全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (6): 772~778　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0027772
收稿 2014-01-22　　修定 2014-03-27
资助 国家自然科学基金项目(31170261)、教育部科学技术研究
重大项目(313032)和教育部博士点基金优先发展领域项目
(20130031130003)。
* 通讯作者(E-mail: wangnn@nankai.edu.cn; Tel: 022-23504096)。
AtSARK互作蛋白的筛选与鉴定
肖冬, 徐欣欣, 管婧雯, 王宁宁*
南开大学生命科学学院, 天津300071
摘要: 植物LRR型类受体蛋白激酶在植物生命活动中发挥着重要作用。前期研究发现了一个通过生长素和乙烯的协同作
用参与拟南芥叶片衰老过程正调控的类受体蛋白激酶, AtSARK。为深入研究 AtSARK 蛋白的作用机制, 文章采用酵母双
杂交系统, 以AtSARK胞内域(AtSARK-CD)为诱饵蛋白, 对拟南芥均一化cDNA文库进行筛选, 得到83个AtSARK的候选互
作组分, 经过复筛, 初步发现AtSARK的互作组分包括14-3-3蛋白、FKBP-型肽脯氨酰顺反异构酶、醛缩酶超家族成员、
RING/U-box 超家族成员以及WRKY转录因子家族成员。我们对其中一个功能未知的醛缩酶家族基因AtFBA5
(AT4G26530)的表达模式进行了分析, 并用GST pulldown实验证实了AtSARK-CD与 AtFBA5间存在直接的相互作用。At-
SARK互作组分的文库筛选及AtFBA5的分离有利于进一步研究 AtSARK 基因在衰老信号通路中的作用机制。
关键词: AtSARK; 拟南芥; 酵母双杂交; pulldown
Identification of the Interactive Proteins of AtSARK
XIAO Dong, XU Xin-Xin, GUAN Jing-Wen, WANG Ning-Ning*
College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071, China
Abstract: Lucine-rich-repeat receptor-like kinases (LRR-RLKs) are known to function in various signaling
pathways in plants. Our previous study suggested a role for an Arabidopsis LRR-RLK, AtSARK, which regu-
lates leaf senescence through synergistic actions of auxin and ethylene. This study was designed to identify the
interaction partners of AtSARK. A normalized Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) cDNA library was screened
by the yeast two hybrid screening method with the cytoplasmic domain of AtSARK (AtSARK-CD) as bait, and
83 candidate preys were identified. We confirmed five proteins (14-3-3 protein, FKBP peptidyl-prolyl cis-trans
isomerase family protein, Aldolase superfamily protein, RING/U-box superfamily protein and a member of the
plant WRKY transcription factor family) as the AtSARK interaction partners in yeast. Furthermore, we ana-
lyzed the expression pattern of AtFBA5 (AT4G26530), a function unknown gene of Aldolase superfamily, and
confirmed the physical interaction between AtSARK-CD and AtFBA5 by an in vitro pulldown assay. The sepa-
ration of AtSARK-interacting proteins is beneficial to disclose the mechanism of AtSARK in leaf senescence
process.
Key words: AtSARK; Arabidopsis thaliana; yeast two hybrid system; pulldown
植物叶片衰老是一个重要的发育阶段, 对调
节营养分配, 提高植物对环境的适应能力十分重
要(Lohman等1994)。植物叶片的衰老的发生受到
内部发育信号和外部各种环境因子的协调控制
(Guo和Gan 2005; Zhang和Zhou 2013)。尽管人们
这些年做了许多关于叶片衰老的分子机制的研究
(van Doorn 2008; Zhang等2012), 但不同因素引发
的衰老信号是如何通过不同的信号通路传递进而
控制衰老的发生和发展的问题还远未弄清。
植物类受体蛋白激酶(receptor-like protein ki-
nases, RLKs)是一类包含胞外域、单次跨膜域和胞
内激酶域的蛋白分子, 在植物多种发育过程中发
挥重要作用(Lindner等2012)。在前期研究中, 我们
分离鉴定了拟南芥的衰老上调表达的LRR型类受
体蛋白激酶基因AtSARK, 该基因编码一个丝、苏
氨酸和酪氨酸双底物特异性的蛋白激酶, 诱导过
表达该基因会引起拟南芥叶片早衰, 并且发现At-
SARK通过生长素和乙烯的协同作用参与拟南芥
叶片衰老过程(Xu等2011)。但是, 关于AtSARK介
导的信号传递及其调控的细节尚不清楚。因此,
筛选与AtSARK相互作用的蛋白质, 探明该基因在
肖冬等: AtSARK互作蛋白的筛选与鉴定 773
叶片衰老进程中的作用机制具有重要的科学理论
意义。
AtSARK是一个定位于细胞膜的类受体蛋白
激酶(数据未发表), 我们以AtSARK的胞内域为诱
饵蛋白, 利用酵母双杂交的方法, 在拟南芥均一化
cDNA文库中筛选互作组分。经过层层筛选并结
合测序分析, 得到83个AtSARK的候选互作组分,
经过复筛, 初步发现AtSARK的互作组分包括14-
3-3蛋白、FKBP-型肽脯氨酰顺反异构酶、醛缩酶
超家族成员、RING/U-box超家族成员以及WRKY
转录因子家族成员。接着我们对其中一个功能未
知的醛缩酶家族基因AtFBA5 (AT4G26530)的表达
模式进行了分析, 并用GST Pulldown实验证实了
AtSARK-CD与 AtFBA5间存在直接的相互作用。
材料与方法
1 试验材料
酵母菌株 AH109, 大肠杆菌菌株DH5α、Ro-
setta (DE3), 以及质粒pGBKT7、pGADT7、pGB-
KT7-53、pGBKT7-lam、pGADT7-T、pGEX6p-1
和pET22b为本实验室保存; 拟南芥(Arabidopsis
thaliana)均一化cDNA文库购自Clontech公司。
2 酵母双杂交
2.1 pGBKT7-AtSARK-CD诱饵载体构建及转化
酵母
以含有 AtSARK基因的 pMD18-T-AtSARK 载体
为模板, 以带有EcoRI酶切位点的序列 SARKCD-F
(5′-GAATTCATCCTTA ACTTAAA CGAT-3′)和带有
SalI 酶切位点的序列SARKCD-R (5′-GTCGAC T C-
TT GGACCGGATAGTTC-3′)为引物, 用DNA聚合
酶Ex-Taq (TaKaRa)进行 PCR 扩增。 产物回收加T
载体连接, 转化大肠杆菌, 酶切鉴定并测序, 将测
序正确的克隆载体用EcoRI和SalI酶切, 分离目的
片段和用EcoRI和SalI酶切的pGBKT7载体片段连
接。连接产物转化大肠杆菌, 筛选阳性克隆进行
酶切鉴定, 并测序。鉴定正确后用PEG/LiAc方法
转化酵母菌株AH109。
2.2 诱饵蛋白的自激活鉴定
将质粒p G B K T 7 - A t S A R K - C D转化酵母
AH109, 将转化物涂布在SD/–Trp平板上, 生长2~3
d, 将阳性克隆划线于SD/–Trp–Ade平板上, 30 ℃培
养 2 d 后观察。以共转化质粒组合pGBKT7-53和
pGADT7-T的AH109转化子为正对照, 以共转化质
粒组合pGBKT7-lam和pGADT7-T的AH109转化子
为负对照。
2.3 酵母双杂交及初步鉴定
将转化有pGBKT7-AtSARK-CD质粒的酵母
AH109单克隆接种于50 mL SD/–Trp液体培养基,
培养16~20 h, 至OD600达到0.8。离心收集菌体沉
淀, 用4~5 mL SD/–Trp液体培养基重悬, 使得菌浓
度大于1×108; 将1 mL拟南芥cDNA文库(Clontech,
已转入Y187菌株)与诱饵菌混合于2 L锥形瓶中, 加
入45 mL 2×YPDA 培养基, 30 ℃培养20~24 h, 缓
慢摇晃(30~50 r·min-1)。20 h后, 镜检观察接合情
况。镜检通过后 , 收集菌液 , 离心后用10 mL
0.5×YPDA培养基重悬, 并涂布于SD/–Trp–Leu–Ade
三缺培养基上。取部分接合产物, 稀释后涂布于
SD/–Trp–Leu双缺培养基上, 检测筛选的文库克隆
数。将三缺培养基上生长的阳性克隆转移到用四
缺培养基(SD/–Trp–Leu–Ade–His+1 mmol·L-1
3-AT)鉴定杂交结果。从四缺培养基上生长的阳性
菌落中分离互作基因。
3 Pulldown验证实验
3.1 AtFBA5基因克隆和原核表达载体构建
以拟南芥cDNA为模板, 用带有BamHI酶切位
点的序列 ATFBA5-F (5′-GGATCCGATGTCTGC T-
TTTGTCGGC-3′)和带有XhoI 酶切位点的序列
ATF BA5-R (5′-CTCGAGATACTTGTATC CTTC-
CTC-3′)为引物, 用DNA聚合酶Ex-Taq (TaKaRa)进
行 PCR 扩增。产物回收加T载体连接, 转化大肠杆
菌, 酶切鉴定并测序。将AtSARK-CD与钓到的AtF-
BA5基因的中间载体分别用EcoRI和SalI及 BamHI
和XhoI进行双酶切。将AtSARK-CD片段插入到
pGEX6p-1载体, 将AtFBA5片段插入pET22b载体。
3.2 AtFBA5的表达分析
利用AtGenExpress Visualization Tool (http://
jsp.weigelworld.org/expviz/expviz.jsp)提供的芯片
数据研究AtFBA5在拟南芥(Arabidopsis thaliana)莲
座叶中的表达情况, 收集17 d苗龄拟南芥第2、4、
6、8片莲座叶的AtFBA5的表达数据。
检测过表达AtSARK转基因拟南芥的转录本芯
片数据和过表达SSPP (Senescence Suppressed Pro-
植物生理学报774
tein Phosphatase)转基因拟南芥的转录本芯片数据
中AtFBA5的转录变化情况。AtSARK芯片数据的
实验材料为DEX (dexamethasone)诱导的5 d苗龄的
GVG:AtSARK 转基因拟南芥和mock (乙醇, DEX的
溶剂)处理的GVG:AtSARK转基因拟南芥。SSPP转
基因拟南芥芯片数据的实验材料为37 d苗龄的
35S:SSPP转基因拟南芥和野生型拟南芥的第3和4
片莲座叶。
总RNA提取、cDNA合成和基因表达分析参
照已发表文献描述(Liu等2010)。用于分析的内标
基因是TIP41-like, 用引物rtTIP-F (5′-GTATGAA-
G AT G A A C T G G C T G A C A AT- 3 ′ )和 r t T I P - R
(5′-GAAATTCAGGAGC AAGCCGT CTCAG-3′)进
行扩增; AtFBA5的检测引物为rtFBA5-F (5′-CCTC-
TA C C A G A A A A C C A C G G - 3 ′ )和 r t F B A 5 - R
(5′-CTGCTAGATCAACCA CA CC C-3′)。实验进行
3次生物学重复, 给出的为典型结果。
3.3 蛋白纯化和pulldown验证
将原核表达载体转化Rosetta (DE3)菌株, 参考
GE公司的说明手册用Glutathione Sepharose 4B
column (GE Healthcare) 进行蛋白纯化。
参考Zhang和Zhou (2013)方法进行pulldown实
验, 略有改动。将结合了GST-AtSARK-CD或GST的
珠子用PBS (0.14 mol·L-1 NaCl、2.7 mmol·L-1
KCl、10.1 mmol·L-1 Na2HPO4和1.8 mmol·L
-1 KH2PO4)
充分洗净, 做GST pulldown的准备。每个反应中加
入大约30 μg ATFBA5-His蛋白, 当加入带有GST融
合蛋白的珠子后, 混合物在4 ℃条件下轻摇1 h。之
后用PBS洗5次, 将蛋白洗脱。加入2×loading buffer
(100 mmol·L-1 Tris-HCl, pH 6.8; 200 mmol·L-1 DTT,
4% SDS, 20%甘油和0.2%溴酚蓝) 并沸水浴10
min。进行12% SDS-PAGE电泳, 用His抗体进行免
疫印记实验, 检测His融合蛋白。
实验结果
1 酵母双杂交筛选拟南芥cDNA文库中AtSARK的
互作组分
为了筛选AtSARK的互作组分, 我们首先构建
了AtSARK基因胞内域片段(AtSARK-CD)的诱饵载
体, pGBKT7-AtSARK-CD (图1-A)。将诱饵载体转
入酵母菌株AH109中, 挑转化子于SD/–Trp–Ade平
板上进行自激活检测。结果可见(图1-B), 正对照
能在自激活检测平板上正常生长, 而转化诱饵载
体的菌株和负对照一样, 不能在自激活检测平板
上生长, 说明AtSARK-CD没有自激活活性, 可以作
为诱饵蛋白用于文库筛选。
将携带诱饵表达载体pGBKT7-AtSARK-CD
的AH109诱饵菌株和携带cDNA文库的Y187猎物
菌株接合转化, 镜检确认接合子形成后(图2-A), 取
少量转化液稀释10 000倍涂布于SD/–Trp–Leu培养
基(图2-B), 长出了5个阳性菌落, 由于涂布的体积
为50 μL, 收集的转化液体积为10 mL, 说明本次实
验筛选了1.0×107个文库克隆, 高于文库说明书中
要求的1.0×106的标准。其余转化液则涂布于SD/–
Trp–Leu–Ade培养基进行初筛。挑出初筛得到的
阳性克隆转移至SD/–Trp–Leu–Ade–His+1 mmol·L-1
3-AT培养基继续筛选(图2-C)。经过筛选, 共获得
233个阳性克隆。
将获得的233个克隆分别提取质粒回转大肠
杆菌, 筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子, 即含有
文库质粒的转化子。从该转化子中提取质粒后直
接送测序, 排除含有相同基因的阳性克隆, 一共获
得了83个AtSARK-CD的候选互作组分。结合文
献, 挑选5个目标基因(表1)进行复筛。将对应克隆
的猎物质粒与pGBKT7-AtSARK-CD共转化进入
AH109中, 用三缺平板(SD/–Trp–Leu–Ade)和含有
X-α-Gal的四缺平板(SD/–Trp–Leu–Ade–His+1
图1 诱饵载体构建和诱饵蛋白自激活特性检测
Fig.1 Construction of the bait vector pGBKT7-AtSARK-CD
and identification of auto-activation for bait protein AtSARK-CD
A: pGBKT7-AtSARK-CD质粒酶切检测。M: DNA分子标记
DL2000; 1: 未经酶切的对照质粒pGBKT7-AtSARK-CD; 2: EcoRI
和SalI双酶切质粒pGBKT7-AtSARK-CD。B: 在 SD/–Trp–Ade培
养基上画线培养。+和-: 阳性和阴性质粒对照组合pGBKT7-53/
pGADT7-T和pGBKT7-lam/pGADT7-T的转化子; CDBD: 质粒
pGBKT7-AtSARK-CD的转化子。
肖冬等: AtSARK互作蛋白的筛选与鉴定 775
mmol·L-1 3-AT)进行复筛。结果表明这5个目标克
隆的转化子都能在选择培养基上正常生长(图3)。
2 拟南芥醛缩酶基因AtFBA5的表达分析
表1中的3号克隆测序后进行BLAST比对(图
4-A), 发现它与大豆(Glycine max)、蒺藜苜蓿
(Medicago truncatula)的醛缩酶(fructose-bisphos-
phate aldolase)高度同源, 相似度分别达到87%和
86%; 与拟南芥AtFBA6的相似度达到78%, 属于拟
南芥醛缩酶超家族中的AtFBA5 (AT4G26530)。由
于该基因的功能未知, 我们首先利用AtGenExpress
Visualization Tool (Schmid等2005)对该基因在植物
发育中的表达情况进行了预测。图4-B表明, 在17
d苗龄的拟南芥中, AtFBA5的表达量在幼叶中相对
较高, 随着叶龄的增大而逐渐下降。接着我们分
别分析了过表达AtSARK转基因拟南芥的转录本芯
片数据和过表达SSPP (Senescence Suppressed Pro-
tein Phosphatase)转基因拟南芥的转录本芯片数据
表1 AtSARK-CD 相互作用蛋白信息
Table 1 The information of the interaction partner of AtSARK-CD
基因编号 基因描述
#1 14-3-3家族, 多功能分子伴侣。具有结合磷酸化蛋白的能力——选择性的与磷酸化蛋白非共价结合
#2 FKBP-型肽脯氨酰顺反异构酶
#3 醛缩酶超家族。推测它在糖酵解作用中催化1,6-二磷酸果糖与磷酸二羟丙酮及甘油醛-3-磷酸的相互转变
#4 RING/U-box 超家族。蛋白质降解相关路径发挥作用
#5 WRKY转录因子家族成员, 参与植物抗病响应过程

图2 酵母双杂交转化及阳性克隆的生长。
Fig.2 Yeast mating and growth of positive clones
from yeast two-hybrid
A: 对转化诱饵载体的AH109菌株和携带文库的Y189菌株的
接合产物进行镜检, 箭头指示典型酵母合子,标尺长度20 μm; B:
接合产物稀释10 000倍取50 μL涂布于SD/–Trp–Leu培养基, 30 ℃
条件下生长4 d; C: 阳性克隆在SD/–Trp–Leu–Ade–His+1 mmol·L-1
3-AT培养基上生长。
图3 单个文库质粒与诱饵载体酵母双杂交结果
Fig.3 Yeast two-hybrid assay for candidate preys and bait
A: 阳性克隆在SD/–Trp–Leu–Ade培养基上生长, -: 阴性质粒
对照组合pGBKT7-lam/pGADT7-T的转化子; B: 阳性克隆在SD/–
Trp–Leu–Ade–His+1 mmol·L-1 3-AT+X-α-Gal培养基上生长, +和-:
阳性和阴性质粒对照组合pGBKT7-53/pGADT7-T和pGBKT7-lam/
pGADT7-T的转化子。
植物生理学报776
中AtFBA5的转录变化情况 (图4-C和D)。诱导At-
SARK的过表达会引起植物早衰, 相反的, 过表达
SSPP会延缓植物的衰老(徐凡2012)。我们发现
AtFBA5的转录本在AtSARK的过表达植株中大幅
度下降, 而在SSPP过表达转基因拟南芥中的积累
量则明显增多(图4-C和D)。
进一步, 我们用real-time PCR的方法检测了
AtFBA5在叶片发育过程中的表达变化, 与芯片分
析的结果一致, AtFBA5的转录水平在幼叶中最高,
随着叶片衰老, AtFBA5的表达量逐渐下降(图5)。
这些结果说明AtFBA5的转录水平受到衰老进程的
抑制, 这种趋势与AtSARK的转录水平在叶片发育
中随着衰老发生而逐渐升高的趋势是相反的(Xu
等2011), 暗示着AtFBA5在叶片发育过程中起着与
AtSARK相反的功能。
3 AtFBA5与AtSARK-CD体外互作的pulldown验证
为了进一步验证AtFBA5与AtSARK-CD的相
互作用。我们以拟南芥cDNA为模板, 克隆了AtF-
BA5全长基因, 并分别构建了AtFBA5和AtSARK-
CD的原核表达载体(见材料与方法3.1)。将GST、
GST-AtSARK-CD和AtFBA5-His融合蛋白在大肠
杆菌内诱导表达, 采用亲和层析柱(珠子)纯化融合
蛋白(见材料与方法3.3)。以GST-AtSARK-CD或
GST (负对照)为挂柱蛋白, 利用GST pulldown方法
下拉过柱体系中的蛋白AtFBA5-His, 结果(图6)发
现AtFBA5-His蛋白能被GST-AtSARK-CD下拉出
图4 AtFBA5的氨基酸序列分析和AtFBA5基因在叶片发育中的表达模式
Fig.4 Amino acid sequence analyses of AtFBA5 and the expression pattern of AtFBA5 in leaf development
A: AtFBA5的氨基酸序列分析。将AtFBA5 (AT4G26530)、AtFBA6 (AT2G36460)、大豆(Glycine max) GmFBA (NP_001237315.1)和
蒺藜苜蓿(Medicago truncatula) MtFBA (XP_003617895.1)的氨基酸序列用clustal X2软件分析, 用DNAMAN软件出图; B: AtFBA5在17 d苗
龄拟南芥的莲座叶中的表达情况。基因芯片数据来源于AtGenExpress Visualization Tool (http://jsp.weigelworld.org/expviz/expviz.jsp); C:
AtFBA5在DEX诱导过表达AtSARK的转基因拟南芥中的表达情况; D: AtFBA5在35S:SSPP 过表达拟南芥中和野生型拟南芥表达情况的比较。
图5 AtFBA5在拟南芥叶片衰老过程中的表达分析
Fig.5 Expression of AtFBA5 during leaf
senescence in Arabidopsis
定量RT-PCR分析AtFBA5在衰老过程中的表达情况。用
TIP41-like基因作为RT-PCR的内标基因。图中YL: 幼叶; ML: 成熟
叶; ES: 衰老早期阶段叶片; LS: 衰老晚期阶段叶片。
肖冬等: AtSARK互作蛋白的筛选与鉴定 777
来, 而不能被对照GST蛋白下拉, 这说明AtFBA5与
AtSARK-CD间存在直接的相互作用。
讨　　论
叶片衰老是叶片发育的最后阶段, 它是一个
受到多种发育和环境信号调控的程序性细胞死亡
过程(Lim等2007)。衰老程序的启动、传递、衰老
进程的控制以及内外部调控因子之间的相互作用
机制等已经成为研究热点。然而, 衰老起始信号
的本质却依然是一个未回答的问题, 并且引起衰
老起始的不同的信号途径也有待于进一步的阐
明。真核生物中, 蛋白激酶和蛋白磷酸酶介导的
蛋白磷酸化-去磷酸化作用在调控信号传导方面十
分重要。近年来的研究表明, 在引起植物叶片衰
老的不同刺激因素所诱发的各种信号途径中, 蛋
白激酶同样发挥着重要的作用(Lee等2011; Cho等
2012; Gao等2012)。
拟南芥类受体蛋白激酶基因AtSARK是我们在
前期工作中发现的直接参与调控叶片衰老过程的
RLK基因, 诱导表达该基因会引起叶片早衰, 而该
基因的缺失突变体则表现出晚衰表型(Xu等2011)。
对其作用机制的研究发现, AtSARK是通过生长素
和乙烯的协同作用来发挥对叶片衰老过程正调控
的作用(Xu等2011)。为进一步研究AtSARK的功
能, 本研究以AtSARK的胞内域为诱饵蛋白, 通过
酵母双杂交的方法筛选AtSARK的互作组分。初
步的结果表明, AtSARK的互作组分包括14-3-3蛋
白、FKBP-型肽脯氨酰顺反异构酶、与病原菌诱
导相关的转录因子WRKY蛋白、以及与蛋白质降
解相关的E3连接酶等。
14-3-3蛋白由Moore和Perez最早发现, 几乎在
所有真核生物中都存在的一类蛋白(van Hemert等
2001)。通过与靶蛋白结合, 14-3-3蛋白可以增强或
抑制靶蛋白的催化活性, 如拟南芥钙依赖蛋白激
酶家族的CPK1能被14-3-3所激活 (Camoni等
1998)。此外, 14-3-3还起着保护靶蛋白不受降解的
作用, 以及调节靶蛋白的核质转运与亚细胞定位
的作用(Cotelle等2000; Ryu等2007)。我们预测在
拟南芥中, 14-3-3蛋白可以通过与AtSARK的互作
来调控AtSARK的活性, 从而参与到AtSARK调控
的衰老信号通路中。FKBP-型肽脯氨酰顺反异构
酶是一类是催化折叠反应的酶。在含脯氨酸残基
的蛋白质分子中, 由于空间结构的立体化学制约,
在蛋白折叠时, 某些脯氨酸亚氨基的肽键必须异
构化为顺式才能形成蛋白质的天然空间结构。最
新的报道发现脯氨酸异构酶CYP20-2通过调控
BZR1 (BRASSINAZOLE-RESISTANT1)的构象影
响其对拟南芥开花调控的功能(Zhang等2013)。因
此我们预测FKBP-型肽脯氨酰顺反异构酶的作用
与14-3-3蛋白类似, 可能起着调控AtSARK活性的
功能。WRKY转录因子在植物界中广泛存在, 并
且是植物当中一类比较大的转录因子家族; 其中
与病原菌诱导相关的WRKY转录因子是WRKY转
录因子大家族中的一类, AtSARK与之互作暗示着
AtSARK除了参与叶片发育的调控过程, 也参与了
植物对病原物的响应过程。文库筛选还发现At-
SARK能与E3连接酶相互作用, 暗示着AtSARK的
降解路径之一是通过泛素连接酶介导的蛋白酶体
途径降解。
此外, 我们筛选到一个编码醛缩酶家族未知
图6 AtSARK-CD和AtFBA5间存在互作
Fig.6 A pull-down assay showing the interaction between
AtSARK-CD and AtFBA5
将纯化的AtFBA5-His蛋白分别与结合有GST-AtSARK-CD或
GST的琼脂糖珠子孵育。反应后洗脱的蛋白经12% SDS-PAGE电
泳分离, 进行考马斯蓝亮蓝染色(上图), 或用His抗体进行免疫印迹
检测(下图)。
植物生理学报778
功能蛋白质的基因 AtFBA5 (AT4G26530)。通过发
掘芯片数据, 我们发现该基因的表达在幼叶中较
高, 而在老叶中较低, 呈现出随叶龄增大而表达下
降的特点(图4-B~D和图 5)。由于AtSARK的表达模
式是随衰老而上调的, 因此我们推测AtFBA5在植
物发育过程中具有与AtSARK相反的作用。而它们
的互作可能反映了相反功能的内在的作用机制。
进一步, 我们通过pulldown实验证明AtFBA5与At-
SARK间能够发生直接的相互作用(图6)。后期我
们将研究AtFBA5的生物学功能, 尤其是它在At-
SARK介导的叶片衰老路径中发挥的作用。
参考文献
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