全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 12期，2009年 12月 1171
收稿 2009-08-28 修定 　2009-11-19
资助 黑龙江省自然科学基金(C2007-11)和东北农业大学创新
团队项目(CXZ00 4-3)。
* 通讯作者(E-mail: daidiche@yahoo.com.cn; Tel: 0451-
5 5 1 9 0 5 6 3 )。
18种绣线菊分子身份证的构建和 SCAR标记转化
刘慧民, 刘一佳, 吕贵娥, 车代弟 *
东北农业大学园艺学院, 哈尔滨 150030
提要: 取北方常见的 18种绣线菊, 用200条RAPD随机引物进行扩增, 选出10条引物扩增出的清晰稳定、重复性好的图谱
进行数据分析。10条引物共检测出 51个位点。对凝胶电泳得到的谱带统计结果并赋值, 用 ID Analysis 1.0软件进行数据
分析的结果表明, 仅需 6条引物对应的7个位点可将18种绣线菊完全区分。在RAPD扩增过程中, 找到三裂绣线菊的特异
标记SL700, 并将此标记转化成SCAR标记, 这一特异标记在分子水平可将三裂绣线菊与其他17种绣线菊区分开来。
关键词: 绣线菊; 分子身份证; RAPD标记; SCAR标记
Establishment of Molecular ID and Conversion to SCAR Marker in Eighteen
Spiraea Species
LIU Hui-Min, LIU Yi-Jia, LÜ Gui-E, CHE Dai-Di*
College of Horticulture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China
Abstract: A total of 18 Spiraea species common in North China were amplified by 200 randomly selected
primers with RAPD method. We chose 10 primers that had clear, stable and reproducible electrophoretic maps
for data analysis. There were 51 polymorphic sites detected from 10 primers. The bands of gel electrophoresis
were taken statistics, assigned, and analyzed by ID Analysis 1.0 software. The results showed that 18 Spiraea
species could be completely distinguished by 7 sites of 6 primers. In the RAPD amplification process, a specific
marker named SL700 of Spiraea trilobata was found, and SL700 was converted to SCAR marker. Using the
specific marker, Spiraea trilobata could be distinguished from other Spiraea species at a molecular level.
Key words: Spiraea L.; molecular ID; RAPD marker; SCAR marker
蔷薇科(Rosaceae)中最古老的亚科绣线菊亚科
约 100余种, 我国有 50余种, 各省均有分布。绣
线菊属(Spiraea L.)是绣线菊亚科中最原始的属, 在
系统进化过程中, 衍生出形态各异而亲缘关系紧密
的绣线菊种类, 以致后代表型上极为相似而难以区
分(Iizuka和Kudo 2001, 2003)。随着DNA分子标
记技术的不断发展, 采用DNA指纹技术可鉴定表型
上难以鉴别的种或品种(刘本英和成浩 2007; 佘花
娣等2003), 所以尝试将DNA 分子水平鉴定技术用
于绣线菊资源遗传分析、资源评价及(品)种间区
分是有意义的。迄今仅见到部分绣线菊资源叶片
表皮结构、花粉形态特征、药理成分分析与提取
技术、DNA的提取方法及RAPD反应体系的优化
的报道(Chen等 2004; 房慧旺等 2008), 而对绣线菊
资源的遗传特性分析则几乎是空白。因此本文采
用RAPD标记手段在DNA水平上对18种绣线菊进
行了初步探讨, 根据 RAPD图谱的条带特征赋值,
借助我校自主研发的专用ID Analysis 1.0软件的分
析结果, 为北方地区常见的18种绣线菊构建了一套
一一对应的 “ 分子身份证(molecular ID)”, 并将
RAPD标记转化为稳定的 SCAR标记, 从而为在分
子水平上区分绣线菊种类提供参考资料, 以期为系
统深入研究进行绣线菊种质资源遗传多样性和亲缘
关系建立基础。
材料与方法
试验所用的 18种绣线菊(Spiraea Linn.)取自黑
龙江省森林植物园和本校设施园艺工程中心(表1)。
用改良的CTAB法对基因组DNA进行提取(管
晓庆等2007), 优化RAPD反应体系和反应程序, 确
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采用胶回收试剂盒进行分离纯化, 回收纯化后的片
段经过定量后, 将片段克隆到pEASY-T3载体上, 转
入到DH5α感受态细胞中, 提取质粒, 酶切验证为
正确克隆后, 在上海生物工程技术有限公司完成测
序(何光源 2007)。
根据测得的序列, 利用 Primer 5.0软件, 遵循
引物设计规则设计一对17~25 bp SCAR引物, 在上
海生物工程技术有限公司合成, 据已优化的RAPD
反应体系和程序, 进一步优化和确定SCAR-PCR的
反应体系和程序, 验证 SC AR 标记与原对应的
RAPD标记的扩增结果是否一致。
实验结果
1 18种绣线菊分子身份证的构建
植物种或品种的分子身份证可以分为2类: 一
类是含有特异位点的种或品种, 可以依靠这样的特
异位点利用单一引物直接确定鉴定的种类; 由于具
有特异位点的种类较少, 因此更多种类的区分只能
以多个引物的位点组合加以区分, 即用 2条以上的
引物组合的位点来区分种类, 当2条引物不能完全
区分所有种类时, 还可以通过增加引物数对种类加
以区分, 直到把所有种类区分开为止。植物种或品
种的分子身份证利用资源特征分析软件 ID Analy-
sis 1.0分析获得(高运来等 2009)。经过软件分析,
10条引物共检测出 51个位点, 每个引物能检测到
的位点范围为 4~7个, 平均为 5.1个, 仅用 6条引
物对应的 7个位点可将 18种绣线菊完全区分开。
这 7 个位点分别为 y1- 1、y5- 5、y7- 5、y8- 3、
y9-5、y10-2、y10-3。y1-1代表的是第 1条引物
的第 1位点, y5-5代表的是第 5条引物的第 5位点,
依此类推。6条引物的碱基序列见表 2, 并按照上
述 7个位点的先后顺序绘出 18种绣线菊的区分流
程图; 根据不同引物和位点的匹配, 用 0、1数组
的不同组合加以区分, 建立了各个绣线菊的分子身
份证(图 1、表 3 )。
2 18种绣线菊RAPD特异标记的获得
如 RAPD扩增图谱(图 2)所示, 经过重复试验,
获得三裂绣线菊和石棒绣线菊的特异分子标记, 分
别记为SL700和SB500, 从图中可以看出, 每个特异扩
增产物分别只在 1个材料中出现, 具有种间特异
性。由图 2-a谱带分布看出, 在 700 bp处, 只有三
裂绣线菊出现条带, 其他绣线菊均不出现条带, 证
表 1 试验材料的拉丁文学名
Table 1 The Latin name of experiment materials
编号 种(品种)名
1 毛果绣线菊(Spiraea trichocarpa Nakai)
2 金山绣线菊(Spiraea×bumalda cv. Gold Mound)
3 金丝桃叶绣线菊(Spiraea hypericifolia Linn)
4 华北绣线菊(Spiraea fritschiana Schneid.)
5 美丽绣线菊(Spiraea elegans Pojark.)
6 珍珠绣线菊(Spiraea thunbergii Sieb. et Bl)
7 柳叶绣线菊(Spiraea salicifolia Linn.)
8 三裂绣线菊(Spiraea trilobata Linn.)
9 石棒绣线菊(Spiraea media Schmidt)
1 0 毛花绣线菊(Spiraea dasyantha Bunge)
1 1 石蚕叶绣线菊(Spiraea chamaedryfolia Linn.)
1 2 土庄绣线菊(Spiraea pubescens Turcz.)
1 3 绢毛绣线菊(Spiraea sericea Turcz.)
1 4 曲萼绣线菊(Spiraea flexuosa Fisch. ex Cambess.)
1 5 耧斗菜叶绣线菊(Spiraea aquilegifolia Pall.)
1 6 楔叶绣线菊(Spiraea canescens D. Dons)
1 7 金焰绣线菊(Spiraea×bumalda cv. Gold Flame)
1 8 日本绣线菊(Spiraea japonica Linn)
定最佳的 20 μL反应体系为: 10×Taq缓冲液 2 μL、
Taq DNA聚合酶 1 U、dNTP 0.15 mmol·L-1、模
板DNA 20 ng·μL-1、引物 0.2 μmol·L-1、Mg2+ 2.5
mmol·L-1。最佳反应程序为: 94 ℃预变性 4 min;
之后进行 35个循环, 94 ℃变性 45 s, 38 ℃退火 1
min, 72 ℃延伸 1 min; 最后延伸10 min, 4 ℃终止反
应。用上述反应条件对购自上海生物工程技术有
限公司的 200条RAPD引物进行初筛和复筛, 筛选
出扩增条带清晰、重复性好的 10条引物的扩增谱
带做数据分析。
根据琼脂糖凝胶电泳(何光源 2007)的结果记
录清晰可重复的RAPD条带。数据分析时, 对于同
一引物的扩增产物, 迁移率相同的条带记为1个位
点, 有DNA扩增带(显性)记为 1, 无带记为 0, 强带
和可清晰分辨的弱带赋值均为 1, 将 RAPD扩增结
果转化成0/1矩阵用于进一步的分析。任一位点若
有一个个体不同于其它个体即为一个多态性位点,
这些特异位点所组合的字符串就可以代表相应品种
的分子身份证(高运来等 2009)。18种绣线菊分子
身份证建立采用本校自行研发的资源特征分析软件
(ID Analysis 1.0, 软件登记号2007SR11870)进行分
析。
在紫外灯下从琼脂糖凝胶上将目的片段切下,
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明三裂绣线菊在 700 bp处出现的条带为特异条带。
由图 2-b 谱带看出, 在 500 bp处, 只有石棒绣线菊
出现条带, 其他绣线菊均不出现条带, 说明石棒绣
线菊在 500 bp处出现的条带为特异条带。
3 RAPD产物的测序及SCAR引物设计
试验中共获得2个RAPD特异片段, 回收并对
表 2 6条引物的碱基序列
Table 2 The base sequences of 6 primers
引物编号 引物序列 引物编号 引物序列
y 1 GGTCGGAGAA y 8 CTGCTGGGAC
y 5 ACATCAGCCC y 9 ACGGTACCAG
y 7 GGGAATTCGG y10 GACGCCACAC
表 3 18种绣线菊的分子身份证
Table 3 The molecular ID of 18 Spiraea species
编号 种(品种)名 分子身份证 经典分类 编号 种(品种)名 分子身份证 经典分类
1 毛果绣线菊 0011000 复生伞形花序组楔叶系 5 美丽绣线菊 1011101 长伞形花序组三裂系
1 6 楔叶绣线菊 0101110 复生伞形花序组楔叶系 1 4 曲萼绣线菊 1001111 长伞形花序组石蚕叶系
1 8 日本绣线菊 1010100 复生伞形花序组粉花系 1 1 石蚕叶绣线菊 1100110 长伞形花序组石蚕叶系
4 华北绣线菊 0001101 复生伞形花序组粉花系 9 石棒绣线菊 1000111 长伞形花序组欧亚系
1 7 金焰绣线菊 1101011 复生伞形花序组粉花系 1 3 绢毛绣线菊 1111011 长伞形花序组 欧亚系
2 金山绣线菊 1001011 复生伞形花序组粉花系 3 金丝桃叶绣线菊 0111101 长伞形花序组 全缘系
1 0 绒毛绣线菊 1001110 复生伞形花序组长芽系 1 5 耧斗菜叶绣线菊 0111011 短伞花序组全缘系
8 三裂绣线菊 0001011 伞形花序组三裂系 6 珍珠绣线菊 1011110 短伞花序组李叶系
1 2 土庄绣线菊 0101111 伞形花序组三裂系 7 柳叶绣线菊 1011000 圆锥花序组
图 1 18种绣线菊的区分流程图
Fig.1 The distinguishing flow chart of 18 Spiraea species
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其测序, 根据序列结果设计引物。将得到的序列在
GenBank上做Blast分析, 进行同源性比较, 未发现
与GenBank中已有序列有较高同源性。根据其序
列结果, 设计 2对 SCAR引物, 其序列如下。SL700
SCAR引物: Sence 5 CAACTTCTGAGATCGGTAAT
3; Anti-sence 5 GCGAGTCCAATGCCTAT 3。SB500
SCAR引物: Sence 5 GCTCACCGAAATAGAAGAT
3; Anti-sence 5 GCACCGATAGGCAAAC 3。
4 SCAR标记的转换
采用材料与方法中描述的20 μL反应体系, 反
应终止, 将SL700 RAPD标记成功地转换成了SCAR
标记(图 3)。在设置了不同反应体系和反应程序
下, 除了石棒绣线菊外, 柳叶、毛果、金丝桃叶、
耧斗菜叶绣线菊均能在500 bp处扩增出条带, 说明
SB500片段不具有种间特异性。SB500没能转换成
SCAR标记。
讨　　论
Moreno等 (1996)根据RAPD标记分析22个蔷
薇野生种, 扩增所得RAPD谱带将这些种归类到与
图 2 绣线菊RAPD特异分子标记图谱
Fig.2 Electrophoretic maps of specific RAPD markers in Spiraea species
a、b分别表示特异 RAPD标记 SL700和 SB500的电泳图谱; 泳道 1~18对应 18种绣线菊; M: DNA分子量标准DL2000; 箭头示特
异条带 SL700和 SB500。
图 3 绣线菊 SCAR标记的电泳图谱
Fig.3 Electrophoretic maps of SCAR markers in Spiraea species
a、b分别为特异标记 SL700的 RAPD 扩增图谱和对应的 SCAR 扩增图谱。泳道 1~18 对应 18 种绣线菊; M: DNA分子量标准
D L 2 0 0 0。
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它们的遗传背景分类相同的类群内, 而且表明
RAPD技术是分析关系相近和关系较远种和品种的
快捷、简单和可靠的方法。Jan等(1999)用 RAPD
标记分析 119个蔷薇植株, 38个种, 其中 36个种包
括了Eurosa亚属的 8个组, 另 2个种属于Hesperh-
odos亚属和Platyrhodon亚属。采用RAPD标记技
术, 也可建立快速简便的绣线菊实验室鉴定方法(干
滟等2001; Vilanova 等 2001), 但RAPD却具有不够
稳定和重复性不好的缺点(王斌等1999), Weeden等
(1994)的研究表明RAPD标记检测误差在5%~10%
之间。Lahogue等(1998)认为可将RAPD标记转化
为SCAR-PCR标记, 从而增强所获得的RAPD标记
的特异性。但SCAR标记转化的成功率很低(Mulut
等 2008), Horejsi等(1999)曾获得 75个RAPD标记,
其中只有 48个(64%)成功地转化成了 SCAR标记,
而只有15%的SCAR标记表现出了应有的多态性。
本文选择稳定表达的 2条特异性条带, 对其进行了
纯化、测序, 然后设计引物进行 SCAR-PCR 扩增
的结果显示, SCAR标记在绣线菊属植物种质资源
鉴定方面有一定的潜在应用前景, 本文中的特异标
记 SL700 成功转化成 SCAR标记, 此标记是三裂绣
线菊区别于其它种类绣线菊的一个特异标记, 由于
三裂绣线菊的叶片形态比其他绣线菊有明显的“深
裂 ”特点, 据此推测, SL700特异标记可能是对应三
裂绣线菊叶片 “深裂 ”这一形态特征的分子标记,
或者还可能对应的是其它未在外部形态上表现出来
的隐性性状, 如果进一步用转基因技术, 将控制这
个性状的特定基因转到其他叶片不具深裂特点的绣
线菊种类上, 观察其是否出现 “叶片深裂 ”的性状
就可以加以验证。
以往对电泳图谱的分析多用指纹图谱的方法,
指纹图谱是能够鉴别生物个体之间差异的电泳图
谱, 其电泳图谱多态性丰富, 具有高度的个体特异
性和环境稳定性, 指纹图谱技术可用于品种的鉴定
工作。Hermat等(1992)用 Rome Beauty×White
Angle组合杂交后代56株曾构建出2张苹果分子遗
传图谱。Rajapakse等(1995)用 F1代自交后获得的
71株 F2群体也构建了桃的分子遗传图。指纹图谱
鉴定品种的基础在于对比不同种间谱图中的差异,
需要建立精确准确的图谱, 因此不易于种间区分(高
运来等2009)。本文构建的分子身份证与指纹图谱
的区别在于分子身份证把定性数据赋值后变成定量
数据, 采用资源特征分析软件(ID Analysis 1.0)分析
后, 得出位数一定但排列方式不同的数码与绣线菊
不同种的一一对应的结果, 这种结果相当于给每一
个待分析的种类赋予一个“身份证号码”, 可以直观
的区分各种类间的差异。本文仅用6条引物的7个
位点组合即为18种绣线菊构建了一套特定分子身
份证, 并将 18种绣线菊从DNA水平完全区分开。
对18种绣线菊的分子身份证数组分析, 同是经典分
类中(中国科学院植物志编委会1979)复生伞形花序
组楔叶系的毛果、楔叶绣线菊, 其分子身份证中都
有 1组 “110”存在, 复生伞形花序组粉花系的金
山、金焰、日本、华北绣线菊, 其分子身份证中
都有 1组 “101”存在, 同是经典分类中伞形花序组
三裂系的三裂、土庄、美丽绣线菊, 其分子身份
证中都有1组“1011”存在, 伞形花序组石蚕叶系的
曲萼、石蚕叶绣线菊, 其分子身份证中都有 1组
“10011”存在, 伞形花序组欧亚系的石棒、绢毛绣
线菊, 其分子身份证中都有 1组 “011”存在, 说明
绣线菊分子身份证的相同信息一定程度上与经典分
类学的某些共同的形态特征相对应, 从而说明这些
绣线菊有相近的亲缘关系和相同或相似的起源。
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