全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (4): 481~487　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0603 481
收稿 2014-12-29　　修定 2015-02-15
资助 国家自然科学基金(31101155)、“十二五”农村领域国家
科技计划项目(2011BAD06B01)和河北北方学院重大项目
(ZD201305)。
* 共同第一作者。
** 通讯作者(E-mail: leely519@126.com; Tel: 0313-4029309)。
玉米NADP+-异柠檬酸脱氢酶基因克隆和特征分析
袁进成*, 宋晋辉*, 瓮巧云, 马海莲, 王凌云, 刘颖慧**
河北北方学院农林科技学院, 河北张家口075000
摘要: 异柠檬酸脱氢酶(IDH)是三羧酸循环中最关键和最有意义的限速酶, 在生物体的三羧酸循环代谢反应中起重要的作
用。我们从玉米中克隆了一个新的异柠檬酸脱氢酶基因, 命名为ZmIDH2并对其特征进行初步研究。ZmIDH2基因全
长1 643 bp, 开放阅读框1 236 bp, 编码412个氨基酸, 同时克隆了IDH2基因组DNA, 全长3 463 bp, 具有11个内含子和12个外
显子。进化树分析表明该基因在生物进化中高度保守, 与植物的细胞质IDH2基因的亲缘关系较近。半定量RT-PCR结果显
示ZmIDH2基因在玉米中是组成型表达的, 在根和幼胚中的表达量较高。胁迫处理玉米植株, 表明在干旱和高盐条件下
ZmIDH2基因表达量明显提高, ZmIDH2酶活性也受盐和干旱诱导。
关键词: 异柠檬酸脱氢酶基因; 玉米; 克隆; 特征; 胁迫
Cloning and Character Analysis of NADP+-Dependent Isocitrate Dehydrogenase
Gene in Maize
YUAN Jin-Cheng*, SONG Jin-Hui*, WENG Qiao-Yun, MA Hai-Lian, WANG Ling-Yun, LIU Ying-Hui**
College of Agriculture and Forestry, Heibei North University, Zhangjiakou, Hebei 075000, China
Abstract: NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase (IDH) catalyzes the reversible conversion of isocitrate
to α-ketoglutarate and plays an essential rate-limiting step in the citric acid cycle. In this report a cytosolic
NADP+ dependent isocitrate dehydrogenase gene from maize has been cloned. The analysis of the nucleotide
sequence revealed an open reading frame of 1 236 bp and encoding 412 amino acids. The ZmIDH2 had a
12-extron/11-intron genomic structure and a genomic length of 3 463 bp. The amino acid sequence displayed
high homology with those from other plants such as rice and Arabidopsis. The gene was transcripted in all
tissues tested, with the high amount of ZmIDH2 transcript being found in root and embryo. Semi RT-PCR and
enzyme active analyses showed that ZmIDH2 was induced by drought and salt stress both in transcription and
enzyme level.
Key words: ZmIDH2; maize; clone; character; stress
异柠檬酸脱氢酶(NADP dependent isocitrate
dehydrogenase, IDH) (EC 1.1.1.42)广泛存在于真核
生物, 包括叶绿体、线粒体、过氧化物酶体以及
胞质的各个细胞器中。真核生物的IDH主要参与
三羧酸循环, 负责催化异柠檬酸氧化脱羧成ɑ-酮戊
二酸 (2 -OG) , 并将氧化型NAD还原成还原型
NADH, 被认为是三羧酸循环最关键与最有意义的
限速酶(Yasutake等2003)。IDH催化产生的ɑ-酮戊
二酸(2-OG)不仅仅是糖代谢的重要产物, 也是脂
质、蛋白质和核酸代谢最终氧化成二氧化碳和水
的重要中间物质, 因此IDH的活性对生物体的整个
生命代谢都有重要意义。
NADP-IDH的另一个重要的功能是产生细胞
质中的NADPH (Fieuw等1995)。NADPH是谷胱甘
肽还原酶和硫氧还蛋白还原酶的重要辅酶(Gallar-
do等1995), 而谷胱甘肽(GSH)和硫氧还蛋白对产
生活性氧(reactive oxygen species, ROS)起重要的
作用。研究表明IDH是产生NADPH的主要来源,
IDH和生物的ROS产生密切相关, 因此, IDH在植物
抗氧化胁迫中起重要的作用, 细胞质的IDH涉及到
植物产生谷胱甘肽所需要的NADPH来抵抗氧的胁
迫。最近的研究也表明植物在遭受一些非生物胁
迫以及离子毒害时IDH活性会增加(Hanschmann等
2013; Marino等2007)。这些说明IDH在保护植物
植物生理学报482
免受外界胁迫所引起的氧化胁迫中起重要的作用。
虽然IDH基因在植物中有重要的作用, 但是到
目前为止对该基因的研究主要集中在基因的表达
特征以及基因的细胞定位上, 研究的重点在基因
参与C的同化和N的吸收关系中。直到最近, 人们
通过Arry/Chip等技术分析逆境胁迫条件下基因的
差异表达, 发现IDH基因可以应答多种逆境胁迫,
所以该基因可能在植物抗逆应答中起重要的作
用。基于此, 我们从玉米中克隆了一个IDH基因,
并对其表达特征进行了初步的研究。
材料与方法
1 植物材料与处理
玉米(Zea mays L.)抗旱自交系CN165播种于
张家口市农科院大田中, 分别取大田生长5~6片叶
子时玉米的叶片、茎和根, 花期玉米的花丝以及
授粉10 d后的胚, 供提取不同组织的RNA。同时剪
取幼叶以提取基因组DNA。
胁迫处理需要的玉米种子播种于营养土和蛭
石(1:3)配置成的基质中, 种植在人工培养箱中, 将
在人工培养箱中生长10 d的玉米幼苗, 用蒸馏水冲
洗根部, 分别进行ABA (100 μmol·L-1)、PEG (100
mmol·L-1)和NaCl (250 mmol·L-1)胁迫处理。取处
理0、1、3、6、12、24和48 h的整株幼苗, 供提取
RNA和酶液用。
2 ZmIDH2基因的获得
根据玉米中一个受干旱胁迫诱导表达的EST
(448 bp)序列, 将该EST在GenBank中进行Blastx比
对 , 获得玉米NADP+依赖的异柠檬酸脱氢酶基
因(NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase2,
ZmIDH2), 信息学查询表明该基因目前没有研究。
利用DNAStar软件分析该序列, 设计扩增ZmIDH2
序列全长的引物, 正向: 5′-GTCATCTTCTCCT-
CCTCAGA-3′, 反向: 5′-GGTGACGAAGCAT-
TCAAAGTA-3′, 以玉米幼苗cDNA为模版, 获得异
柠檬酸脱氢酶基因。扩增条件为94 ℃ 3 min;
94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 90 s, 40个循环; 最后
72 ℃延伸10 min; 重复3次。
3 ZmIDH2基因的表达分析
取不同材料及不同处理的总R N A进行
ZmIDH2基因的表达分析。利用M-MLV (Invitrogen)
反转录合成第一链cDNA。取1 μg总RNA按说明书
操作进行反转录, 将反转录产物稀释0、5、10、
20倍不同的梯度, 摸索较好的模板上样浓度, 进行
半定量PCR分析。基因表达分析所用的引物分别
为, 扩增ZmIDH2正向引物: 5′-ACGGAAATGACG-
GGTAACCG-3′, 反向引物: 5′-CTCCTTCACTAC-
GACTGCTG-3′; 平行扩增玉米Actin基因做内参,
正向引物: GCATCACACCTTCTACAACGA, 反向
引物: CAGCCTGGATAGCAACATACAT。PCR反
应条件为: 94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃
30 s, 28个循环; 最后72 ℃延伸5 min。扩增产物经
1.2%琼脂糖凝胶电泳分离检测。
4 序列分析及聚类图的构建
序列分析采用DNAstar软件(http:/www1d-
nastar1com/); 利用NCBI以及Maizesequence数据库
对基因进行比对分析; 蛋白的结构分析利用在线
软件预测(http://geno3d-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/d3_
geno3d2.pl), 利用Clustal W软件对来源于不同植物
的异柠檬酸脱氢酶基因进行序列比对和聚类分析
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)。Gen-
Scan软件分析基因组的内含子和外显子(http://
genes.mit.edu/GENSCAN.html)。
5 ZmIDH2酶液的提取和活力的测定
取1 g叶片置于4 ℃冰浴的研钵中研磨, 材料
提取液按1:4添加 , 提取缓冲液为50 mmol·L -1
HEPES-NaOH缓冲液(pH 7.5) [包括5 mmol·L-1
MgCl2、5 mmol·L
-1 EDTA-Na2、10% (V/V)甘油、
0.1% (V/V) TritonX-100和2% (W/V) PVP-10]。
在4 ℃、12 000×g下离心5 min, 去沉淀, 上清为酶
提取液, 备用。
IDH2活性测定按Murakami等(2006)的方法,
反应体系含有20 mmol MOPS (pH 7 .4 )、2
mmol·L-1 β-NAD+、5 mmol·L-1 MgSO4、1 mmol·L
-1
MnCl2、0.5 mmol·L
-1 AMP及25%体积的酶粗提
液。在终体积为3 mL的反应介质(Tris-HCl 100
mmol·L-1, pH 8.0)中加入0.3 mmol·L-1 DTT、5
mmol·L -1 MgCl2、1.5 mmol·L
-1 NADP、7.5
mmol·L-1异柠檬酸三钠和酶。
实验结果
1 ZmIDH2基因全长的克隆和DNA序列分析
前期我们构建了干旱条件下玉米花期的差减
文库, 其中的一个EST (545 bp)是受干旱胁迫诱导
袁进成等: 玉米NADP+-异柠檬酸脱氢酶基因克隆和特征分析 483
表达的, 将该EST在GenBank中进行Blastx比对, 发
现其与水稻的细胞质异柠檬酸脱氢酶基因(登录号
AF155334)有较高的相似性, 同时该EST和玉米的
一段EST序列有99%的相似性(登录号ACF82986.1),
软件分析表明登录号为ACF82986.1的序列是代表
一个基因全长的cDNA, 其编码产物为玉米细胞质
异柠檬酸脱氢酶基因, 目前还没有对该序列深入
研究的报导。基于此序列, 我们设计引物扩增, 获
得玉米异柠檬酸脱氢酶基因, 命名为ZmIDH2。
ZmIDH2基因全长1 643 bp, 编码412个氨基酸。
根据所得的ZmIDH2基因序列设计引物, 扩增
了玉米ZmIDH2基因组DNA, 结果表明玉米的
IDH2基因组DNA全长3 463 bp, 有11个内含子和12
个外显子。12个外显子的氨基酸大小分别为18、
37、12、29、21、34、31、34、44、43、88和21
个氨基酸。可以看到, 该基因的内含子和外显子
数量很多, 而且外显子的长度都较短, 其中倒数第
2个外显子最长, 为88个氨基酸(图1)。目前对植物
中IDH2基因组结构的研究报导不多, 仅拟南芥中
有3个IDH2 (At1g65930、At1g54340及At5g14590)
的基因组结构有报导, 3条编码IDH2的基因均为保
守的15个外显子/14个内含子的结构。
2 ZmIDH2的同源比对和进化树
将获得的ZmIDH2在NCBI数据库中进行同源
比对 , 表明其属于异柠檬酸脱氢酶家族(图2)。
ZmIDH2蛋白和水稻的异柠檬酸脱氢酶(EAY99113.1)
相似性非常高, 达到96%, 和谷子的异柠檬酸脱氢
酶(XP_004961158)相似性达到97% (图3), 同时和
其他植物如拟南芥的NADP-IDH2 (NP176768)相
似性达到86%, 和杨树的NADP-IDH2 (ABA18651)
的相似性达到87%。比对结果表明不同物种IDH2
的相似性很高, 这也表明该基因在进化中是非常
保守的, 应该在维持生物的功能中发挥重要作用。
获得的ZmIDH2在GenBank上进行查询, 获取
近100个不同植物的IDH2序列, 选取其中的38个有
代表性的序列, 利用Clustal W软件进行进化树分
析(图4)。结果表明植物中的IDH2的分类主要根据
物种和同工酶的种类来分类, 其中多数胞质IDH2
聚在一起, 而线粒体IDH2聚在一起, 相同类型的
IDH2主要按物种的亲源关系来聚类。玉米中的
ZmIDH2和水稻的OsIDH2关系最近, 聚为一类, 和
小麦、谷子等胞质的IDH2距离很近。IDH2在进
化上是高度保守的, 王鹏等(2009)曾对不同物种的
IDH进行聚类分析, 结果表明, 利用来自不同物种
的IDH可以将植物、动物和微生物分别聚为一类。
将获得的ZmIDH2进行蛋白结构预测, 预测结
果和细菌的IDH2相近, ZmIDH2由2个亚基组成, 它
们通过一个铰链区相连, 每个亚基间都有多个结
构域。和大多数异柠檬酸脱氢酶一样 , 玉米的
ZmIDH2有2个结构域, 其中一个结构域靠近C端,
有14个α螺旋和5个β折叠组成, 形成富含螺旋的区
域, 另一个结构域靠近N端, 含有16个β折叠和13个
α螺旋, 在2个结构域中间是空隙, 该空隙有助于2
个IDH形成异聚体, 同时有利于Mn等二价离子的
结合来发挥作用(图5)。
3 ZmIDH2基因的表达特征
提取玉米根、茎、叶、花丝、胚等不同组织
的RNA, 进行半定量RT-PCR。从检测的结果可以
看到ZmIDH2在玉米的不同组织部位和不同发育
时期都有表达。但是基因在根和胚中的表达量最
高, 在茎、叶组织中表达量较低(图6)。因为N的吸
收主要在根中, C的同化主要发生在胚等生殖器官,
所以IDH2的表达量变化也许受代谢调节, 与基因
的功能作用相一致。
因为最初我们是从玉米干旱胁迫文库中获得
图1 ZmIDH2的基因组DNA结构
Fig.1 The genomic structure of ZmIDH2
细线代表内含子, 黑框代表外显子。
图2 ZmIDH2在NCBI数据库中查询显示其属于异柠檬酸脱氢酶家族
Fig.2 Search on NCBI showed ZmIDH2 belong to cytosolic NADP+ dependent isocitrate dehydrogenase family
植物生理学报484
图3 玉米ZmIDH2和其他作物IDH2蛋白的比对分析
Fig.3 Alignment of ZmIDH2 and other protein in amino sequences
比对分析选用的蛋白(自上而下)分别为水稻的蛋白(EAY99113.1)、谷子的蛋白(XP_004961158)和玉米的ZmIDH2, 蛋白的一致性列在
比对结果的最下面。
的一段序列, 因此我们研究了该基因在不同逆境
条件下的诱导表达情况。提取不同处理(NaCl、
PEG和ABA)玉米幼苗RNA, 对ZmIDH2基因的转
录本进行分析。经过半定量PCR, 初步检测基因的
表达变化。图7可见基因表达的基本趋势 , 即
ZmIDH2为干旱和盐胁迫诱导表达(图7), 其中受盐
诱导表达明显, 在诱导初期基因的表达量就提高
至对照的近5倍, 当处理12 h时表达量达到了最高;
对于干旱处理基因也是快速应答的, 处理1 h基因
的表达量就迅速提高, 大约3 h达到了最高; 从半定
量PCR的结果可见, 基因的表达并不受ABA诱导。
我们从转录水平检测基因的表达特性, 那么
袁进成等: 玉米NADP+-异柠檬酸脱氢酶基因克隆和特征分析 485
图4 ZmIDH2基因的进化树分析
Fig.4 Phylogenetic tree for ZmIDH2
各物种中文和拉丁学名: 水稻Oryza sativa; 玉米Zea mays; 乌拉尔图小麦Triticum urartu; 山羊草Aegilops tauschii; 二穗短柄草Brachy-
podium distachyon; 谷子Setaria italica; 非洲油棕Elaeis guineensis; 拍琴虫Perkinsus marinus; 文昌鱼Branchiostoma lanceolatum; 赤拟谷盗
Tribolium castaneum; 拟南芥Arabidopsis thaliana; 醉蝶花Tarenaya hassleriana; 大豆Glycine max; 橹豆Glycine max; 白羽扇豆Lupinus albus;
豌豆Pisum sativum; 黄瓜Cucumis sativus; 胡萝卜Daucus carota; 芹菜Apium graveolens; 四叶参Codonopsis lanceolata; 轮叶党参Codonopsis
lanceolata; 碧桃Prunus persica; 梅Prunus mume; 沙梨Pyrus pyrifolia; 白梨Pyrus bretschneideri; 柠檬Citrus limon; 毛果杨Populus trichocarpa;
胡杨Populus euphratica; 蓖麻Ricinus communis; 鸡蛋果Passionfora edulis f. flavicarpa; 蓝桉树Eucalyptus globulus; 巨桉Eucalyptus grandis;
马铃薯Solanum tuberosum; 林烟草Nicotiana sylvestris; 芝麻Sesamum indicum; 小果野芭蕉Musa acuminate; 海枣Phoenix dactylifera; 葡萄
Vitis vinifera; 川桑Morus notabilis。
植物生理学报486
是否胁迫处理会影响IDH2酶的活性变化？因此提
取了不同处理玉米幼苗的酶液, 观察异柠檬酸脱
氢酶活性的变化(图8)。研究结果表明, IDH2酶活
性也受胁迫诱导表达, 在干旱处理约6 h时检测到
酶活性的提高, 在处理48 h时酶的表达量达到最高
值。盐胁迫下酶的表达量在6 h就达到最高, 为对
照的近4倍。虽然不同胁迫处理IDH2酶的活性变
化不同, 但是总的变化趋势一致, 即IDH2酶是受胁
迫诱导, 而且在胁迫诱导的条件下酶活性大幅度
提高。
讨　　论
依据细胞内的定位, 植物IDH存在4种形式的
同工酶, 包括细胞质IDH (cytIDH)、线粒体IDH
(mitIDH)、叶绿体IDH (chlIDH)和过氧化物酶体
IDH (perIDH) (Park和Kahn 1999; Udvardi等1993;
Hanschmann等2013)。我们获得是细胞质IDH。通
过GenBank的同源查询, 结果表明ZmIDH2和水
稻、拟南芥等细胞质的IDH2基因相似性最高。进
化树分析也表明, ZmIDH2的聚类首先和植物的细
胞质IDH2聚在一起, 然后再和亲缘关系近的物种
聚为一类。
在烟草、苜蓿、马铃薯、蚕豆等植物的各个
组织部位可以检测到IDH2的活性。我们的实验结
果也表明, 玉米中的IDH2是组成型表达, ZmIDH2
的转录本可以在玉米的根、茎、叶、花丝以及胚
中检测到, 但是在根和胚中的表达量要比其他部
位高。这种表达特性和在烟草、蚕豆、苜蓿、豌
豆以及其他植物中的结果一致(Chen等1988)。因
为NADP-IDH存在于细胞质, 在TCA循环中可以产
生2-OG, 而2-OG是联系C和N循环的主要物质, 可
以为植物的N代谢提供C骨架, 所以基因的表达特
性可能是受代谢调节的, 这也许是该基因在根和
胚中高效表达的原因。
IDH是产生NADPH的主要来源, IDH和生物
图5 ZmIDH2的空间立体结构图
Fig.5 Stereo drawing of the conformational
structure of ZmIDH
图6 ZmIDH2基因在玉米不同部位的表达情况
Fig.6 Relative expression of maize IDH2
in different maize organs
图7 ZmIDH2基因受盐、干旱和ABA胁迫诱导表达
Fig.7 Salt, drought and ABA stress response expression of
ZmIDH2 transcripts
图8 ZmIDH2在干旱和盐胁迫条件下酶活性的变化
Fig.8 The IDH2 enzyme activities levels were determined
under drought and salt stresses
袁进成等: 玉米NADP+-异柠檬酸脱氢酶基因克隆和特征分析 487
的活性氧产生密切相关, 在真核生物中IDH起重要
的抗氧化胁迫作用(Gálvez等2005; Hernández等
2001)。Jo等(2001)研究表明IDH在线粒体维持氧
化还原平衡以及抗氧化中起主要的作用。Lee等
(2010)的研究证明IDH在保护细胞抵御离子胁迫中
也有重要的作用。在盐胁迫的条件下, IDH的活性
在橄榄树的叶子中可以提高30%~50%。IDH受诱
导表达不仅变现在转录本提高上, 而且酶活性也
会提高(Murakami等2006)。我们的研究结果表明
ZmIDH2可以被高盐和PEG诱导表达, IDH2受诱导
表达不仅在转录本上提高, 而且酶活性也提高, 因
此保护细胞免受逆境因子的胁迫是IDH2的另一个
重要的生物学功能。但是该基因如何应答逆境胁
迫以及在抗逆中的作用还需要深入的研究, 我们
已经将该基因转化到拟南芥中, 以进一步深入研
究该基因的功能。
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