全 文 ：植物生理学通讯 第 46 卷 第 1 期，2010 年 1 月 5
收稿 2009-09-21 修定 　2009-12-22
资助 浙江省重大科技专项(2 008 C02 00 4-1 )。
* 通讯作者(E-mail: ljcheng@zju.edu.cn; Tel: 0571-63742885)。
光皮桦中 4-香豆酸辅酶A连接酶基因Bl4CL的克隆和表达分析
程龙军 *, 童再康, 黄华宏, 楼雄珍
浙江林学院林业与生物技术学院, 浙江临安 311300
提要: 以从光皮桦茎叶组织提取的mRNA为模板, 根据其他已克隆到的阔叶类树种中4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)基因的
同源序列设计兼并引物, 进行RT-PCR扩增, 获得部分基因片段, 然后结合 5’, 3’ RACE方法从光皮桦中扩增出 1个 4CL基
因的全长 cDNA序列, 命名为Bl4CL。该基因 cDNA全长为1 983 bp (GenBank登录号FJ410448), 具有完整的开放阅读框架
(69~1 697 bp), 编码蛋白为 542个氨基酸, 包含一个AMP结合功能域和一个含有 12个氨基酸的功能基序。与其他植物中
的4CL进行同源性比对的结果显示, Bl4CL蛋白与东北白桦的同源性最高, 达到了98%。该基因在光皮桦的根和茎中表达
量较高, 而在花和叶中的表达量低。
关键词: 光皮桦; 4-香豆酸辅酶A连接酶; 基因克隆; 表达
Cloning and Expression Analysis of 4-coumarate: CoA Ligase Gene Bl4CL in
Betula luminifera H. Winkl.
CHENG Long-Jun*, TONG Zai-Kang, HUANG Hua-Hong, LOU Xiong-Zhen
School of Forestry and Biotechnology, Zhejiang Forestry College, Lin’an, Zhejiang 311300, China
Abstract: A 4-coumarate: CoA ligase gene (Bl4CL) was amplified by RT-PCR and 5’, 3’ RACE methods, when
mRNA from stem and leaf of Betula luminifera were used as a template, and the primers were designed
according to the homologous sequences of 4CL from broadleaf species. Sequence analysis showed that Bl4CL
cDNA was 1 983 bp and contained a single open reading frame (69–1 697 bp) encoding a protein of 542 amino
acids (GenBank No. FJ410448). The protein had a motif of 12 amino acids and a functional AMP-binding
domain. The results of homology comparison showed that Bl4CL protein shared a 98% homology with Betula
platyphylla. And the expression of Bl4CL gene were high in roots and stems of Betula luminifera, and low in
leaves and flowers.
Key words: Betula luminifera; 4-coumarate: CoA ligase; gene clone; expression
木质素合成过程中, 4-香豆酸辅酶A连接酶(4-
ceoumarate: CoA ligase, 4CL)是一个关键酶。它通
过苯丙烷途径在木质素合成早期产生单体木质素的
前体 ρ- 香豆酰辅酶 A、咖啡酰辅酶 A、阿魏酰辅
酶A和芥子酰辅酶A等, 进而促进各种木质素单体
的合成。同时, 4CL 催化形成的 ρ- 香豆酰辅酶 A
参与植物次生代谢物黄酮、二苯乙烯类等前体的
合成。鉴于 4CL 基因在植物木质素合成和次生代
谢中都起作用, 其在杨树、松树以及各种模式植物
中都已有了一定程度的研究(Whetten 和 Sederoff
1995; Wagner 等 2009)。在烟草中, 4CL 基因的沉
默大幅降低木质纤维主要构成成分的S型木质素的
含量(Kajita等1997); 而在拟南芥中, 沉默4CL则主
要导致构成微管组分的G型木质素含量的降低(Lee
等 1997)。同样, 4CL 基因的超表达能够提高植物
中木质素的含量, 在由于挤压、弯曲而形成的具高
木质素、低纤维素含量, 称为 “ 压缩木 ”的组织中,
4CL的表达量大大上调, 说明木质素含量的增加与
4CL 基因的表达水平密切相关(Zhang 和 Chiang
1997)。
光皮桦又名亮叶桦, 作为我国的一种材质优
良、在南方广泛分布的珍贵用材树种, 对其材质形
成相关基因的研究很有必要, 因此克隆和分析光皮
桦中木质素合成途径中的基因 4CL 对研究其材质
形成过程中的某些机制及其材质改良可能有一些参
考价值。本文用其他植物中已克隆的 4CL 全长
cDNA 序列, 通过序列同源比对, 根据保守性序列
设计兼并引物, 对从光皮桦茎叶组织中提取的
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mRNA 进行 RT-PCR, 获得基因序列片段后, 再用
RACE-PCR技术得到4CL的 cDNA全长序列, 并对
不同物种之间该基因编码蛋白进行了同源性与进化
分析。此外, 对该基因在光皮桦不同器官中的表达
情况也作了初步研究。
材料与方法
光皮桦(Betula luminifera H. Winkl.)材料取自
本学院光皮桦良种繁育中心苗圃, 取三年树龄的光
皮桦茎叶作为 mRNA 提取材料。
克隆用大肠杆菌 Escherichia coli 5Hα 为本实
验室保存; T4 DNA 连接酶、Taq DNA 聚合酶、
克隆载体 pMD-T为TaKaRa 公司产品; RT-PCR试
剂盒为 Invitrogen 公司产品; 引物由南京金斯特生
物工程技术服务有限公司合成; RACE 试剂盒为
Clone-Tech 产品。
光皮桦茎叶组织中 mRNA 提取采用改进的
CTAB法(候夫云等2008), 取150 mg幼嫩光皮桦茎
叶组织, 于液氮中研磨后用药匙将粉末加入到65 ℃
水浴的 700 mL CTAB (2%)提取液中, 摇动混匀。
然后 65 ℃水浴 20 min 后冷却至室温。加等体积
(700 mL)的氯仿 / 异戊醇(24:1), 混匀, 4 ℃下以
10 000×g 离心 10 min。小心吸取上清液, 重复上述
步骤, 直至中间层无白色絮状沉淀。吸取上清液,
加1/4体积的10 mol·L-1 LiCL, 混合后于4 ℃沉淀过
夜, 然后以 10 000×g 离心 20 min。弃上清液, 用
500 μL RNA溶解液SSTE溶解沉淀, 加等体积氯仿 /
异戊醇混匀(24:1), 4 ℃下以 10 000×g 离心 10 min。
离心吸取上清液, 加2倍体积的无水乙醇, 于-70 ℃
沉淀至少 30 min, 或-20 ℃下沉淀 2 h。4 ℃下以
12 000×g 离心 20 min。去上清, 用 75% 的乙醇洗
2 次, 于 4 ℃下以 12 000×g 离心 5 min, 小心弃去上
清液并吹干沉淀。用 40 μL DEPC 处理的水溶解
沉淀, 得到 RNA 样品。
进行引物合成时, 首先从GenBank数据库中获
得 3 种阔叶树 4C L 基因的编码序列: 欧洲山杨
(Populus tremula L.), 登录号 AF283552; 东北白桦
(Betula platyphylla Suk.), 登录号 AY792353; 桉树
(Eucalyptus camaldulensis Dehnh.), 登录号DQ147001。
用ClawstW软件做多序列比对, 根据序列保守性, 设
计基因保守区的RT-PCR引物 4CL-F和 4CL-R, 序
列为: 4CL-F: 5 AAAGGDGTSATGYTVACDCAC
3; 4CL-R: 5 CCAHCCWTCTTRTCKATBGT 3。
cDNA的合成按反转录合成及 PCR 扩增均参
照试剂盒说明书步骤进行。获得的片段以 T 载体
法克隆PCR产物, 阳性克隆送南京金斯特生物工程
技术服务有限公司测序。测序结果经BLAST检索
序列数据库, 确定所克隆序列为光皮桦 4CL 基因
编码序列。
根据RT-PCR片段的序列测定结果, 合成4CL
和 4CL 特异引物 GSP1 和 GSP2, 分别用于克隆
cDNA 的 5 和 3 端的序列, 序列为: 4CL-GSP1: 5
GCTCATCGTCGTCGTCAATTAAGC 3; 4CL-GSP2:
5 GGAAGCCACGGCAAGCACCATAGACA 3。
5’ RACE和3’ RACE具体步骤均按Clone-Tech
Racer Kit (Clone-Tech)的说明书进行, PCR 产物回
收后经 T载体克隆、测序, 并与已克隆的 4CL 基
因编码区序列拼接, 从而获得全长 cDNA序列。然
后, 以拼接得到的 4CL 全长 cDNA 设计引物, 再用
PCR 扩增, 凝胶电泳分析、测序, 验证所获基因全
长的准确性。4CL全长 cDNA设计引物序列: 4CL-
F’: 5 ATCTCACCAACAAGACCAAACATC 3; 4CL-
R’: 5 ATAATTGAGGAAAGTCGTGGCTGC 3。
分析氨基酸序列及其基本性质时, 用序列在线
处理工具包网站 http://www.bioinformatics.org/sms/
上的 show translation 软件分析推测光皮桦 4CL 基
因编码蛋白质 4CL 的氨基酸组成以及分子量。并
利用推测的蛋白质序列在http://au.expasy.org/tools/
pi_tool.html 上用 Compute pI/MW 工具分析其等电
点(pI); 在 http://www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/
SubLoc/ 进行蛋白质的亚细胞定位分析。
分析 4CL蛋白质的结构特征时, 联网到 http://
www.expasy.ch/cgi-bin/prosite/PSScan.cgi 上, 对
4CL 蛋白质序列进行重要功能基序(motif)的搜寻,
并用 NCBI 上的蛋白质保守功能域推测工具 Con-
served Domain Search在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Structure/cdd/wrpsb.cgi 上分析 4CL 的功能域。
分析光皮桦中 4CL与其他植物中同源蛋白序
列的同源性时, 在 NCBI 上用其 Blast (http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/blast)程序分别将光皮桦的 4CL蛋
白质序列与其他植物的 4CL 蛋白质序列进行同源
比对。并同时用Clustal软件对不同植物的 4CL蛋
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白序列与光皮桦4CL蛋白序列进行多重序列比对,
比较它们之间的同源性。并用 Phylip 软件构建这
些不同植物的4CL基因的进化树, 分析他们之间的
进化关系。
对光皮桦中4CL进行不同组织的表达分析时,
分别用上述方法提取光皮桦叶、茎、花、根组
织中的RNA, 反转录成 cDNA。以 4CL的 cDNA为
模板设计半定量、定量 PCR 引物, 进行该基因的
组织表达特异性分析。其中半定量 PCR 扩增产物
用1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。定量PCR采
用 Applied Biosystems (ABI)公司生产的 7500 型荧
光定量 PCR 进行分析。半定量 RT 引物 4CL-F: 5
CTTGCTGCTCACCCACCCAAACAT 3, 4CL-R: 5
GAGGAAAGTCGTGGCTGCAACGTC 3; 定量RT-
PCR 引物4CL-F: 5 TCGTCGGTAAAGATGCTCAAG
3, 4CL-R: 5 AAAACTGGACCTGCCTCTGTC 3。
结果与讨论
1 光皮桦 4CL基因的克隆和分析
用根据杨树、东北白桦以及桉树 4CL 的序列
保守区域设计的兼并引物 4CL-F 和 4CL-R, 经过
RT-PCR 扩增, 获得一个约 510 bp 的产物, 连接到
T载体上经转化 DH5α后, 挑取阳性克隆测序。测
序结果用NCBI的BLAST程序检索数据库后, 观察
到该序列与杨树、东北白桦以及桉树的同源性都
达到了80%以上, 尤其是与白桦的序列同源程度最
高, 达到 95%。确定该片段为光皮桦的 4CL 基因
片段, 然后用该序列设计5端RACE特异引物4CL-
GSP1和3端RACE特异引物4CL-GSP2, 分别用于
基因 5 端和 3 端序列的扩增。经 5 和 3 RACE 分
别获得约为 1.7 kb 和 750 bp 的 PCR 产物, 克隆测
序的结果表明, 5 和 3 端序列与已获得的光皮桦
4CL编码序列有重叠, 为4CL基因mRNA的 5和3
端序列, 3 个序列经软件拼接, 得到光皮桦 4CL 基
因完整的 cDNA序列, 共1 983 bp, GenBank登录号
为 FJ410448。该基因全长扩增(图 1)和测序的结
果也验证了所获基因的准确性。
2 光皮桦 4CL基因编码蛋白质的分析
分析光皮桦4CL基因的全长 cDNA序列表明,
它的 ORF 有 1 629 bp, 从 cDNA 全长的 69 位到
1 697 位, 编码 542 个氨基酸(图 2), 预测其分子量
为 59.05 kDa, 等电点为 5.848。蛋白质亚细胞定
位预测认定其为细胞质蛋白(reliability index=3; ex-
pected accury=84%)。这与其他模式植物中经研究
认定的 4CL 亚细胞定位结果是相吻合的。而且它
不是分泌蛋白, 不具有信号肽结构。此外, 在进行
保守结构功能域分析的结果显示, 该蛋白质具有一
个 AMP 结合结构功能域, 该结构域为 4CL 蛋白的
一个特征性结构域, 负责催化木质素合成途径中4-
香豆酸和辅酶A的连接, 形成4-香豆酸辅酶A。另
外, 进行序列重要基序的搜寻, 发现光皮桦 4CL 序
列中第 186~197个氨基酸为 4CL的共有基序结构,
它由 12 个氨基酸(LPYSSGTTGLPK)组成。
3 不同物种间 4CL基因的同源性分析
将光皮桦 4CL 基因与另外几个已知 4CL 基因
编码蛋白序列的阔叶树种欧洲山杨(Popular tremula,
AF283 552)、东北白桦(Be tu l a p la typh y l la ,
AY792353)、桉树(Eucalyptus camaldulensis,
DQ147001)和几个双子叶植物树莓(Rubus idaeus,
AF239687)、大豆(Glycine max, FJ770469)、藿
香(Agastache rugosa, AY587891)、烟草(Nicotiana
tabacum, U50845)以及用作模式植物的拟南芥
(Arabidopsis thaliana, NM_104046)进行同源比较
的结果表明, 在核酸水平上光皮桦4CL与阔叶类树
种有很高的一致性。其与东北白桦最高为98%, 与
图 1 光皮桦 4CL 全长 cDNA RT-PCR
产物的琼脂糖电泳图谱
Fig.1 Agrose gel electropherogram of RT-PCR product of
4CL full-length cDNA in B. luminifera
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藿香的最低为 51%, 其余均在 70% 左右。氨基酸序
列的同源性也是与藿香最低为 57%, 与东北白桦的
同源性最高同样是 98% (图 3)。从 Phylip软件构建
的 4CL 基因系统发育树可以看出, 同属桦木科的东
北白桦和光皮桦亲缘关系最近, 二者又与茄科的烟
图 2 光皮桦 4CL 基因的 cDNA序列及由其推测的氨基酸序列
Fig.2 cDNA sequence of 4CL gene and its deduced protein in B. luminifera
用 * 号标出的为终止密码子, 方框内为功能基序的氨基酸序列。
草和桃金娘科的桉树亲缘关系较近, 它们可归为一
类; 欧洲山杨和藿香的亲缘关系也比较近。从进化
树上看, 蔷薇科的树莓和豆科的大豆 4CL蛋白分化
较早, 光皮桦 4CL蛋白与杨树的 4CL蛋白亲缘关系
比较远, 而与烟草和桉树的亲缘关系比较近(图 4)。
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图 3 光皮桦 4CL 蛋白序列及其他植物同源蛋白序列的比较
Fig.3 Comparison of 4CL in B. luminifera and its homologous proteins from other plants
欧洲山杨(P. tremula, AF283552)、东北白桦(B. platyphylla, AY792353)、桉树(E. camaldulensis, DQ147001)、树莓(R. idaeus,
AF239687)、大豆(G. max, FJ770469)、藿香(A. rugosa, AY587891)、烟草(N. tabacum, U50845)、拟南芥(A. thaliana, NM_104046)。
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4 光皮桦不同器官中 4CL基因的表达分析
在半定量RT-PCR分析的结果表明, 光皮桦中
的 4CL 基因在叶、茎、花、根中都有表达, 以
根和茎的表达量为高, 而花和叶中的表达量比较低
(图 5-a)。定量 RT-PCR 与半定量 RT-PCR 的结果
是一致的, 以叶中 4CL 基因的表达量为基准, 该基
因在花中的表达量是叶中的0.89倍, 而根和茎中的
表达量分别是叶中的 5.04倍和 4.59倍(图 5-b)。这
种表达模式同样与 4CL 作为木质素合成途径中关
键酶的功能相一致。
参考文献
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图 4 植物 4CL 蛋白的系统发育树
Fig.4 Phyloenetic tree of 4CL proteins in different plants
图 5 光皮桦 4CL 基因在叶、茎、花、根中的表达分析
Fig.5 Analysis of 4CL gene expression in leaf,
stem, flower and root in B. luminifera