全 文 ： Ｇｕｉｈａｉａ Ｊａｎ. ２０１６ꎬ ３６(１):１２１－１２６
ｈｔｔｐ: / / ｊｏｕｒｎａｌ.ｇｘｚｗ.ｇｘｉｂ.ｃｎ
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ＤＯＩ: １０.１１９３１ / ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０１４１２０５２
曹华苹ꎬ吴道铭ꎬ甘海华ꎬ等. 铝胁迫对拟南芥根尖 ＡｔＰＩＮ２蛋白表达活性的影响[Ｊ]. 广西植物ꎬ ２０１６ꎬ ３６(１):１２１－１２６
ＣＡＯ ＨＰꎬＷＵ ＤＭꎬＧＡＮ ＨＨꎬｅｔ ａｌ. Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｌｕｍｉｎｕｍ ｓｔｒｅｓｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＩＮ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ａｐｉｃａｌ ｒｏｏｔｓ[Ｊ]. Ｇｕｉｈａｉａꎬ ２０１６ꎬ ３６
(１):１２１－１２６
铝胁迫对拟南芥根尖 ＡｔＰＩＮ２蛋白表达活性的影响
曹华苹ꎬ 吴道铭ꎬ 甘海华ꎬ 沈 宏∗
( 华南农业大学 农学院ꎬ 广州 ５１０６４２ )
摘 要: 铝胁迫能影响根尖生长素的运输ꎬ这与生长素运输载体密切相关ꎬＰＩＮ２作为根尖生长素的运输蛋白ꎬ
其独特的组织定位可能诱导 ＰＩＮ２蛋白参与了铝调节生长素的运输过程ꎮ 该研究以拟南芥 ＰＩＮ２ 缺失突变体
(ｐｉｎ２)、ＰＩＮ２□∷□ＧＦＰ融合体及其野生型(ＷＴ)为材料ꎬ应用激光扫描共聚焦显微技术ꎬ研究铝处理对拟南
芥根尖生长素运输蛋白 ＰＩＮ２的表达活性、蛋白在组织及亚细胞水平分布及其对铝内置化作用的影响ꎮ 结果
表明:短期铝处理或低铝浓度能明显增加拟南芥根尖细胞 ＰＩＮ２蛋白表达活性ꎬ而长期铝处理或高铝浓度抑制
其表达活性ꎻ以 １００ μｍｏｌＬ￣１ ＡｌＣｌ３处理 ４ ｈ的蛋白表达活性最高ꎮ 蛋白印迹反应发现ꎬ铝处理促进 ＰＩＮ２蛋白
在细胞膜上累积ꎬ减少胞内囊泡中 ＰＩＮ２蛋白的含量ꎻ囊泡运输抑制剂(ＢＦＡ)能抑制铝诱导 ＰＩＮ２蛋白的分配ꎮ
铝胁迫增加拟南芥根尖细胞 Ｈ２Ｏ２累积ꎬｐｉｎ２的 Ｈ２Ｏ２累积量大于 ＷＴꎬ而相对根长小于 ＷＴꎮ Ｍｏｒｉｎ染色结果显
示ꎬｐｉｎ２的铝内置化显著小于 ＷＴꎮ 上述研究表明ꎬＰＩＮ２蛋白在 １００ μｍｏｌＬ￣１ ＡｌＣｌ３处理条件下活性最高ꎬ细
胞膜累积程度加强ꎬ铝内置化能力增强ꎬ从而调节根系的生长发育ꎮ 该研究结果进一步为铝抑制生长素的运
输机制提供了理论基础ꎮ
关键词: 铝胁迫ꎬ 拟南芥ꎬ ＡｔＰＩＮ２ꎬ 表达活性
中图分类号: Ｑ９４５.７８ 文献标识码: Ａ 文章编号: １０００￣３１４２(２０１６)０１￣０１２１￣０６
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｌｕｍｉｎｕｍ ｓｔｒｅｓｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＩＮ２
ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ａｐｉｃａｌ ｒｏｏｔｓ
ＣＡＯ Ｈｕａ￣Ｐｉｎｇꎬ ＷＵ Ｄａｏ￣Ｍｉｎｇꎬ ＧＡＮ Ｈａｉ￣Ｈｕａꎬ ＳＨＥＮ Ｈｏｎｇ∗
( Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６４２ꎬ Ｃｈｉｎａ )
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｈｅｒｅ ｉｓ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ Ａｌ￣ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ａｕｘｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｎｄ ａｕｘｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ. ＰＩＮ２ ｉｓ ａｎ ａｕｘｉｎ
ｅｆｆｌｕｘ ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎꎬ ｉｔ ｕｎｉｑｕｅ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｍａｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ Ａｌ￣ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ａｕｘｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ. Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙꎬ ｕｓｉｎｇ ｐｉｎ２ꎬ
ＰＩＮ２□∷□ＧＦＰ ａｎｄ ＷＴ ａｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓꎬ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｌ ｓｔｒｅｓｓ ｏｎ ＰＩＮ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙꎬｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ
Ａｌ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｓｈｏｒｔ￣ｔｅｒｍ Ａｌ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｒ ｌｏｗ Ａｌ ｌｅｖｅｌ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＩＮ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ａｐｉｃａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓꎬ ｗｈｉｌｅ ｌｏｎｇ￣ｔｅｒｍ
Ａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｒ ｈｉｇｈ Ａｌ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｉｔ. Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＩＮ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅａｃｈｅｄ ｔｈｅ ｍａｘｉｍａｌ ｖａｌｕｅ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ １００
μｍｏｌＬ￣１Ａｌ ｆｏｒ ４ ｈ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ Ｗｅｓｔｅｒｎ￣ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ Ａｌ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｈｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＩＮ２
ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｎ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅꎬ ｗｈｉｌｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｉｔ ｉｎ ｖｅｓｉｃｌｅｓ. Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ (ＢＦＡ)ꎬａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｖｅｓｉｃｌｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ
Ａｌ￣ｉｎｄｕｃｅｄ ａｌｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＩＮ２ ｐｒｏｔｅｉｎ. Ｏｎ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｈａｎｄꎬ Ａｌ ｓｔｒｅｓｓ ｃｏｕｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈ２Ｏ２ ｉｎ ａｐｉｃｅｓ.
ｐｉｎ２ ｈａｄ ａ ｈｉｇｈｅｒ Ｈ２Ｏ２ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａ ｌｏｗｅｒ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｒｏｏｔ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｔｈａｎ ＷＴ. Ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ Ａｌ￣Ｍｏｒｉｎ ｓｔａｉ￣
收稿日期: ２０１４￣１２￣３０ 修回日期: ２０１５￣０３￣３１
基金项目: 国家自然科学基金(３１１７２０２６ꎬ３１３７２１２５)[Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ(３１１７２０２６ꎬ３１３７２１２５)]ꎮ
作者简介: 曹华苹(１９９１￣)ꎬ女ꎬ江西上饶人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事铝毒害相关研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｃａｏｈｕａｐｉｎｇ１９９１＠ １６３.ｃｏｍꎮ
∗通讯作者: 沈宏ꎬ博士ꎬ教授ꎬ博士生导师ꎬ主要从事植物根层调控原理与技术研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｈｓｈｅｎ＠ ｓｃａｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎮ
ｎｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｐｉｎ２ ｈａｄ ａ ｌｏｗｅｒ Ａｌ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｈａｎ ＷＴ. Ｔａｋｅｎ ｔｏｇｅｔｈｅｒꎬ ｔｈｅ ａｂｏｖｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ
１００ μｍｏｌＬ￣１ Ａｌ ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＩＮ２ ｐｒｏｔｅｉｎꎬ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｔｓ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｄ Ａｌ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎꎬｔｈｕｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｏｏｔ ｇｒｏｗｔｈ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｏｕｌｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｅｌｕｃｉｄａ￣
ｔｉｎｇ Ａｌ￣ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ａｕｘｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ａｌｕｍｉｎｕｍ ｓｔｒｅｓｓꎬ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａꎬ ＡｔＰＩＮ２ꎬ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ
铝毒是酸性土壤上限制农作物生长重要的影响
因子ꎬ植物响应铝毒害的最初反应是根尖伸长受抑
制(Ｄｅｌｈａｉｚｅ ＆ Ｒｙａｎꎬ１９９５ꎻ Ｋｏｃｈｉａｎ ｅｔ ａｌꎬ２００４)ꎮ 然
而经过多年研究ꎬ铝抑制根尖伸长的确切机理尚未
完全阐明(Ｍａ ｅｔ ａｌꎬ２０１４)ꎮ 生长素的合成与运输对
根系伸长起了重要作用(Ｔｅａｌｅ ｅｔ ａｌꎬ２００５)ꎮ 根尖生
长素在 ＰＩＮ蛋白家族(生长素输出蛋白)的作用下ꎬ
通过向顶运输和向基运输的“伞形”运输ꎬ形成根尖
的生长素的不对称分布ꎬ进一步影响根尖生长(吴
道铭等ꎬ２０１４)ꎮ Ｌａｘｍｉ ｅｔ ａｌ(２００８)认为光照主要是
通过调控 ＰＩＮ 蛋白的细胞间的分布进而调控根系
的生长ꎮ 铝胁迫能够改变生长素的累积以及分布ꎬ
并且ꎬ这个过程主要是通过生长素运输载体 ＡＵＸ１
和 ＰＩＮ２ 调节(Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌꎬ２０１３)ꎮ 在拟南芥根尖ꎬ
ＰＩＮ２蛋白定位于表皮细胞的顶端以及皮层细胞的
底端ꎬ具有向基以及向顶的生长素运输能力(Ｂｌｉｌｏｕ
ｅｔ ａｌꎬ２００５ꎻ Ｆｅｒａｒｕ ＆ Ｆｒｉｍｌꎬ２００８ )ꎮ 铝与 ＰＩＮ２蛋白
的相互关系并不清楚ꎮ
本研究以拟南芥 ＰＩＮ２基因缺失突变体(ｐｉｎ２)、
对照野生型(ＷＴ)和 ＰＩＮ２□∷□ＧＦＰ 融合体为材
料ꎬ研究了铝胁迫对拟南芥根系生长、根尖 ＰＩＮ２ 蛋
白表达活性及组织分布和 ＰＩＮ２ 蛋白对铝内置化的
影响ꎬ以期初步探明铝对 ＰＩＮ２ 蛋白影响的可能机
制ꎬ为遗传改良作物耐铝性提供理论依据ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 试验设计
供试拟南芥材料包括拟南芥(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉ￣
ａｎａ) ＰＩＮ２ 缺失突变体 ( ｐｉｎ２)、野生型 (ＷＴ)及
ＰＩＮ２□∷□ＧＦＰ 融合体ꎬ分别来源于俄亥俄州立大
学拟南芥生物资源中心和德国波恩大学细胞与分子
植物研究所ꎮ 在超净工作台内ꎬ用灭菌牙签将已消
毒的种子均匀地播在 １ / ４ ＭＳ培养基(ｐＨ ４.５ꎬ含 １％
葡萄糖)上ꎬ然后用 Ｐａｒａｆｉｌｍ膜将培养皿密封ꎮ 待播
种完成后ꎬ将培养皿垂直放在光照培养箱中生长ꎬ生
长条件为光照 １４ ｈꎬ２２ ℃ꎻ黑暗 １０ ｈꎬ１８ ℃ꎻ光照强
度为 １５０ μｍｏｌｍ￣２ｓ￣１ꎮ 试验设置正常对照和铝
胁迫 ２个处理ꎬ即拟南芥种子播种在含有 ０ 或 １００
μｍｏｌＬ￣１ ＡｌＣｌ３的 １ / ４ ＭＳ 培养基上生长 ６ ~ ７ ｄ 或
１４ ｄꎬ然后取拟南芥幼苗根系进行显微观察和测定ꎻ
或者先将拟南芥幼苗种在 １ / ４ ＭＳ 培养基上生长 ６
ｄꎬ然后放在含有 ０ 或 １００ μｍｏｌＬ￣１ ＡｌＣｌ３的 ０. ２
ｍｍｏｌＬ￣１ ＣａＣｌ２的溶液中处理一段时间ꎬ随后进行
显微观察ꎮ
１.２ 试验方法
铝内置化研究:将铝处理后的拟南芥根系从培
养基上轻轻取出ꎬ先放在 ０.２ ｍｍｏｌＬ￣１ ＣａＣｌ２溶液
静置 ５ ｍｉｎꎬ清除根系表面的养分离子或其它杂物ꎬ
然后放在滤纸上轻轻吸干根表水珠ꎬ随后放在 １００
μｍｏｌＬ￣１的 Ｍｏｒｉｎ 染色液中静置ꎬ并在减压抽真空
条件下放置 １０ ｍｉｎꎬ以便染色液进入根系细胞内部ꎬ
随后将根系在 ０.２ ｍｍｏｌＬ￣１ ＣａＣｌ２清洗 ２次后ꎬ用于
激光共聚焦显微镜观察ꎮ 由于 Ｍｏｒｉｎ 荧光物质能与
铝结合ꎬ在特定条件下发射荧光ꎬ根据荧光强度ꎬ即
可判断进入细胞内铝水平ꎬ即铝的内置化ꎮ
Ｈ２Ｏ２累积分析:利用根系细胞内 Ｈ２Ｏ２与荧光
物质 Ｈ２ＤＣＦ￣ＤＡ结合的原理ꎬ将处理后的拟南芥根
系放在 ５０ μｍｏｌＬ￣１的 ２′ꎬ７′￣二氯荧光素二乙酸盐
(２′ꎬ７′￣ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅꎬＨ２ＤＣＦ￣ＤＡ)溶液
中静置处理ꎬ并在减压抽真空条件下放置 １０ ｍｉｎꎬ以
便 Ｈ２ＤＣＦ￣ＤＡ荧光物质充分进入根系细胞内ꎬ然后
在 ０.２ ｍｍｏｌＬ￣１ＣａＣｌ２溶液清洗 ２次ꎬ随后放在激光
共聚焦显微镜下观察ꎬ荧光强度越强ꎬ表明 Ｈ２Ｏ２含
量越高ꎮ
激光共聚焦显微观察:拟南芥幼苗处理完毕后ꎬ
取幼苗根系放置于载玻片上ꎬ加 １滴去离子水ꎬ保持
幼苗根尖浸泡在水中ꎬ再盖上盖玻片ꎬ置于激光共聚
焦显微镜(Ｅｃｌｉｐｓｅ ８００ꎬ日本)下观察ꎬ其中ꎬ激发波
长为 ４８８ ｎｍꎬＡｒｇｏｎ激光(１.４ ｍＷ) 观察ꎮ 获取典型
照片作为该文结果ꎮ
蛋白印迹反应:先将拟南芥幼苗种在培养基上
生长 １３~１４ ｄꎬ然后将其转入分别含有 ０ μｍｏｌＬ￣１
ＡｌＣｌ３ꎬ ２０ μｍｏｌＬ￣１ＢＦＡꎬ １００ μｍｏｌＬ￣１ ＡｌＣｌ３或 ２０
２２１ 广 西 植 物 ３６卷
图 １ 铝胁迫对拟南芥根系生长的影响 Ａ. 拟南芥在正常生长条件下照片ꎻ Ｂ. 拟南芥在铝胁迫条件下照片ꎻ Ｃ. 拟南芥主根长ꎻ
Ｄ. 拟南芥相对根长ꎮ 数据为均值±标准误差(ｎ＝ １０)ꎬ柱子上字母不同表示不同处理差异达到显著水平(Ｐ<０.０５)ꎮ 下同ꎮ
Ｆｉｇ. １ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｌ ｓｔｒｅｓｓ ｏｎ ｒｏｏｔ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ Ａ. Ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ (ＣＫ)ꎻ Ｂ. １００ μｍｏｌＬ￣１ ＡｌＣｌ３ꎻ Ｃ. Ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｔａｐ ｒｏｏｔꎻ
Ｄ. Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｒｏｏｔ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ. Ｔｈｅ ｄａｔａ ｗｅｒｅ ｍｅａｎｓ ±ＳＥ (ｎ＝１０). Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｔ Ｐ<０.０５ ｌｅｖｅｌ. Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ.
μｍｏｌＬ￣１ ＢＦＡ ＋ １００ μｍｏｌＬ￣１ＡｌＣｌ３的 ０.２ ｍｍｏｌ
Ｌ￣１ ＣａＣｌ２溶液中处理 ２ ｈꎬ处理完毕后ꎬ收获根尖 １
ｃｍ的根段ꎬ用 Ｐｈａｓｅ￣Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ 方法提取根系质膜
膜蛋白和囊泡蛋白ꎮ 质膜蛋白和囊泡蛋白先溶解在
ＳＤＳ￣ｌｏａｄｉｎｇ缓冲液中ꎬ缓冲液含有 ０.１２５ ｍｍｏｌＬ￣１
Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌꎬｐＨ７.４ꎬ１０％ＳＤＳꎬ１０％甘油及二硫苏糖醇、
溴酚兰、苯甲磺酰氟化物ꎮ 经 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ后ꎬ转入去
氟 ＰＶＰ 膜片上ꎬ进行杂交反应ꎮ 用抗玉米多克隆抗
体与膜片杂交ꎬ抗血清溶液用 Ｔｒｉｓ缓冲液＋Ｔｗｅｅｎ 按
１ ∶ １ ０００稀释使用ꎬ二次抗体检测用 ＢＣＩＰ￣ＮＰＴ 方
法进行检测ꎮ
１.３ 数据分析
所有数据均用 Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２００３ 和 ＳＡＳ ９.２
软件分析ꎬ用 Ｄｕｎｃａｎ 法进行检验(Ｐ<０.０５)ꎮ
２ 结果与分析
２.１ 铝胁迫对拟南芥根系生长的影响
图 １为拟南芥在正常生长和铝胁迫条件下的长
势ꎮ 无论正常生长或铝胁迫处理条件下ꎬｐｉｎ２ 根系
均呈弯曲生长ꎬ这可能与 ＰＩＮ２ 基因缺失、生长素极
性输出受阻ꎬ根系向地性缺失有关ꎻ而 ＷＴ的根系在
正常和铝胁迫条件下均垂直向下生长ꎬ具有明显的
向地性ꎮ 有趣的是ꎬｐｉｎ２ 在铝胁迫下向地性缺失现
象没有正常生长条件下那么严重(图 １:ＡꎬＢ)ꎮ 利
用直尺测定拟南芥根长ꎬ发现在铝胁迫条件下ꎬＷＴ
的主根根长以及相对根长均显著大于 ｐｉｎ２ (图 １:
ＣꎬＤ)ꎬ表明 ｐｉｎ２的耐铝性小于 ＷＴꎮ
２.２ 铝胁迫对拟南芥根系 Ｈ２Ｏ２累积的影响
植物根系在铝胁迫下ꎬ容易遭受氧化胁迫
(Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌꎬ２００２ꎬ２００３)ꎮ 荧光物质 Ｈ２ＤＣＦ￣ＤＡ
与 Ｈ２Ｏ２结合ꎬ荧光越强指示 Ｈ２Ｏ２累积更多ꎮ 图 ２
显示ꎬ１００ μｍｏｌＬ￣１ Ａｌ处理可明显增加 ｐｉｎ２ 和 ＷＴ
根尖荧光亮度ꎬ其中 ｐｉｎ２ 的荧光强度较强ꎻ相对荧
光强度的结果与上述结果一致ꎮ 表明铝处理可明显
增加 Ｈ２Ｏ２的累积ꎬ且 ｐｉｎ２ 的 Ｈ２Ｏ２累积可能高于
ＷＴꎮ 尤其是两材料根系维管束的荧光强度明显高
于其它部位ꎬ且根尖、过渡区和伸长区的细胞荧光强
度明显高于根系成熟区细胞ꎮ
２.３ 铝对 ＰＩＮ２□∷□ＧＦＰ表达活性的影响
上述结果显示ꎬＰＩＮ２蛋白可能参与了拟南芥的
耐铝反应ꎮ 为明确其内在机制ꎬ利用 ＰＩＮ２□∷□ＧＦＰ
３２１１期 曹华苹等: 铝胁迫对拟南芥根尖 ＡｔＰＩＮ２蛋白表达活性的影响
图 ２ 铝胁迫处理对拟南芥根尖细胞 Ｈ２Ｏ２累积的影响 Ａ. 正常生长ꎻ Ｂ. 铝胁迫处理ꎻ
Ｃ. Ｈ２Ｏ２相对荧光强度ꎮ 数据为均值±标准误差 (ｎ＝ ３)ꎮ
Ｆｉｇ. ２ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｌ ｏｎ Ｈ２Ｏ２ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｒｏｏｔｓ Ａ. ＣＫꎻ Ｂ. １００ μｍｏｌＬ￣１ ＡｌＣｌ３ꎻ
Ｃ. Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｏｆ Ｈ２Ｏ２ . Ｔｈｅ ｄａｔａ ａｒｅ ｍｅａｎｓ ±ＳＥ (ｎ＝３).
图 ３ 不同铝处理浓度和时间对 ＰＩＮ２□∷□ＧＦＰ 表达活性的影响 Ａ. 不同铝
处理浓度 (μｍｏｌＬ￣１ꎬ４ ｈ)ꎻ Ｂ. 不同铝处理时间 (１００ μｍｏｌＬ￣１ꎬ ｈ)ꎮ
Ｆｉｇ. ３ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｄｕｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ ＰＩＮ２□∷□ＧＦＰ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ａｐｉｃａｌ ｒｏｏｔｓ
Ａ. Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ４ ｈꎻ Ｂ. Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ａｌ ｄｕｒａｔｉｏｎｓ (１００ μｍｏｌＬ￣１ ＡｌＣｌ３ꎬｈ).
材料ꎬ进一步研究了铝胁迫对 ＰＩＮ２ 蛋白表达活性
的影响ꎮ 结果发现ꎬＰＩＮ２□∷□ＧＦＰ 表达活性主要
在拟南芥根系的根尖细胞(如分生区、过渡区和伸
长区细胞)表达ꎬ成熟区 ＰＩＮ２□∷□ＧＦＰ 表达活性
明显低于根尖细胞ꎮ 在一定的铝处理浓度内ꎬＰＩＮ２
□∷□ＧＦＰ 表达活性随着铝处理水平增加而逐步增
加ꎮ 当铝处理浓度为 １００ μｍｏｌＬ￣１、处理时间为 ４ ｈ
时ꎬ ＰＩＮ２□∷□ＧＦＰ 的活性达最高ꎻ １００ μｍｏｌＬ￣１
铝处理 ８ ｈꎬ或者 ２００ μｍｏｌＬ￣１铝处理 ４ ｈꎬ根尖
ＰＩＮ２□∷□ＧＦＰ 活性下降(图 ３)ꎮ
２.４ 铝对拟南芥根尖细胞 ＰＩＮ２□∷□ＧＦＰ 蛋白累
积的影响
从图 ４可以发现ꎬ正常生长时ꎬＰＩＮ２□∷□ＧＦＰ
囊泡蛋白在根尖细胞内形成的点状结构数量多ꎬ但
点状结构的大小较少ꎬ明显小于铝胁迫条件下形成
的点状结构ꎮ 铝胁迫处理后(１００ μｍｏｌＬ￣１)ꎬＰＩＮ２
□∷□ＧＦＰ 蛋白在细胞膜水平方向上累积较强的
荧光ꎬ表明铝胁迫诱导了较多的 ＰＩＮ２ 蛋白向细胞
膜水平方向累积ꎮ
２.５ 铝对拟南芥 ＰＩＮ２ 蛋白在细胞膜与细胞膜内分
配的影响
蛋白印迹反应通过蛋白质与抗体杂交反应ꎬ能
较好指示蛋白的表达水平ꎮ 利用该方法ꎬ我们研究
了 ＢＦＡ和铝胁迫对 ＰＩＮ２ 蛋白表达与分配的影响ꎮ
图 ５结果显示:与对照(ＣＫ)相比ꎬＢＦＡ 处理以及 Ａｌ
＋ＢＦＡ处理对 ＰＩＮ２ 蛋白在细胞膜与细胞膜内的分
配没有明显影响ꎬ然而 １００ μｍｏｌＬ￣１ ＡｌＣｌ３处理有
增加 ＰＩＮ２蛋白向细胞膜分配的趋势ꎮ 上述结果表
明 ＢＦＡ有抑制铝诱导 ＰＩＮ２蛋白在细胞膜上累积的
现象ꎮ 结合图 ４和图 ５ 的结果可以看出ꎬ铝胁迫处
４２１ 广 西 植 物 ３６卷
图 ４ 铝胁迫处理对拟南芥根尖细胞 ＰＩＮ２□∷□ＧＦＰ 累积的影响 Ａ. 正常生长ꎻ Ｂ. 铝胁迫处理ꎮ
Ｆｉｇ. ４ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｌ ｓｔｒｅｓｓ ｏｎ ＰＩＮ２□∷□ＧＦＰ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ａｐｉｃａｌ ｒｏｏｔｓ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ
Ａ. Ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ (ＣＫ)ꎻ Ｂ. １００ μｍｏｌＬ￣１ ＡｌＣｌ３ .
图 ５ ＰＩＮ２蛋白在细胞膜和囊泡之间的分布 ＣＫ. 正
常生长条件ꎻ ＢＦＡ. ２０ μｍｏｌＬ￣１ＢＦＡꎻ Ａｌ. １００ μｍｏｌＬ￣１ ＡｌＣｌ３ꎻ
Ａｌ＋ＢＦＡ. ２０ μｍｏｌＬ￣１ ＢＦＡ ＋ １００ μｍｏｌＬ￣１ ＡｌＣｌ３ꎮ
Ｆｉｇ. ５ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ＰＩＮ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ
ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｄ ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ＣＫ. Ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ
(ＣＫ)ꎻ ＢＦＡ. ２０ μｍｏｌＬ￣１ ＢＦＡꎻ Ａｌ. １００ μｍｏｌＬ￣１ ＡｌＣｌ３ꎻ Ａｌ＋
ＢＦＡ. ２０ μｍｏｌＬ￣１ ＢＦＡ ＋ １００ μｍｏｌＬ￣１ ＡｌＣｌ３ .
理不仅影响 ＰＩＮ２ 蛋白表达ꎬ还对 ＰＩＮ２ 囊泡蛋白的
分配有调节作用ꎮ
２.６ 铝胁迫对拟南芥根尖细胞铝内置化的影响
Ｍｏｒｉｎ是一种能与铝结合的荧光物质ꎬ进入细
胞后与铝结合ꎬ可指示细胞内铝的分布和累积情况ꎮ
本实验利用 Ｍｏｒｉｎ 的这种特性ꎬ研究了铝胁迫下
ｐｉｎ２和ＷＴ根尖细胞的铝内置化ꎮ 结果发现 ｐｉｎ２根
尖的 Ｍｏｒｉｎ荧光物质主要分布在质外体的细胞间隙
(图 ６:Ａ)ꎬ而野生型 ＷＴ 的根尖细胞质中明显存在
类似囊泡结构的荧光物质ꎬ但在质外体空间的荧光
亮度较低(图 ６:Ｂ)ꎮ 表明 ｐｉｎ２ 材料累积的铝主要
分布在质外体如细胞壁和细胞膜上ꎬ而 ＷＴ 累积的
铝主要分布在细胞膜内ꎮ ＰＩＮ２ 基因缺失可能减弱
了铝从细胞壁或细胞膜向细胞内的运输ꎬ说明 ＰＩＮ２
基因可能调节了细胞壁和细胞膜上累积的铝向细胞
内运输ꎬ具体调节机制有待进一步研究ꎮ
３ 讨论与结论
植物根系的生长和发育是一个复杂的生物学过
程ꎮ 生长素ꎬ细胞分裂素和赤霉素等植物生长调节
物质对植物根系的形态建成意义重大ꎮ 其中生长素
的合成ꎬ运输和信号传导在根系生长发育中发挥了
重要作用(Ｓａｉｎｉ ｅｔ ａｌꎬ２０１３)ꎮ 根尖是植物铝毒胁迫
的主要位点ꎬ铝毒能迅速抑制根尖伸长ꎮ 早期的研
究发现ꎬ铝会影响拟南芥根尖 ＰＩＮ２ 蛋白的囊泡运
输ꎬ进而破坏生长素的极性运输ꎬ最终抑制了根系生
长(Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌꎬ２００８)ꎮ 本研究通过比较铝胁迫对
ｐｉｎ２和 ＷＴ 根系生长的影响ꎬ发现铝处理条件下
ｐｉｎ２相对根长小于 ＷＴꎮ Ｈ２Ｏ２的荧光染色结果还表
明铝胁迫增加拟南芥根尖细胞 Ｈ２Ｏ２累积ꎬｐｉｎ２ 的
Ｈ２Ｏ２累积量大于 ＷＴꎮ 这说明对于铝毒害ꎬＰＩＮ２ 基
因缺失突变体比其对照野生型更敏感ꎬ也表明 ＰＩＮ２
基因与铝耐性有关ꎮ
Ａｂａｓ ｅｔ ａｌ(２００６)研究 ＰＩＮ２ 蛋白介导的根向地
性发现ꎬ在重力刺激下ꎬ无论是用内源启动子还是异
源启动子ꎬＰＩＮ２ 蛋白在根上、下部都会形成不平衡
分布ꎬ其上部有更多的 ＰＩＮ２蛋白被降解ꎬ表明 ＰＩＮ２
５２１１期 曹华苹等: 铝胁迫对拟南芥根尖 ＡｔＰＩＮ２蛋白表达活性的影响
图 ６ 两个拟南芥材料根尖细胞铝内置化 Ａ. ｐｉｎ２ꎻ Ｂ. ＷＴꎮ 箭头指示铝的内置化ꎮ
Ｆｉｇ. ６ Ａｌ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ａｐｉｃａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ Ａ. ｐｉｎ２ꎻ Ｂ. ＷＴ. Ａｒｒｏｗ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ Ａｌ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ.
重新排布是由于转录后水平导致的ꎮ ｐｉｎ２突变体中
ＰＩＮ２蛋白重新分布和降解受到干扰ꎬ生长素的分配
被破坏ꎬ造成根向重力性表型缺失ꎮ 光照能够调节
ＰＩＮ２ 蛋白的囊泡运输ꎬ促进定位于细胞质膜ꎬ进而
影响根系生长 ( Ｌａｘｍｉ ｅｔ ａｌꎬ ２００８ꎻ Ｙｏｋａｗａ ｅｔ ａｌꎬ
２０１４)ꎮ 本研究利用激光共聚焦显微镜观察的结果
表明ꎬ１００ μｍｏｌＬ￣１铝处理 ４ ｈ 能诱导最高的 ＰＩＮ２
□∷□ＧＰＦ蛋白表达活性ꎬ并且铝胁迫诱导了较多
的 ＰＩＮ２蛋白向细胞膜水平方向累积ꎮ 本研究蛋白
印迹反应还进一步表明ꎬ铝处理促进 ＰＩＮ２ 蛋白在
细胞膜上累积ꎬ减少胞内囊泡中 ＰＩＮ２蛋白的含量ꎬ而
囊泡运输抑制剂(ＢＦＡ)能抑制铝诱导 ＰＩＮ２蛋白的分
配ꎮ 这暗示铝胁迫可能通过影响 ＰＩＮ２ 蛋白的分配ꎬ
从而影响根系内部生长素运输ꎬ最终影响根尖伸长ꎮ
值得一提的是ꎬ本研究借助 Ｍｏｒｉｎ 染色ꎬ发现在
细胞内 ＷＴ 累积的铝明显比 ｐｉｎ２ 的多ꎮ 这表明
ＰＩＮ２基因缺失可能影响了铝的内置化ꎮ 根尖过渡
区是最先接触铝ꎬ同时又是对铝最敏感的区域
(Ｓｉｖａｇｕｒｕ ＆ Ｈｏｒｓｔꎬ１９９８ꎻ Ｓｉｖａｇｕｒｕ ｅｔ ａｌꎬ１９９９)ꎮ 在
这个区域存在较高频率的内吞循环过程ꎬ并且铝内
置化过程与内吞运输相关(Ｉｌｌéš ｅｔ ａｌꎬ２００６)ꎮ 而在
拟南芥中 ＰＩＮ２ 蛋白主要定位于这个区域ꎬ通过高
频率的内吞运输来完成质膜与细胞内部之间循环进
一步运输生长素(Ｇｅｌｄｎｅｒ ｅｔ ａｌꎬ２００３ꎻ Ｂａｌｕｓｋａ ｅｔ ａｌꎬ
２００５ꎬ２０１０)ꎮ 这暗示生长素运输蛋白可能直接结合
铝ꎬ借助生长素向胞内运输途径将铝转运至胞内ꎬ这
样原本结合在细胞壁或细胞膜上的铝可能借助囊泡
的运输ꎬ通过“搭便车”的方式内吞进入细胞内部
(Ｐａｎｄａ ｅｔ ａｌꎬ２００９)ꎮ 但具体调节机制还在进一步
研究中ꎮ 总之ꎬ本研究表明ꎬＰＩＮ２ 基因参与了铝胁
迫的响应ꎬＰＩＮ２蛋白在铝运输及铝对生长素运输过
程中发挥重要作用ꎮ
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６２１ 广 西 植 物 ３６卷