
自交系比F1代品种的小孢子胚产量低。小孢子胚
胎发生能力同其他遗传性状一样, 是一种受基因
调控的遗传特性, 张凤兰和高田义人(2001)通过对
甘蓝型油菜小孢子培养胚状体发生能力的研究,
发现胚状体发生能力主要由具加性效应特点的两
个基因位点控制。因此, 有可能通过有性杂交, 将
高反应基因型具有的胚胎发生能力转移到低或无
反应的基因型上, 通过遗传改良的方法扩大易于
小孢子胚胎发生的基因型范围, Chuong和Bevers-
dorf (1985)也曾提出过这一观点。
2 培养条件的影响
Huang等(1990)和陈军等(1995)都报道, 培养2
d后向培养基中添加培养基的“加液培养法”能提高
胚状体诱导频率。我们的实验证实, 加液培养确
实能显著提高小孢子的胚胎发生率。在被试验的
4个基因型中, 通过在NLN-16培养基的基础上添加
NLN-16培养基, 使小孢子出胚率增加了4~7倍。而
在NLN-16培养基的基础上添加NLN-13培养基, 被
试4个基因型中2个增加了出胚率, 2个反而降低了
出胚率, 这可能是由于高浓度水平的蔗糖更有利
于羽衣甘蓝小孢子胚胎发生, 这在我们前期的研
究(Dai等2009)中已被证明。我们认为, 在小孢子
培养过程中释放出有毒物质, 抑制小孢子的分裂,
添加培养基能够稀释有毒物质, 同时还能补充营
养物质, 从而有利小孢子的继续发育。此方法与
我们前期的试验更换培养基(Dai等2009)的原理一
样, 但是它避免了更换培养基中需要重新收集小
孢子而进行的离心环节, 从而不会对小孢子造成
机械损伤。因此, 这进一步证实了更换培养基对
小孢子出胚率有阻碍作用的主要原因应该是更换
表5 BA对羽衣甘蓝小孢子胚胎发生的影响
Table 5 Effect of BA on microspore embryogenesis
in ornamental kale
基因型 BA浓度/mg·L-1 胚产量/个·皿-1
‘名古屋-红’ 0 51.6±10.9a
0.05 8.7±6.3b
0.1 1.5±0.6c
‘桃舞’ 0 119.6±13.3a
0.05 40.5±7.8b
0.1 24.5±2.8c
同一基因型中同列不同英文字母表示差异显著(P<0.05)。
图2 活性炭对羽衣甘蓝游离小孢子胚胎发生的影响
Fig.2 Effect of AC on microspore embryogenesis
in ornamental kale
戴希刚等: 基因型与培养条件对羽衣甘蓝小孢子胚胎发生的影响 1119
培养基时的离心对小孢子造成了伤害。
在一些小孢子培养的研究上, 常强调激素对
诱导小孢子胚胎发生的作用(Charne和Beresdorf
1988; 余凤群和刘后利1995)。然而我们的研究表
明, 添加0.05和0.1 mg·L-1的BA明显地抑制了小孢
子胚胎的发生, 胚产量对比不加激素的对照显著
下降。Lichter (1982)也报导在大白菜小孢子培养
中省去植物生长调节剂可以提高小孢子胚产量。
耿建峰等(2007)在白菜的小孢子培养中, 向培养基
中加入不同浓度的BA, 所有基因型的诱导率都有
降低的趋势, 在低浓度时降低较小, 差异不大, 超
过一定浓度则明显降低。Polsoni等(1988)认为用
不含激素的NLN培养基有利于胚状体的形成和发
育。因此, 我们认为激素不是羽衣甘蓝小孢子胚
胎发生的必要条件, 此结论正与Lionneton等(2001)
在芥菜小孢子培养研究中的结论相似。
诸多报道指出添加活性炭可以吸附有毒物质,
从而促进小孢子的胚胎发生(Dias 1999; Prem等
2008)。Gland等(1988)在油菜小孢子培养中也发现
添加活性炭可促进胚的发育, 有利植株再生, 但不
增加胚产率。然而, 在我们的试验中, 向NLN-16培
养基中添加不同浓度的活性炭后, 均对小孢子的胚
胎发生率不起作用, 对某些基因型反而有明显的抑
制作用。这和韩阳等(2006)的报道相同。这有可能
是由于我们所使用的AC最低浓度100 mg·L-1仍过大
的原因, 因为活性炭不仅能吸附培养过程中材料
释放的有害物质, 同时也能吸附培养基中的必要
元素(Lichter 1989)。这个需要进一步的验证。
参考文献
陈军, 陈正华, 刘澄清, 姚渝光, 张丽华, 关月兰(1995). 甘蓝型油菜
游离小孢子培养的胚胎发生. 遗传学报, 22 (4): 307~315
冯辉, 姜凤英, 冯建云, 王超楠(2007). 羽衣甘蓝游离小孢子培养技
术研究及应用. 园艺学报, 34 (4): 1019~1022
耿建峰, 侯喜林, 张晓伟, 蒋武生, 原玉香, 韩永平, 姚秋菊, 成妍, 李
英(2007). 影响白菜游离小孢子培养关键因素分析. 园艺学报,
34 (1): 111~116
韩阳, 叶雪凌, 冯辉(2006). 大白菜小孢子培养影响因素研究. 中国
蔬菜, 1 (7): 16~18
何杭军, 王晓武, 汪炳良(2004). 芥蓝游离小孢子培养初报. 园艺学
报, 31 (2): 239~240
桑玉芳, 张恩慧, 杨安平, 马超, 许忠民, 程永安, 白延红(2007). 甘蓝
游离小孢子培养中影响胚状体形成的主要因素. 西北农业学
报, 16 (2): 125~129
严准, 田志宏, 孟金陵(1999). 甘蓝游离小孢子培养的初步研究. 华
中农业大学学报, 18 (1): 5~7
余凤群, 刘后利(1995). 供体材料和培养基成份对甘蓝型油菜小孢
子胚状体产量的影响. 华中农业大学学报, 14 (4): 327~331
张凤兰, 高田义人(2001). 甘蓝型油菜小孢子培养胚发生能力的遗
传分析. 华北农学报, 16 (1): 27~32
Aslam FN, Macdonald MV, Loudon P, Ingram DS (1990). Rapid-cy-
cling Brassica species: inbreeding and selection of B. campestris
for anther culture ability. Ann Bot, 65: 557~566
Charne DG, Berersdorf WD (1988). Improving microspore culture as
a rapeseed breeding tool: the use of auxins and cytokinins in an
induction medium. Can J Bot, 66: 1671~1675
Chuong PV, Beversdorf WD (1985). High frequency embryogenesis
through isolated microspore culture in Brassica napus L. and B.
carinata Braun. Plant Sci, 39: 219~226
Dai XG, Shi XP, Fu Q, Bao MZ (2009). Improvement of isolated
microspore culture of ornamental kale (Brassica oleracea var.
acephala): effects of sucrose concentration, medium replace-
ment, and cold pre-treatment. J Hortic Sci Biotech, 84: 519~525
Dias JS (1999). Effect of activated charcoal on Brassica oleracea mi-
crospore culture embryogenesis. Euphytica, 108: 65~69
Dias JS (2001). Effect of incubation temperature regimes and culture
medium on broccoli microspore culture embryogenesis. Euphyt-
ica, 119: 389~394
Duijs JG, Voorrips RE, Visser DL, Custers JBM (1992). Microspore
culture is successful in most types of Brassica oleracea L. Eu-
phytica, 60: 45~55
Gamborg OL, Miller RA, Ojima K (1968). Nutrient requirements
of suspension cultures of soybean root cells. Exp Cell Res, 50:
151~158
Gland A, Lichter R, Schweiger HG (1988). Genetic and exogenous
factors affecting embryogenesis in isolated microspore cultures
of Brassica napus L. J Plant Physiol, 132: 613~617
Huang B, Bird S, Kemble R, Simmonds D, Keller W, Miki B (1990).
Effects of culture density, conditioned medium and feeder cul-
tures on microspore embryogenesis in Brassica napus L. cv.
Topas. Plant Cell Rep, 8: 594~597
Lichter R (1982). Induction of haploid plants from isolated pollen of
Brassica napus. Z Pflanzenphysiol, 105: 427~434
Lichter R (1989). Efficient yield of embryoids by culture of isolated
microspores of different Brassicaceae species. Plant Breed, 103:
119~123
Lionneton E, Beuret W, Delaitre C, Ochatt S, Rancillac M (2001).
Improved microspore culture and doubled-haploid plant regen-
eration in the brown condiment mustard (Brassica juncea). Plant
Cell Rep, 20: 126~130
Osolnik B, Bohanec B, Jelaska S (1993). Stimulation of androgenesis
in white cabbage (Brassica oleracea var. capitata) anthers by
low temperature and anther dissection. Plant Cell Tissue Organ
Cult, 32: 241~246
Polsoni L, Kott LS, Beversdorf WD (1988). Large-scale microspore
culture technique for mutation-selection studies in Brassica na-
pus. Can J Bot, 66 (8): 1681~1685
Prem D, Gupta K, Sarkar G, Agnihotri A (2008). Activated charcoal
induced high frequency microspore embryogenesis and efficient
doubled haploid production in Brassica juncea. Plant Cell Tiss
Org Cult, 93: 269~282
Takahata Y, Keller WA (1991). High frequency embryogenesis and
plant regeneration in isolated microspore culture of Brassica ol-
eracea L. Plant Sci, 74: 235~242
Zhang W, Fu Q, Dai XG, Bao MZ (2008). The culture of isolated mi-
crospores of ornamental kale (Brassica oleracea var. acephala)
and the importance of genotype to embryo regeneration. Sci
Hortic, 117: 69~72