全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (7): 1133~1141　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0217 1133
收稿 2015-04-13　　修定 2015-06-04
资助 辽宁省农业科技创新团队项目(2014204007)。
* 通讯作者(E-mail: xx47@dlut.edu.cn; Tel: 0411-84706356)。
蓝莓花芽休眠与解除过程中生理生化变化及DNA甲基化差异分析
李波, 夏秀英*, 刘思
大连理工大学生命科学与技术学院, 辽宁大连116024
摘要: 以‘伯克利’蓝莓花芽为材料, 研究了其在内休眠及解除休眠过程中部分生理生化指标的变化, 并对内休眠与解除休眠
花芽进行了基因组DNA甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplified polymorphism, MSAP)分析。结果显示, 蓝莓
花芽中脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量及SOD、POD活性的变化趋势与休眠进程密切相关。内休眠期间, 脯氨酸含
量呈先降后升的趋势, 可溶性糖含量及POD活性持续上升, 可溶性蛋白含量及SOD活性持续下降; 随着休眠开始解除, 可溶
性糖、可溶性蛋白含量及SOD活性均上升, 而POD活性下降。MSAP分析表明, 蓝莓花芽内休眠期间, DNA甲基化水平较
高, 并以全甲基化为主; 内休眠花芽总甲基化率(38.41%)、全甲基化率(27.09%)及半甲基化率(11.32%)均明显高于解除休眠
花芽; 相对于内休眠花芽, 解除休眠花芽约84.48%的位点发生了甲基化模式变化, 其中去甲基化位点数和比例分别为248和
40.52%, 超甲基化的位点数和比例分别为185和30.23%。DNA甲基化参与了蓝莓内休眠的调控。
关键词: 蓝莓; 休眠; 生理生化特性; DNA甲基化; 甲基化敏感扩增多态性
Changes in Physiological and Biochemical Properties and Variation in DNA
Methylation Patterns during Dormancy and Dormancy Release in Blueberry
(Vaccinium corymbosum L.)
LI Bo, XIA Xiu-Ying*, LIU Si
School of Life Science and Biotechnology, Dalian University of Technology, Dalian, Liaoning 116024, China
Abstract: Changes in soluble sugar and protein contents, superoxide dismutase (SOD) and peroxidase (POD)
activities in floral buds of ‘Berkeley’ were studied during dormancy period. The results indicated that the pro-
line content showed a rising trend after an initial drop, the soluble sugar content and the POD activity continued
to rise, the soluble protein content and SOD activity continued to decline during endodormancy. With the begin-
ning of dormancy release, the soluble sugar and protein contents, the SOD activity increased, while the POD
activity decreased. DNA methylation patterns were subsequently analyzed by methylation sensitive amplified
polymorphism (MSAP) technology with 56 pairs of primer. The results showed that the level of methylation in
dormant buds was high, among which full methylation was dominant. The levels of total DNA methylation,
hemi-methylation and fully methylation were down-regulated during bud dormancy release. About 84.48%
methylation loci varied during dormancy release when compared with dormancy, among which DNA demethyl-
ation loci were 248 with percentages of 40.52%, DNA hypermethylation loci were 185 with percentages of
30.23%. The results implied that DNA methylation is involved in the regulation of the dormancy in blueberries.
Key words: blueberry; dormancy; physiological and biochemical characteristics; DNA methylation; methyla-
tion sensitive amplified polymorphism
芽休眠是指植物生活史中芽生长暂时停顿的
现象, 是植物经过长期演化而获得的一种对环境
及季节性变化的生物学适应(Anderson等2001)。
落叶果树芽的自然休眠是为抵御冬季的低温环
境。自然条件下, 进入休眠的植株需要经过一定
时间的低温积累才能解除休眠、正常萌发生长,
低温不足, 芽萌发及树体生长发育会出现障碍或
异常, 严重影响果树生产(Arora等2003)。芽休眠
是温暖地区落叶果树栽培和设施果树生产的主要
限制因子之一(李宪利等2001)。对芽休眠及解除
机制进行系统研究, 对于开发有效的人工破眠技
术, 实现落叶果树可控栽培有重要意义。
植物生理学报1134
目前, 已从生物学及解剖结构特性、生理生
化变化、活性氧代谢、差异表达基因等多个角度
对芽休眠的机制进行了研究。表明, 低温可以诱
导植物体内某些基因的表达, 恢复细胞间的信号
转导, 是诱导芽休眠发生和解除的关键因素(Rinne
等2011)。碳水化合物代谢、活性氧代谢及多胺等
激素的代谢与休眠的诱导、维持及解除密切相关
(田莉莉等2006; Noriega等2007; 张昂等2012; 冯晶
红等2013)。Ca2+可传递环境信号, 在诱导芽自然
休眠和维持芽的深度休眠中具有重要的作用(王孝
娣等2008)。休眠芽内H2O2信号和Ca
2+信号相关联,
可能在高温和单氰胺打破休眠的信号转导中起重
要作用(谭钺等2015)。碳水化合物代谢、种子脱
水、信号转导、衰老等多条代谢途径相关基因可
能都参与了休眠的调控(郑鹏华等2013; Wang等
2014)。
DNA甲基化(DNA methylation)是最重要的表
观遗传修饰形式之一 , 与植物的生长发育、防
御、逆境胁迫等生命活动密切相关, 在植物体的
整个生命过程都发挥着重要调节作用(Boyko和
Kovalchuk 2008; Tang等2014; 李青芝等2014)。研
究表明, DNA甲基化在调节芽休眠的过程中可能
也起着重要调控作用。Finnegan等(1998)的研究表
明, DNA甲基化可以调节春化作用促进开花。Law
和Suttle (2002)的研究发现, 马铃薯块茎休眠诱导
和解除过程中伴随着强烈的DNA甲基化过程。盖
树鹏等(2012)的研究表明, 牡丹内休眠期间花芽内
DNA甲基化程度很高, 甲基化位点占总位点比率
的60%以上, 在低温处理进程中, 甲基化水平呈下
降趋势, 与未经低温的对照相比, 约50%的位点发
生了甲基化模式变化, DNA甲基化参与了牡丹内
休眠的调控。
蓝莓, 学名越橘, 属于杜鹃花科越橘属(Vac-
cinium spp.)小浆果果树, 其果实中抗氧化物质花色
素苷的含量在众多果蔬中高居榜首(Prior等2001),
在抗衰老、抗癌及提高免疫力等方面具有明显的
功效。近年来, 蓝莓鲜果市场需求不断增加。但
由于对蓝莓芽休眠及其解除机制认识不足, 栽培
生产中往往出现引种失败、花芽休眠解除不彻
底、产量低、设施栽培技术落后等问题, 限制了
蓝莓的栽培及推广 , 严重影响了蓝莓产业的发
展。目前, 我国尚未开展蓝莓芽休眠及其调控的
相关研究。
本研究以蓝莓品种‘伯克利’为材料, 检测了花
芽休眠及解除过程中的可溶性糖及可溶性蛋白含
量、抗氧化酶活性等的变化, 并对处于内休眠及
解除休眠时期的花芽进行了甲基化敏感扩增多态
性(methylation sensitive amplified polymorphism,
MSAP)分析, 以了解芽休眠及解除进程中的生理
生化及DNA甲基化变化, 为全面理解蓝莓芽休眠
及解除的机理, 并在此基础上开发有效人工破眠
技术提供新的证据及思路。
材料与方法
1 材料
实验用蓝莓学名高丛越橘(Vaccinium corym-
bosum L.)品种为‘伯克利’ (‘Berkeley’), 材料采集于
大连市城子坦地区蓝莓种植基地10年生树, 试验
期间未进行修剪和化学药剂处理。
2 萌芽率统计
采集带有饱满、健康花芽的蓝莓枝条, 置于
装有清水的玻璃瓶中, 以淹没基部2~3 cm为宜, 立
即放入培养室中培养, 培养条件为: 光周期12 h∙d-1,
光照强度320 µmol·m-2·s-1; 温度(25±3) ℃; 空气相
对湿度75%。每隔2 d换一次水, 同时剪去基部少
许, 露出新茬。培养3周后统计萌芽率, 以花芽顶
端露绿为萌芽标准。当水培枝条第1个芽萌发时
间≥10 d时, 判定该枝条进入内休眠(王海波等
2009); 萌芽率≥50%时的采样日期为内休眠解除的
日期(郑鹏华等2013)。每处理3个枝条, 重复3次。
3 生理生化指标测定
可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含
量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)
和过氧化物酶(peroxidase, POD)活性测定方法参照
植物生理学实验教程(路文静和李奕松2012)。测
定使用材料均为蓝莓花芽。
4 DNA提取
采用天根生化科技(北京)有限公司的试剂盒
(DP 305)提取内休眠及解除内休眠的蓝莓花芽基
因组DNA。得到的DNA用ddH2O溶解, 经1%琼脂
糖凝胶电泳及NanoDrop 2000超微量分光光度计检
测, –20 ℃保存备用。
李波等: 蓝莓花芽休眠与解除过程中生理生化变化及DNA甲基化差异分析 1135
5 甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析
参考Xiong等(1999)的方法进行酶切、连接、
PCR扩增及电泳, 对分析过程中的关键步骤进行了
优化。MSAP分析采用的接头序列、预扩增引物
及选择性扩增引物见表1。接头和引物均由生工
生物工程(上海)有限公司合成。试验所用Ex Taq
DNA polymerase购自TaKaRa (大连)公司, T4 DNA
Ligase、限制性内切酶购自Thermo公司。
表1 MSAP分析所用接头跟引物序列表
Table 1 Adapters and primers used in MSAP analysis
引物类型
引物名称及碱基序列(5′→3′)
EcoRI (E) HpaII/MspI (H/M)
接头 EA1 CTCGTAGACTGCGTACC HMA1 GATCATGAGTCCTGCT
EA2 AATTGGTACGCAGTC HMA2 TCATGATCCTGCTCG
预扩增引物 E GTAGACTGCGTACCAATTCA HM ATCATGAGTCCTGCTCGG
选择性扩增引物 E1 GTAGACTGCGTACCAATTCAAC HM1 ATCATGAGTCCTGCTCGGAG
E2 GTAGACTGCGTACCAATTCACT HM2 ATCATGAGTCCTGCTCGGCCA
E3 GTAGACTGCGTACCAATTCACA HM3 ATCATGAGTCCTGCTCGGTGC
E4 GTAGACTGCGTACCAATTCATC HM4 ATCATGAGTCCTGCTCGGTAG
E5 GTAGACTGCGTACCAATTCAGC HM5 ATCATGAGTCCTGCTCGGTCA
E6 GTAGACTGCGTACCAATTCAGG HM6 ATCATGAGTCCTGCTCGGTCAA
E7 GTAGACTGCGTACCAATTCACC HM7 ATCATGAGTCCTGCTCGGTCCA
E8 GTAGACTGCGTACCAATTCAAG

对2组DNA分别进行EcoRI/HpaII和EcoRI/
MspI 2个组合酶切。酶切反应体系20 µL, 含基因组
DNA 600 ng, EcoRI 10 U, HpaII或MspI 10 U,
10×Tango Buffer 2 µL。37 ℃酶切6 h。反应结束后,
用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果。随后进行
接头连接, 反应体系30 µL, 含双酶切产物20 µL,
HpaII/MspI接头HMA1、HMA2各50 pmol, EcoRI接
头EA1、EA2各50 pmol, T4 DNA Ligase 1 U, 10×T4
DNA Ligase Buffer 3 µL。16 ℃连接12 h。连接产
物稀释5倍后进行预扩增。预扩增体系25 µL, 含连
接产物稀释液3 µL, EcoRI预扩增引物E 10 pmol,
HpaII/MspI预扩增引物HM 10 pmol, 10 mmol·L-1
dNTP 2 μL, TaKaRa Ex Taq 1 U。预扩增反应程序
为94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 56 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min,
20个循环; 72 ℃延伸10 min。反应结束后, 将预扩
增产物稀释5倍用于选择性扩增, 反应体系20 µL,
含预扩增产物稀释液2 µL, 选择性扩增引物10
pmol, 10 mmol·L-1 dNTP 2 μL, TaKaRa Ex Taq 1 U。
反应程序为94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 65 ℃ (每个循环
下降1 ℃) 30 s, 72 ℃ 1 min, 共10个循环; 94 ℃ 30 s,
56 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 35个循环; 72 ℃延伸10
min。选择扩增产物变性后, 取8 μL进行6%变性聚
丙烯酰胺凝胶电泳, 电泳结束后硝酸银染色观察。
电泳结果中, EcoRI/MspI酶切泳道记作M,
EcoRI/HpaII酶切泳道记作H, 对M及H泳道条带数
及带型进行统计, 在同一位点, 有带和无带分别记
为“1”和“0”。
实验结果
1 ‘伯克利’蓝莓花芽休眠进程的确定
以花芽萌发率判断休眠阶段(图1)。观察发
现, 2013年10月15日采集的花芽萌芽率为85.16%,
此后萌芽率持续降低 , 表明已进入休眠诱导时
期。11月15日采集的花芽, 第1芽13 d萌发, 大于
10 d, 表明花芽已开始进入内休眠。随着温度继
续降低及日照长度变短, 花芽休眠程度进一步加
深。11月22日采集的花芽完全不能萌发, 表明此
时花芽休眠程度最深。12月14日采集的花芽萌芽
率开始升高, 12月30日采集的花芽萌芽率已达到
98%, 表明内休眠已经完全解除。认为在本实验
年度, 蓝莓‘伯克利’ 10月30日开始进入休眠诱导
状态, 11月15日至12月15日期间, 蓝莓花芽处于内
休眠时期, 休眠不能被人工打破。12月30日内休
眠完全解除。分别用12月15日及12月30日采集的
花芽作为内休眠及解除休眠的材料, 用于MSAP
分析。
植物生理学报1136
2 ‘伯克利’蓝莓花芽休眠及解除期间生理生化变化
脯氨酸含量在诱导休眠及内休眠的前期呈下
降趋势, 内休眠后期开始急剧上升, 一直持续到休
眠解除之后(图1)。
在整个休眠期间, 可溶性糖含量的变化趋势
与可溶性蛋白相反(图1)。在诱导休眠期, 可溶性
糖含量下降, 可溶性蛋白含量上升; 进入内休眠时,
芽体内可溶性糖含量最低, 可溶性蛋白含量最高;
在整个内休眠期可溶性糖含量持续上升, 可溶性蛋
白含量持续下降。在休眠开始解除时, 可溶性蛋白
及可溶性糖含量的变化趋势变得一致, 均上升。
在两种抗氧化酶中, SOD活性在内休眠期一
直呈下降趋势, 在内休眠解除前降到最低, 而在内
休眠解除后急剧上升, 这与邵浩和马锋旺(2004)在
梨树中的研究结果一致。POD活性在整个内休眠
期间一直呈上升趋势, 在内休眠解除前升至最高,
内休眠完全解除后下降。表明低的SOD活性、高
的POD活性有利于解除蓝莓花芽休眠, 促使花芽
萌发。这与张昂等(2012)在葡萄中的研究相同。
3 内休眠及解除休眠期‘伯克利’花芽DNA甲基化
水平变化分析
HpaII和MspI均能识别并切割5′-CCGG-3′序
列, 但对于不同甲基化状态的敏感性不同。HpaII
能够识别并切割单链甲基化位点; MspI对全甲基
化的内部胞嘧啶敏感。基因组DNA经过EcoRI/
HpaII (H)和EcoRI/MspI (M)酶切后通常产生4种带
型。类型I: M、H两条泳道均有带, 说明无甲基化
发生, 代表非甲基化位点; 类型II: H泳道有带而M
泳道无带, 表明单链DNA发生甲基化, 代表半甲基
化位点; 类型III: H泳道无带而M泳道有带, 表明双
图1 休眠进程的确定及生理生化变化
Fig.1 Determination of the dormancy process and detection of physiological and biochemical changes
李波等: 蓝莓花芽休眠与解除过程中生理生化变化及DNA甲基化差异分析 1137
链DNA内侧发生甲基化, 代表全甲基化位点; 类型
IV: 两泳道均无带, 为双链DNA外侧发生甲基化。
在聚丙烯酰胺凝胶电泳中只能检测到前3种甲基
化类型。
选择8个EcoRI选择性扩增引物和7个HpaII/
MspI选择性扩增引物形成56对引物组合, 对两种
休眠状态的蓝莓花芽基因组DNA进行扩增(部分
引物组合扩增结果如图2)。内休眠花芽共产生539
条清晰可辨的条带, 在全部扩增条带中检测到总
甲基化位点207个, 总甲基化率为38.41%。其中全
甲基化位点146个, 全甲基化率为27.09%; 半甲基
化位点61个, 半甲基化率为11.32% (表2)。解除休
眠蓝莓花芽共扩增产生438条清晰可辨的条带, 检
测到总甲基化条带113条, 总甲基化率为25.80%。
其中, 全甲基化条带73条, 全甲基化率为16.67%;
半甲基化条带40条, 半甲基化率为9.13% (表2)。表
明, 蓝莓内休眠及解除休眠花芽基因组DNA全甲
基化水平高于半甲基化水平; 内休眠时期, 蓝莓花
芽的DNA甲基化水平较高, 以全甲基化为主; 解除
休眠过程中, 蓝莓花芽DNA甲基化水平降低。
图2 内休眠及解除休眠蓝莓花芽甲基化敏感位点扩增电泳结果
Fig.2 Examples of MSAP profiles in blueberry floral bud during endodormancy and dormancy release
1~12为12对选择性扩增引物; 每组引物从左至右4条泳道依次为内休眠花芽DNA经MspI/EcoRI酶切、解除休眠花芽DNA经MspI/
EcoRI酶切、内休眠花芽DNA经HpaII/EcoRI酶切、解除休眠花芽DNA经HpaII/EcoRI酶切; A1、A2、A3、A5、B5、D1、D3为基因组
DNA不同的甲基化模式(表3); M: DL2000 DNA Marker。
表2 蓝莓不同休眠状态基因组DNA的甲基化水平
Table 2 The degree of genomic DNA methylation of different dormancy period of blueberry
甲基化水平
休眠状态 类型I 类型II 类型III
总扩增带数
总甲基化条带数 完全甲基化带数 半甲基化带数
及比例 及比例 及比例
内休眠 332 61 146 539 207 (38.41%) 146 (27.09%) 61 (11.32%)
解除休眠 325 40 73 438 113 (25.80%) 73 (16.67%) 40 (9.13%)

植物生理学报1138
4 内休眠及解除休眠期‘伯克利’花芽DNA甲基化
模式变化分析
56对引物共扩增出15种带型(表3, 图2), 分多
态性和单态性2种。单态性指内休眠花芽与解除
休眠花芽间有相同的带型, 表明甲基化模式没有
改变, 此类位点共有95个, 占总位点数的15.52%
(表4, D型), 即在内休眠和解除休眠过程中15.52%
的位点的甲基化模式保持不变。多态性是指内休
眠与解除休眠花芽中的DNA甲基化模式不同, 此
类位点共有517个, 占总位点数的84.48%。在多态
性变异类型中, 发生去甲基化(表4, A型)的位点数
为248个, 占总位点的40.52%, 比例最高, 表明解除
休眠的花芽中基因组在这些位点发生了去甲基化;
发生超甲基化(表4, B型)的位点数为185个, 占总位
点的30.23%, 表明解除休眠的花芽中基因组在这
些位点发生了甲基化; 发生不定型改变(表4, C型)
的位点数为84个, 占总位点数的13.73%, 表明这些
位点在解除休眠花芽中甲基化水平呈现上升或降
低的趋势。可见, 花芽解除休眠过程中同时发生
甲基化和去甲基化, 但发生去甲基化的机率明显
大于发生甲基化的机率。
表4 蓝莓不同休眠状态基因组DNA的甲基化模式比例
Table 4 The ratio of patterns of genomic DNA methylation of different dormancy period of blueberry
种类
条带类型
差异条带数 各类型差异条带总数 比例/%
内休眠 解除休眠
A1 II I 131 248 40.52
A2 III I 44
A3 IV II 28
A4 IV III 40
A5 IV I 5
B1 I II 36 185 30.23
B2 I III 40
B3 II IV 62
B4 III IV 7
B5 I IV 40
C1 III II 29 84 13.73
C2 II III 55
D1 I I 66 95 15.52
D2 II II 22
D3 III III 7

表3 蓝莓不同休眠状态基因组DNA甲基化模式种类
Table 3 The variety of genomic DNA methylation patterns of different dormancy period of blueberry
甲基化模式
休眠状态 A型 B型 C型 D型
A1 A2 A3 A4 A5 B1 B2 B3 B4 B5 C1 C2 D1 D2 D3
内休眠 M 0 1 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1
H 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 1 1 1 0
解除休眠 M 1 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 1
H 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1 0
　　H和M分别代表HpaII/EcoRI和MspI/EcoRI酶切; 1: 有带, 0: 无带。
讨　　论
抗冻性发展和芽休眠是木本植物越冬的重要
生理过程, 涉及到一系列复杂的生理生化反应和
信号转导过程。脯氨酸作为细胞渗透压的重要调
李波等: 蓝莓花芽休眠与解除过程中生理生化变化及DNA甲基化差异分析 1139
节物质, 其含量的增长是植物自身对抗逆境的一
种手段。脯氨酸含量在蓝莓休眠进程中呈现有规
律的变化, 在进入内休眠期呈下降趋势, 在内休眠
后期开始急剧上升 , 一直持续到内休眠解除之
后。碳水化合物是休眠期间生命活动的主要能量
来源, 蔗糖和葡萄糖等可溶性碳水化合物不但可
以提高低温下的渗透调节作用, 增强植株抵御低
温的能力 , 又在植物的信号转导中起着重要作
用。高东升等(1999)研究发现, 低温条件下淀粉的
降解和可溶性糖的增加标志着内休眠的结束。杨
秀苹(2004)认为, 戊糖磷酸途径的增加可能是内休
眠解除的重要原因。王海波等(2009)发现桃芽中
淀粉和可溶性糖含量变化趋势与其内休眠进程密
切相关。与这些研究结果相似, 本研究中, 在诱导
休眠期, 蓝莓花芽可溶性糖含量下降, 并在进入内
休眠时降至最低, 随后, 在整个内休眠期及解除休
眠期, 可溶性糖含量持续上升。蛋白质可以参与
多种生命活动, 田莉莉等(2006)认为蛋白质水解后
产生的游离氨基酸分别以不同的途径进入呼吸代
谢, 休眠解除过程中可溶性蛋白含量增加可能与
休眠解除后呼吸代谢途径的改变有关。贺润平等
(2006)认为内休眠可能使蛋白质的合成受阻或者
影响了RNA的翻译, 当自然休眠接近解除时, 蛋白
质的合成能力变强。本研究中, 在诱导休眠期, 蓝
莓可溶性蛋白含量上升, 在进入内休眠时升至最
高, 随后, 可溶性蛋白含量持续下降, 在内休眠开
始解除时, 可溶性蛋白含量再次上升。可见, 蓝莓
花芽内脯氨酸、可溶性糖及可溶性蛋白含量随休
眠进程呈现有规律的变化, 推测, 蓝莓响应外界温
度及光周期的变化后, 调节代谢, 通过增加渗透调
节物质含量、改变信号分子种类及含量或改变呼
吸作用途径等方式, 发展其抗冻性, 并诱导芽体进
入休眠状态或适时解除休眠, 以适应外界环境变
化。渗透调节物质、可溶性糖及可溶性蛋白参与
了蓝莓芽休眠的诱导、维持及解除。
许多研究表明H2O2含量和抗氧化酶活性变化
与休眠的解除紧密相关(高东升等2002; 韩浩章等
2007; 张昂等2012; 谭钺等2015)。Pérez等(2008)发
现H2O2能促进葡萄芽休眠的解除。自然低温、氰
胺和硫脲等破眠剂在打破休眠的过程中都能降低
芽内过氧化氢酶(CAT)活性或诱导H2O2增加(Nir等
1986; Or等2000)。对马铃薯块茎的研究表明, 外施
H2O2、抑制CAT活性或降低CAT基因表达都具有
破眠作用(Bajji等2007)。SOD、POD是抗氧化酶
系统中的主要成员, 在活性氧代谢及平衡中起到
非常重要的作用。SOD可催化生物体内超氧阴离
子自由基通过歧化反应生成H2O2和H2O, POD可将
H2O2催化还原为水。在蓝莓花芽内休眠及解除进
程中, SOD活性与POD活性变化趋势正好相反,
SOD在休眠诱导期及内休眠期一直呈下降趋势,
而在内休眠解除后急剧上升; POD活性在内休眠
期间一直呈上升趋势, 内休眠解除后下降。表明
低的SOD活性、高的POD活性有利于解除蓝莓花
芽休眠 , 促使花芽萌发。推测蓝莓通过调节
SOD、POD等抗氧化酶的活性, 改变H2O2的含量
来调节休眠进程, H2O2参与调控蓝莓花芽休眠的
维持及解除。
DNA甲基化在植物的生长发育过程中起着重
要的调控作用。通常情况下, 基因的甲基化会抑
制其表达, 而去甲基化会导致其转录水平的增加,
从而促进表达(Kovarik等1997)。在同一组织的不
同发育阶段, 基因组DNA的甲基化水平和模式存
在差异。盖树鹏等(2012)研究表明, 伴随着低温积
量累的增加, 牡丹基因组总甲基化水平和全甲基
化水平呈现下降的趋势, 牡丹可能通过甲基化和
去甲基化的方式调控基因的表达, 并最终决定芽
的休眠状态。本研究中蓝莓内休眠花芽甲基化水
平显著高于解除休眠花芽, 内休眠花芽与解除休
眠花芽之间甲基化模式存在广泛的变异。内休眠
花芽的高甲基化及内休眠花芽与解除休眠花芽间
甲基化修饰模式的高度变异, 体现出蓝莓的休眠
特性与表观遗传修饰具有紧密的关联性。对比内
休眠花芽和解除休眠花芽DNA的甲基化状况, 发
现解除休眠花芽中约有84.48%的位点发生了甲基
化模式的变化, 发生去甲基化的比率大于发生甲
基化的比率, 导致其基因组甲基化水平的显著降
低。推测可能是基因组去甲基化导致了蓝莓芽休
眠的解除及花芽的萌发。表观遗传调控的改变必
然会导致生物体生理生化过程的改变, 休眠花芽
的甲基化水平及模式的改变与其芽体中可溶性
糖、可溶性蛋白含量及SOD、POD活性的改变可
能具有一定的相关性。但代谢过程或抗氧化防御
植物生理学报1140
过程中具体哪一个基因发生了甲基化修饰的改变
还需要进一步的研究。另外, 本试验也只对蓝莓
内休眠解除过程中基因组DNA甲基化的水平及模
式变化进行了研究, DNA甲基化修饰的差异具体
会影响哪些基因的表达, 这些基因的表达对于内
休眠的诱导、维持及解除起到什么样的作用, 仍
需进一步研究与探讨。
MSAP方法是目前较为成熟且应用广泛的
DNA甲基化分析方法(Zhang等2009; Portis等2004;
韩柏明等2010; Tan 2010; Lewis和zhan 2007; 姚培
娟等2013), 可在全基因组水平有效检测样品DNA
的甲基化位点。但MSAP只能有效检测位于50~
1 500 bp内的片段, 分子量过大或过小都无法显示;
而且, 四碱基的HpaII和MspI同裂酶只能检测基因
组中CCGG序列的甲基化情况, 而对于非CCGG位
点的胞嘧啶甲基化位点都不敏感, 而且同裂酶的
分辨能力有限, 也不能完全检测出CCGG位点甲基
化, 这可能也是本研究中检测到的甲基化水平不
高的缘故。
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