全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (9): 1524~1528　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.02101524
收稿 2015-05-05　　修定 2015-08-31
资助 国家高技术研究发展计划项目(2011AA100504)。
* 通讯作者(E-mail: yaoyaqin@nwsuaf.edu.cn)。
植物亚显微结构中钾离子的原位检测技术
张莉, 王巧艳, 李思, 董鹤, 姚雅琴*
西北农林科技大学生命科学学院, 陕西杨凌712100
摘要: 利用亚硝酸钴铅钠[NaPbCo(NO2)6]与K+能形成KPbCo(NO2)6电子不透过性颗粒并沉淀在原位的原理, 以玉米叶片为
材料, 建立了K+的原位检测方法。检测结果显示, K+主要分布在维管束、细胞膜、叶绿体、细胞核及核仁等部位, 与现有
的结论相符。该方法显色特异性强、灵敏度高、处理的植物组织和细胞结构保持较完好, 因此, 可以作为一种新技术用于
植物亚显微结构中K+的原位检测。
关键词: 亚显微结构; K+; 原位检测
In situ Detection Technology of Potassium in Submicroscopic Structures
of Plants
ZHANG Li, WANG Qiao-Yan, LI Si, DONG He, YAO Ya-Qin*
College of Life Sciences, Northwest A & F University, Yangling, Shaanxi 712100, China
Abstract: An in situ detection method for K+ was found with maize leaves as the materials in this paper. The
distribution of sodium lead cobaltinitrite [NaPbCo(NO2)6] in submicroscopic structures of plant cells was ob-
served by means of the production of KPbCo(NO2)6, which precipitated to form electronic impermeable parti-
cles in situ, when NaPbCo(NO2)6 reacted with K
+. We found K+ is mainly distributed in the vascular bundles,
cell membrane, chloroplasts, nuclei and nucleoli using this method, which is considerably consistent with cur-
rent research results. The method has advantages of high sensitivity and specificity in coloration, with cell
structure of plant tissue remaining relatively intact. Therefore, this method can be used as a new technology in
detecting K+ in plant submicroscopic structures in situ.
Key words: submicroscopic structure; K+; in situ detection
技术与方法 Techniques and Methods
K+作为植物体中含量最丰富的一价阳离子,
广泛分布于植物的各组织器官中(靳义荣等2012),
对植物的生长发育具有重要的生理功能。K+在酶
活性的调节、膜电位的调整等一系列生理生化过
程中起关键作用, 在维持植物细胞动态平衡、细
胞膨压调整、调节气孔运动等生理过程中也起重
要的调节作用(Szczerba等2009)。
目前对于K+的测定有多种方法, 如火焰光度
计法(潘浩2003)、离子选择性电极测量法(Shabala
和Newman 1999)、原子吸收法(Hughes等1997)、
同位素86Rb的摄取法(Yu等1999)、温度滴定法、
离子色谱法、四苯硼酸钾重量法(孙焕等2012)、
ICP-MS法(李隼等2011)、色氨酸酶法(Kimura等
1992)、比浊法(李忠等2001)、反射仪-K+试纸法
(张晓海2006 ) , 以及用电解质分析仪 (田强等
2011)、Beckman CX7全自动生化检测仪(王琳和
王长安2012)、紫外分光光谱仪(顾星和谭秦湘
2005)进行测定等。以上实验方法均需要将细胞离
体再进行实验处理, 细胞离体实验对细胞有一定
的损伤, 不可避免地对实验结果造成影响。Macal-
lum (1905)用Na3Co(NO2)6对玉米表皮细胞内的K
+
进行过染色观察, 但是仅局限于光学显微镜。目
前, 在亚细胞结构水平上对动、植物材料进行K+
的原位检测技术很少。
Na3Co(NO2)6作为化学实验中K
+分析的常用
试剂, 可以与K+结合形成颗粒沉淀, 但在光学显微
镜下需要与硫化铵进一步作用才能形成可观察的
棕黑色颗粒沉淀(Macallum 1905)。连宁(1999)使
张莉等: 植物亚显微结构中钾离子的原位检测技术 1525
用寿命更长的NaPbCo(NO2)6代替了容易分解的
Na3Co(NO2)6, K
+与NaPbCo(NO2)6能形成更稳定的
KPbCo(NO2)6沉淀复合物, 组织中有K
+存在的位
置就有此沉淀复合物分布。由于复合物中重金属
铅在透射电镜下显黑色, 根据组织中黑色颗粒的
分布位置可以确定K+在各种亚显微结构中的分布
状况, 黑色颗粒的多少和深浅可以比较K+的相对
含量。
本文根据光学显微镜和电子显微镜的成像原
理建立了一个新方法, 在显微及亚显微结构水平
上对K+进行原位检测, 不仅能够减少甚至能够避
免这些伤害, 从而更准确地显示出组织细胞内部
K+原有的状态, 进行K+的细胞或亚细胞定位。
材料与方法
1 植物材料
玉米(Zea mays L.) ‘郑单958’叶片。
2 方法设计
设计了4种方法: (1)前固定-染色-后固定-脱
水-包埋, pH为6.3; (2)前固定-染色-后固定-脱水-包
埋, pH为7.2; (3)染色-前固定-后固定-脱水-包埋,
pH为6.3; (4)染色-前固定-后固定-脱水-包埋, pH为
7.2。对照除了未经NaPbCo(NO2)6染色外, 其他处
理均相同。
3 操作流程
取大田玉米叶片, 切成2 mm×3 mm的小方片;
参照连宁(1999)的方法配制NaPbCo(NO2)6溶液, 染
色1 h; 用Tris-顺丁烯二酸缓冲液(pH=6.3)漂洗2次,
每次15 min, 再用0.05 mol·L-1二甲砷酸钠(CAB)溶
液漂洗4次, 每次15 min; 4 ℃下用2.5%戊二醛与2%
多聚甲醛的混合液前固定30 min; 用0.05 mol·L-1
CAB溶液漂洗4次, 每次15 min; 4 ℃下用0.1 mol·L-1
CAB溶液配制的1%锇酸后固定2 h; 0.05 mol·L-1
CAB溶液漂洗4次, 每次15 min; 30%~100%酒精梯
度脱水; 丙酮过渡; Spon812包埋剂渗透包埋, LKB
BROMMA 2088超薄切片机切片, 切片不经铅和铀
染色直接在JEOL-1230透射电镜下观察并拍照。
实验结果
光学显微镜下, 玉米叶片表皮气孔开关过程
中, NaPbCo(NO2)6对保卫细胞和副卫细胞中K
+的
染色结果与Macallum (1905)用Na3Co(NO2)6染色的
结果一致。此实验结果也与Mumm等(2011)的研
究结果一致, 即光照时气孔打开, K+主要分布在保
卫细胞中(图1-A和B), 黑暗时气孔关闭, K+主要分
布在副卫细胞中(图1-D和E)。
透射电镜下, 观察和比较4种不同的样品处理
方法, 结果表明, 4种处理方案均能用于组织中K+
图1 光学显微镜下玉米叶片气孔中经NaPbCo(NO2)6染色的K+
Fig.1 K+ in maize leaf stoma stained by NaPbCo(NO2)6 under light microscope
A和B: 光照处理后染色; C: 光照处理后未染色; D和E: 黑暗处理后染色; F: 黑暗处理后未染色。标尺=20 nm。
植物生理学报1526
亚显微水平的原位检测, 其中, 染色-前固定-后固
定-脱水-包埋(pH为6.3)的方法效果最佳。从图2-A
和B可见, 维管束导管中有较多的K+分布, 与光学
显微镜的染色观察结果(图1-B和E)一致, 说明维管
束是植物体吸收K+的运输通道; 张明菊等(2015)的
研究也已证实了这一点。
由图3-A可见, 在胞间连丝周围电子不透过性
颗粒较多, 说明K+在此处相对聚集, 印证了胞间连
丝具有物质运输的功能。图3-D显示, 电子不透过
性颗粒沿着细胞膜形成一条明显的细胞边界, 说
明细胞膜具有介导K+交换的功能。另外, 图3-C显
示, 在靠近维管束的三角形细胞间隙内贮存了大
量的K+, 其原因尚不明确。
从图4-A可以看出K+在叶绿体内的分布, 说明
植物细胞内部叶绿体也是K+的一个贮存场所。此
外, 还观察到核仁中沉积了较多的K+, 在细胞核中
的其余地方也有K+的分布(图4-C); 与Libanati和
Tandler (1969)得到的结果相似。
图2 透射电镜下维管束导管中经NaPbCo(NO2)6染色的K
+
Fig.2 K+ in vascular catheter stained by NaPbCo(NO2)6 under transmission electron microscope
A: 经染色-前固定-后固定-脱水-包埋(pH为6.3)处理的维管束; B: 经染色-前固定-后固定-脱水-包埋(pH为6.3)处理的导管; C: 其他处理
的代表; D: 未经NaPbCo(NO2)6染色的对照。
讨　　论
本研究采用NaPbCo(NO2)6与Macallum (1905)用
的Na3Co(NO2)6进行了光学显微镜下的比对试验, 两
者的显色特性完全相同, 而且NaPbCo(NO2)6的显色
效果明显优于Na3Co(NO2)6。说明用NaPbCo(NO2)6
捕获K+进行细胞或亚细胞水平的分布研究是可
靠的。
基于K+专用捕获剂NaPbCo(NO2)6中含有重金
属铅, 我们比较了4种对植物材料的处理方法, 建
立了用NaPbCo(NO2)6对K
+进行亚细胞定位的透射
电镜组织细胞化学染色技术。光学显微镜下K+染
色缓冲液的最适pH为6.3, 而用于透射电镜观察的
植物样品细胞化学定位的常用缓冲液pH为7.2, 所
以对染色和前固定之后的漂洗液Tris-顺丁烯二酸
缓冲液的pH进行了试验, 同时染色与前固定过程
可能会相互影响。先进行前固定再染色能够较好
地保持样品结构的完整性, 但是前固定会对细胞
张莉等: 植物亚显微结构中钾离子的原位检测技术 1527
图3 透射电镜下胞间连丝、三角形细胞间隙和细胞膜中经NaPbCo(NO2)6染色的K
+
Fig.3 K+ in plasmodesma, triangular intercellular space and membrane stained by NaPbCo(NO2)6
under transmission electron microscope
A: 经染色-前固定-后固定-脱水-包埋(pH 6.3)处理的胞间连丝; B: 胞间连丝的其他处理组代表; C: 经染色-前固定-后固定-脱水-包埋
(pH 6.3)处理的三角形细胞间隙; D: 经染色-前固定-后固定-脱水-包埋(pH 6.3)处理的细胞膜周围; E: 三角形细胞间隙及细胞膜的其他处理
组代表; F: 未经NaPbCo(NO2)6染色的三角形细胞间隙、细胞膜、胞间连丝的对照。
图4 透射电镜下叶绿体、细胞核中经NaPbCo(NO2)6染色的K
+
Fig.4 K+ in chloroplast and nucleus stained by NaPbCo(NO2)6 under transmission electron microscope
A: 经染色-前固定-后固定-脱水-包埋(pH 6.3)处理的叶绿体; B: 叶绿体的其他处理组代表; C: 经染色-前固定-后固定-脱水-包埋(pH
6.3)处理的细胞核; D: 细胞核的其他处理组代表; E: 未经NaPbCo(NO2)6染色细胞核及叶绿体的对照。
内化学反应的显色产生影响, 这可能是先进行前
固定后染色的2组处理效果差的原因。先染色虽
然对组织也有损伤, 但本实验结果表明, 先染色仍可
使细胞结构保持相对完整。由于用NaPbCo(NO2)6染
色与光学显微镜NaPbCo(NO2)6捕获K
+的原理相同,
所以在染色之后, 用光学显微镜使用的pH为6.3的
植物生理学报1528
Tris-顺丁烯二酸缓冲液漂洗效果最好, 可能是其对
KPbCo(NO2)6沉淀颗粒的稳定性有益。
细胞核作为细胞内的离子库, 参与细胞内部
电解质的聚集(Tandler等1970), 本文图4-C中细胞
核内部的大量K+沉淀能证实这一点。叶绿体不仅
是K+的一个储存库, 而且其参与的光合作用更离
不开K+, K+对于叶绿体来说是不可或缺的(郑炳松
等2002), 维管束、胞间连丝、细胞膜等具有K+运
输的功能也是众所周知的, 这些在本文结果中均
得以体现。此方法不仅能够对K+进行亚细胞定位,
而且可以通过电子不透过性颗粒的大小与多少,
反映K+在某个部位的相对含量变化, 即能够直接
观察不同条件下细胞或亚细胞水平上K+在相对位
置和相对含量上的变化。
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