全 文 ：收稿日期:2007-07-23;　修订日期:2007-11-19
作者简介:沈　放(1973-),女(满族),辽宁凤城人 ,现任昆明师范高等专
科学校生物系讲师 , 硕士学位 ,主要从事生化及天然产物开发的科研
工作.
海枫藤提取物对 Na+ , K+ -ATP酶活力的影响
沈　放 , 杨黎江 , 路　斌 , 王德斌
(昆明师范高等专科学校 ,云南 昆明　650031)
摘要:目的 通过该研究确证彝族传统草药———海枫藤中是否含具有强心作用的活性成分 ,并初步了解该活性成分的存
在部位及药效。方法 运用大鼠心肌 Na+, K+-ATP酶活力测定方法检测海枫藤提取物中是否具有强心类物质。结果
海枫藤茎 、叶中均含有抑制 Na+, K+-ATP酶活力的物质;茎提取物的抑制效果明显优于其它 ,且其强心活性与剂量呈正
相关;同强心苷类物质地高辛比较 , 海枫藤茎水提取物与地高辛对心肌 Na+, K+-ATP酶活力的抑制作用无显著性差异。
结论 海枫藤提取物中具有类似于强心苷的活性成分存在 , 该活性物质主要存在于茎中 , 且茎的水提取物中含有的强心
成分与地高辛的强心作用相近。
关键词:海枫藤;　Na+, K+-ATP酶;　强心
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2008)08-1959-02
EffectsofExtractsfromMarsdeniaofficinalisTsiangetP.T.LionNa+, K+-ATPaseAc-
tivity
SHENFang, YANGLi-jiang, LUBin, WANGDe-bin
(DepartmentofBiology, KunmingNormalColege, Kunming650031, China)
Abstract:ObjectiveTostudytheeffectoftheextractsfromMarsdeniaoficinalisTsiangetP.T.LionNa+, K+-ATPaseac-
tivityandtoafirmsomecardiotonicmaterialsintheplant.MethodsTheextractswereseparatedfromstems, fruitsandleavesof
MarsdeniaofficinalisNa+, K+-ATPaseactivityofSDratheartsarcolemmawasdetermined.ResultsTheextractsfromstemsand
leavesofMarsdeniaoficinaliscouldinhibittheactivityofNa+, K+-ATPase, andtheextractfromthestemshadastrongerinhibi-
tiontotheactivityoftheNa+, K+ -ATPasethantheothers, andshowedadose-dependentmanner.Atthesametime, the
hydro-extractionfromstemshadnosignificantdiferencewithDesacetyllanatosideininhibitingactivityoftheNa+, K+-AT-
Pase.ConclusionThereareactiveingredientsintheextractofMarsdeniaofficinaliwhichissimilartocardiacglycoside.These
ingredientsexistsmainlyinstems.Thecardiotonicfunctionofhydro-extractionfromstemsisthesameasDesacetylanatoside.
Keywords:MarsdeniaofficinalisTsiangetP.T.Li;　Na+, K+-ATPase;　Cardiacstimulation
　　萝藦科植物富含强心苷类成分 [ 1] , 如杠柳属的美叶杠柳
Periplocacalophylla(Wight.)Falconer[ 2] , 杠柳 Periplocasepium
Bge.[ 3] 、马利筋属的马利筋 AsclepiascurassavicaL.[ 4] , 以及马达
加斯加胶藤 CryptostegiamadagascariensisBojer.等 [ 5] 。心肌细胞
膜上的 Na+, K+-ATP酶的活性与心肌收缩速率有直接联系 ,研
究表明 , 强心苷类物质可通过抑制心肌 Na+, K+-ATP酶活力来
提高心脏搏动速率 [ 6, 7] 。
海枫藤 MarsdeniaoficinalisTsiangetP.T.Li为萝藦科牛奶
菜属藤木类植物 , 具舒经通络 、除湿止痛等功效 ,在云南省彝族地
区特别是哈尼族地区常用于治疗风湿 、关节炎等病症 ,为当地少
数民族常用草药。目前海枫藤在临床上仅以配方中药中的一味
少量运用于关节炎的治疗 ,其提取物活性成分 、生理活性和药理
等方面均未见报道。为确定海枫藤的具体生理功效 ,挖掘和开发
新的民族药物 , 就海枫藤提取物对 SD大鼠心肌 Na+, K+ -ATP
酶活力的影响 , 开展了以下研究工作。
1　器材
1.1　材料 海枫藤 MarsdeniaoficinalisTsiangetP.T.Li, 由本系
翟书华老师于昆明市石林县圭山野外采集而得 , 并分类鉴定;地
高辛 , 杭州赛诺菲圣德拉堡民生制药公司;实验动物选用健康成
年 Sprague-Dawley(SD)鼠 ,雌雄不拘 , 体重 200 ～ 220g,由昆明医
学院动物实验中心提供。
1.2　仪器 UV-1600双光束紫外可见分光光度计(北京瑞利分
析仪器公司);旋转蒸发仪(东京理化);水浴锅;循环水式多用真
空泵;低温离心机(eppendorf);捣碎机;超低温冰箱(美国热电);
冻干机(德国 ChristAlpha1-2);干燥箱。
1.3　试剂 组织匀浆液(蔗糖 0.25mol/L, EDTA25 mmol/L, Tris
10 mmol/L, pH 7.0), 反应液 Ⅰ (ATP5.0 mmol/L, MgCl2 5.0mmol/L, NaCl120 mmol/L, KCl2.5mmol/L, Tris25mmol/L, NaN3
5.0 mmol/L, pH7.4), 反应液Ⅱ(即在反应液 I中加 100 mg/L的
地高辛),反应液Ⅲ(反应液 Ⅰ中加入不同浓度的样品溶液);铁
剂(含 10%三氯醋酸 , 1%硫脲 , 3%硫酸亚铁), 定磷试剂(为 11 g
鉬酸铵与 22.5 ml浓硫酸先溶于 100ml水中 , 再稀释至 250 ml),
其余未注明试剂均为国产分析纯。
2　方法
2.1　海枫藤果实 、茎和叶中有机成分的提取分离流程
根据海枫藤果实 、叶 、茎有机成分提取分离流程 ,分离获得样
品 g1, g2, j1, j2, y1, y2。
2.2　心肌组织匀浆的制备 [ 7] 取健康 SD大鼠 8只 , 击头致昏 ,
速取心脏 ,放入预冷的 0.9%NaCl中洗去血液 ,滤纸吸干 ,称量后
·1959·
LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2008VOL.19NO.8 时珍国医国药 2008年第 19卷第 8期
按 25∶1(V/W)加入组织匀浆液 , 在冰浴中用玻璃匀浆器制成心
肌组织匀浆 , 经三层纱布过滤 , 滤液于 0 ～ 4℃冰箱保存。
2.3　酶促反应 [ 7] 每管加 0.1 ml心肌组织匀浆 , 空白管加 0.4
ml10%三氯醋酸和 0.5 ml反应液Ⅰ ;总酶管加 0.5ml反应液Ⅰ ;
Mg2+-ATP酶管加 0.5 ml反应液Ⅱ;给药管加 0.5 ml反应液
Ⅲ 。置 37℃恒温水浴中振荡 20 min取出 , 立即放入冰浴。除空
白管外 , 其余管迅速加入 0.4ml10%三氯醋酸终止反应 , 振荡后
3 000 r/min离心 10 min, 取上清液用 Harry法测定无机磷含量。
与此同时吸取 0.1 ml组织匀浆作适当稀释后用 Bradford法测定
蛋白质含量。标准蛋白质溶液采用牛血清蛋白配制 , 准确称取
12.5 mg, 加蒸馏水至 50 ml, 酶活力单位以每小时每毫克蛋白水
解 ATP产生的无机磷的微摩尔数表示 [即 μmol· pi/(mg· pr·
h)] 。
2.4　统计学分析 两组间数据差异比较采用 Student-t检验 ,多
组间数据差异采用 Duncans新复极差法检验 , 当 P<0.05时认为
差异显著 , P<0.01时认为差异极显著。
3　结果
3.1　海枫藤提取物对大鼠心肌细胞膜 Na+, K+ -ATP酶活力的
影响 用上述方法测得大鼠心肌细胞膜 Na+, K+-ATP酶活力为
0.712μmol· pi/(mg· pr· h), 占总酶活力的 15.1%, 海枫藤提
取物对 Na+, K+-ATP酶活力的影响见表 1。
表 1　海枫藤提取物对大鼠心肌细胞膜
Na+, K+-ATP酶活力的影响( x±s)
样品 Na+, K+-ATP酶活C/μmol· pi· (mg· pr· h)-1
相对
活力
抑制率
(%)
对照 0.712±0.031 100 0
果实提取物　醇提物 0.798±0.024 112.1 -
　　　　　　水提物 0.658±0.033 92.4 7.6
茎提取物　　醇提物 0.463±0.022＊ 65.0 35.0
　　　　　　水提物 0.417±0.035＊＊ 58.6 41.4
叶提取物　　醇提物 0.825±0.016 115.9 -
　　　　　　水提物 0.473±0.039＊ 66.4 33.6
　　与对照组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01;n=6
由以上结果可以看出 ,海枫藤茎 、叶提取物中含有明显抑制
Na+, K+-ATP酶活力的物质 , 即含有强心类物质。与叶提取物
结果对比可知 , 海枫藤的强心物质主要存在于茎中。
3.2　不同浓度的海枫藤茎提取物对大鼠心肌细胞膜 Na+, K+ -
ATP酶活力的影响 用 10, 5, 2.5, 1 mg/ml不同浓度海枫藤茎醇
提物和水提物测定大鼠心肌 Na+, K+ -ATP酶的活力 , 结果见
表 2。
表 2　不同浓度海枫藤茎提取物对大鼠心肌细胞膜
Na+, K+-ATP酶活力的影响 ( x±s)
样品 Na+, K+-ATP酶活C/μmol· pi· (mg· pr· h)-1 相对活力
抑制率
(%)
对照　　　　　 0.712±0.031 100 0
茎醇提物　10mg/ml 0.215±0.042＊＊ 30.2 69.8
　　　　　5mg/ml 0.463±0.022＊＊ 65.0 35.0　　　　　2.5mg/ml 0.588±0.031＊ 82.6 17.4
　　　　　1mg/ml 0.675±0.024 94.8 5.2
茎水提物　10mg/ml 0.183±0.036＊＊ 25.7 74.3
　　　　　5mg/ml 0.417±0.035＊＊ 58.6 41.4
　　　　　2.5mg/ml 0.613±0.049＊ 86.1 13.9
　　　　　1mg/ml 0.676±0.025 94.9 5.1
　　与对照组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01;n=6
由以上结果可以看出 , 海枫藤茎提取物中含有能明显抑制
Na+, K+-ATP酶活力的物质 , 抑制率与剂量呈正相关。海枫藤
茎醇提物的抑制回归方程为 Y=0.719-0.050 7X, r=0.999 4,
其半数抑制浓度 IC50为 7.16 mg/ml。海枫藤茎水提物的抑制回
归方程为 Y=0.731 1 -0.056X, r=0.987 9, 其半数抑制浓度
IC50为 6.72 mg/ml。
3.3　海枫藤茎提取物与强心类药物抑制大鼠心肌细胞膜 Na+,
K+-ATP酶活力的比较 用 5 mg/ml海枫藤茎提取物和强心类
药物测定大鼠心肌 Na+, K+-ATP酶活力 ,比较海枫藤提取物的
强心功效 ,结果见图 1。
各比较组中 ,柱上字字母表示相互有显著性差异 , P<0.05
图 1　海枫藤茎提取物与强心类药物抑制大鼠
心肌细胞膜 Na+, K+-ATP酶活力的比较
结果表明 , 地高辛和海枫藤提取物均具有明显抑制大鼠心肌
细胞膜 Na+, K+-ATP酶活力的作用。在同样浓度(5 mg/ml)条
件下海枫藤茎醇提物对大鼠心肌细胞膜 Na+, K+-ATP酶活力
的抑制效果明显低于地高辛(海枫藤茎醇提物抑制率为 35.0%,
地高辛为 47.7%),而海枫藤茎水提物对大鼠心肌细胞膜 Na+,
K+-ATP酶活力的抑制效果(41.4%)与地高辛的抑制效果没有
显著性差异。
4　讨论
本研究通过海枫藤果实 、茎和叶的乙醇及水提取物对大鼠心
肌细胞膜 Na+, K+-ATP酶活性影响的检测实验 , 发现海枫藤
茎 、叶的提取物能显著抑制大鼠心肌细胞膜 Na+, K+-ATP酶的
活性(P<0.05), 表明该植物中含有类似于强心苷的活性成分存
在。海枫藤叶的水提取物和茎的乙醇提取物 、水提取物均能明显
抑制 Na+, K+-ATP酶的活性 , 但相比较而言 , 茎提取物的抑制
效果较叶提取物抑制效果明显。茎提取物对 Na+, K+ -ATP酶
活性的抑制率与其剂量呈正相关关系 ,茎醇提物的半数抑制浓度
IC50为 7.16 mg/ml,海枫藤茎水提物的半数抑制浓度 IC50为 6.72mg/ml。由此可知 , 海枫藤含有具强心作用的化合物 , 即含有强
心类物质 ,且该强心类物质主要存在于茎中。
Na+, K+-ATP酶作为一种生命活动的供能物质 , 广泛存在
于细胞膜上 ,通过水解 ATP维持细胞的多种生理功能 , 与神经 、
肌肉兴奋性和传导性功能有密切关系。研究表明 , 心力衰竭时 ,
细胞外 Ca2+不易进入心肌细胞 , 肌浆网贮存和释放 Ca2+的能力
减低 , 影响肌凝蛋白原 -Ca2+复合体的生成 ,使兴奋收缩偶联失
常。强心苷类物质与心肌细胞膜上的 Na+, K+-ATP酶的 α单
位结合 ,抑制肌膜 Na+-K+-ATP酶 , 增加 Na+内流 , K+外流 ,
细胞内 Na+堆积 ,促使 Na+-Ca2+交换 , Ca2+内流增加 , 改变细胞
内游离钙离子量而增加心肌收缩力 ,使衰竭心脏的心排血量和心
脏作用增加 , 左心室舒张末压和舒张末容量增加 , 对心功能降低
者的作用较正常心脏显著。心率失调 , 与心肌细胞内钙平衡失
调 , 细胞内肌浆网钠 -钙交换以及钙释放减少等机制有关 [ 6] , 因
此 , 通过海枫藤提取物对大鼠心肌细胞膜 Na+, K+-ATP酶活力
的影响进行研究 ,可检测其提取物中是否含有类似强心苷且具强
心作用的活性成分。由于强心苷类物质可溶于水亦可溶于乙醇 ,
因此海枫藤茎的醇提物和水提物均能明显抑制 Na+, K+ -ATP
酶的活性。同时与强心苷类强心化合物———地高辛对比可知 , 海
枫藤茎的水提取物中含有的强心成分与地高辛的强心作用相近
(与地高辛的抑制效果没有显著性差异), 但海枫藤茎水提物中
的强心活性成分是否是强心苷类物质还需要进一步研究才能
确证。
彝族药物是彝族人民长期同疾病作斗争的经验总结和智慧
结晶 , 是中国医学伟大宝库中的一个重要组成部分。彝族地区产
名贵药已有悠久历史 , 彝族药物数达千种 , 包括有动物药 、矿物
药 、植物药 ,其中以植物药和动物药运用较为广泛。彝医植物药
多以鲜品入药 ,并且使用单味药较多。云南白药 、排毒养颜胶囊
等利用彝族药物资源开发的药品在医药行业中独树一帜 ,成为民
·1960·
时珍国医国药 2008年第 19卷第 8期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2008VOL.19NO.8　
族药物开发利用的典范。 因此通过对彝族传统药用植物的系统
研究 、整理 、挖掘和开发民族药 , 可进一步开发新的高效的中药产
品 , 将这些独特的少数民族千百年智慧的结晶以科学的方式服务
于大众 , 为天然植物资源开发和利用取得新的突破和成果。海枫
藤 MarsdeniaofficinalisTsiangetP.T.Li为萝藦科牛奶菜属藤木
类植物 , 具舒经通络 、除湿止痛等功效 , 在彝药中常用于治疗风
湿 、关节炎等病症 ,特别在云南省哈尼族(彝族的一个分支)聚集
地区 , 海枫藤为当地少数民族的常用中草药。目前对海枫藤的了
解和研究仅保持在复方中药治疗风湿和关节炎的层次上 ,对其成
分 、药理 、药效等均未见报道 , 因此从新药开发和民族药开发利用
的角度上来讲 , 对海枫藤的研究具有重要意义。
参考文献:
[ 1] 　姚新生.天然药物化学 , 第 3版 [ M] .北京:人民卫生出版社 ,
2002:299.
[ 2 ] 　邓士贤 ,王德成 ,何功倍 ,等.美叶杠柳 Periplocacalophyla(Wight)
Falconer的强心作用 [ J] .药学学报 , 1980, 4:55.
[ 3 ] 　李玉红 ,高秀梅 ,张柏礼 , 等.香加皮提取物对离体心脏心功能的
影响 [ J] .辽宁中医药大学学报 , 2005, 7(4):396.
[ 4 ] 　张援虎 ,温远影 ,匡廷云.萝藦科马利筋族植物化学成分研究进展
(Ⅱ)[J].天然产物研究与开发 , 2000, 12(5):80.
[ 5 ] 　徐　峰.马达加斯加胶藤中的强心甙 [ J] .国外医学· 药学分册 ,
1985, 4:248.
[ 6 ] 　江明性.强心苷加强心肌收缩力的作用原理 [ J] .国外医学·药学
分册 , 1978, 3:153.
[ 7 ] 　张晓丹 ,季宇彬 ,马　瑛 ,等.桂竹糖芥强心苷 G对 Na+, K+-ATP
酶的抑制作用 [ J] .中草药 , 1999, 30(10):758.
收稿日期:2007-08-14;　修订日期:2008-03-21
作者简介:朱贤森(1973-),男(汉族),江西兴国人 ,现任赣南医学院讲师 ,
学士学位 ,主要从事肿瘤病理相关教学和科研工作.
＊通讯作者简介:程齐来(1978-), 男(汉族),湖北红安人 , 现任赣南医学
院讲师 ,硕士学位 ,主要从事生药学相关教学和科研工作.
红车轴草总异黄酮粉剂中总异黄酮含量测定研究
朱贤森 ,黄志勤 ,杨庆春 ,程齐来＊
(赣南医学院 ,江西 赣州　341000)
摘要:目的 建立红车轴草总异黄酮粉剂中总异黄酮含量的测定方法 , 从而对该品进行质量控制。方法 采用紫外分光
光度法直接测定粉剂中总异黄酮含量 , 测定波长为 250 nm。结果 回归方程为:Y=0.131 2 X+0.009 5, 相关系数 r=
0.999 7,平均回收率为 98.3%, RSD为 2.06%, 线性范围为 1.004 0 ～ 5.020 0 mg/ml。结论 紫外分光光度法测定该粉剂
中总异黄酮含量结果准确 、方便 、快捷 、重现性好。
关键词:紫外分光光度法;　红车轴草粉剂;　总异黄酮
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2008)08-1961-02
StudyontheDeterminationoftheContentofIsoflavonesinTrifoliumpratenseFenji
ZHUXian-sen, HUANGZhi-qin, YANGQing-chun,CHENGQi-lai＊
(DepartmentofPathology, GannanMedicalColege, Ganzhou, 341000, China)
Abstract:ObjectiveToestablishthedeterminationmethodofcontentofisoflavonesinTrifoliumpratenseFenjibyUVspectro-
mertryandcontrolthequality.MethodsThecontentofisoflavoneswasdeterminedbymeasuringtheUVabsorbanceat250nm..
ResultsThelinearrelationshipwasy=0.131 2x+0.009 5, r=0.999 7 , therecoverywas98.3% , RSD=2.06%;thelinear
rangewas1.004 0 ～ 5.020 0 mg/ml.ConclusionItisspecific, accurate, convenientandrapidformeasuringthecontentofisofla-
vones.
Keywords:UVspectromertry;　TrifoliumpratenseFenji;　Isoflavones;　DeterminationofConcentration
　　中药红车轴草 TrifoliumpratenseL.为豆科车轴草属多年生草
本植物的干燥花序及带花枝叶 , 又名红三叶红花苜蓿三叶草
等 [ 1] , 在我国大部分地区均有生产 , 主要含有蛋白质 、氨基酸 、糖
类 、维生素和异黄酮等成分 ,其中异黄酮具有抗肿瘤(胃癌 、乳腺
癌)和治疗骨质疏松 、更年期综合征 [ 2] 、抑制前列腺癌和骨髓白
血病细胞的生长 、改善动脉血管的柔顺性 [ 3]等多种功能。随着
对研究的深入 , 目前国内外科学家已从红车轴草中发现了四十多
种异黄酮类化合物 , 主要是大豆黄素 、染料木素 、刺芒柄花素和鹰
嘴豆芽素 A等及其相应的苷类。目前关于红车轴草及其提取物
中异黄酮报道较少 , 大多只测定了刺芒柄花素和鹰嘴豆芽素 A。
红车轴草总异黄酮粉剂由中药材红车轴草经现代制药工艺提取 、
浓缩 、干燥 、粉碎而成。本文对该粉剂中总异黄酮的含量测定进
行了相关研究。
1　仪器与试药
紫外可见分光光度计:UV2450PC(日本岛津公司);红车轴
药材购自广东清远药材市场 ,红车轴草总异黄酮粉剂由实验室自
制 , 芒柄花素对照品由中国药品生物制品检定所提供。甲醇(色
谱纯),水(重蒸水), 其他试剂均为分析纯。
2　方法与结果
2.1　样品的制备 取红车轴草药材 , 粉碎成粗粉 ,加 85%甲醇浸
泡 2h后回流提取两次 , 2h/次。将提取液吸入减压浓缩罐中 , 减
压回收至相对密度 1.05 ～ 1.10(50℃)。 浓缩液冷却后静置分
层 , 倾出上层药液 , 下层沉淀待处理;上层药液加 5倍量水 , 搅拌
30 min后离心处理。离心后所得沉淀与上述浓缩液下层沉淀合
并 , 加 6倍量溶剂于室温下脱脂 3次 , 每次搅拌 30 min后静置 1
h,吸除上层溶剂 ,下层脱脂沉淀物 60℃真空干燥后用醋酸乙酯-
乙醇混合溶剂加热回流提取 2 h, 冷至室温后滤过 , 滤液减压浓缩
至所加混合溶剂体积的 1/12, 冷至室温后再静置 8h, 滤过 , 沉淀
物 60℃真空干燥 ,粉碎 , 将样品用甲醇配成适当浓度溶液即得。
2.2　测定方法的选择 根据化学成分研究结果 , 红车轴草含有黄
酮类成分 、蛋白质 、糖类 、脂溶性色素和少量的甾醇类等成分 , 本
品经纯化后 ,主要含芒柄花素 、鹰嘴豆芽素 A等异黄酮类化合物
·1961·
LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2008VOL.19NO.8 时珍国医国药 2008年第 19卷第 8期