全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (3): 286~292286
收稿 2010-11-06　　修定 2011-02-09
资助 辽宁省科技攻关项目(2010215003)和国家现代农业产业体
系建设项目(Nycytx-35-gw23)。
* 通讯作者(E-mail: hyqiaaa@126.com; Tel: 024-88487166)。
AgNO3对网纹甜瓜试管苗糖代谢及抗氧化酶活性的影响
刘雪超, 齐红岩*, 陈岩, 华利静
沈阳农业大学园艺学院, 辽宁省设施园艺重点实验室, 设施园艺省部共建教育部重点实验室, 沈阳110866
摘要: 在网纹甜瓜继代培养过程中加入不同浓度的AgNO3, 测定试管苗糖代谢及抗氧化酶活性等。结果表明, 玻璃苗果
糖、葡萄糖和可溶性糖含量显著降低, 而蔗糖含量显著高于正常苗; 抗氧化系统发生紊乱, O2.-产生速率降低, H2O2含量下
降, MDA含量增加, 木质素含量降低。加入30 μmol·L-1 AgNO3使玻璃苗蔗糖合成酶、蔗糖转化酶活性和木质素含量与正常
苗差异不显著。说明适当浓度AgNO3有利于维持试管苗糖代谢正常进行, 降低试管苗脂质过氧化程度, 从而降低或抑制玻
璃化现象的发生。
关键词: 甜瓜; 试管苗; AgNO3; 糖代谢; 抗氧化酶; 木质素
Effects of AgNO3 on Sugar-Metabolizing and Antioxidant Enzyme Activities of
Netted Melon (Cucumis melo L.) in vitro
LIU Xue-Chao, QI Hong-Yan*, CHEN Yan, HUA Li-Jing
Key Laboratory of Protected Horticulture, Ministry of Education, Key Laboratory of Protected Horticulture of Liaoning Province,
College of Horticulture, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China
Abstract: Different concentrations of AgNO3 were added to the media in the process of subculture of netted
melon (Cucumis melo) ‘Zhongmi 1’, and sugar metabolism and antioxidant enzymes activities of plantlet were
determined. The results showed that the contents of fructose, glucose and soluble sugar of vitrified plantlet de-
creased significantly, and the sucose content was significantly higer than that in the normal. The activities of an-
tioxidant enzymes disordered in the vitrified plantlets, the introduction rate of O2
.- and H2O2 content were lower
and MDA content was higher than those in the normal; and the lignin content also decreased. There were no
significant differences of the ligin content and activities of sucrose synthase and invertase between vitrified and
normal plantlets with treatment of 30 μmol·L-1 AgNO3. This illustrated that proper concentration of AgNO3 was
propitious to maintain sugar metabolism, slow down lipid peroxidation, and resulted in reduction or inhibition
of the vitrification.
Key words: netted melon (Cucumis melo); plantlet; silver nitrate; sugar metabolism; antioxidant enzyme;
lignin
玻璃化现象是植物组织培养中特有的现象,
玻璃化苗分化能力低下, 难以增殖, 也难以生根成
苗。在草本和木本植物中, 已报道出现玻璃化苗
的植物达80多种(谢芝馨等2004), 如草莓(曹善东
2006)、番木瓜(饶雪琴和张曙光2005)、甜瓜(齐红
岩等2010)等。与正常苗相比, 玻璃苗会发生一系
列生理生化变化, 从而导致新陈代谢紊乱(蔡祖国
等2005)。Balen等(2009)研究认为玻璃化现象与活
性氧代谢密切相关, 玻璃化和脂质过氧化伴随发
生。陈岩等(2010)研究发现甜瓜组培中出现的玻
璃苗糖代谢异常, 其果糖和葡萄糖含量显著降低,
而蔗糖含量显著上升。为了防止试管苗玻璃化的
发生, 人们采取了各种措施如改善试管苗培养的
光照和温度(郑小华等2008)、提高培养基中蔗糖
浓度(Langford和Wainwright 1998)以及改变培养基
中激素浓度等(张红和王万新2008), 其中, 向培养
基中加入一定量的AgNO3是有效抑制玻璃化发生
的措施之一。周音等(2000)研究表明, 在生菜培养
基中加入1~4 mg·L-1的AgNO3明显减少了玻璃化现
象的发生; 齐红岩等(2009a, b)通过研究AgNO3对
网纹甜瓜试管苗再生及玻璃苗的影响也表明, 在
培养基中添加不同浓度的AgNO3均显著抑制了玻
刘雪超等: AgNO3对网纹甜瓜试管苗糖代谢及抗氧化酶活性的影响 287
璃苗的产生。然而, 有关AgNO3抑制试管苗玻璃化
发生的机理尚不明确。因此, 本试验在前期研究的
基础上, 在网纹甜瓜继代培养基中添加不同浓度
的AgNO3, 测定正常试管苗和玻璃苗糖代谢及抗氧
化酶的活性, 以期为阐明AgNO3抑制网纹甜瓜试管
苗玻璃化发生的机理提供依据。
材料与方法
试验于2009年9月在本校园艺科研基地组培
实验室进行, 以网纹甜瓜(Cucumis melo L.) ‘中蜜1
号’种子为外植体, 用70%酒精浸泡30 s, 无菌水冲
洗3次; 放入0.1%升汞中消毒10 min, 无菌水冲洗5
次; 去壳, 接种于MS培养基上(30 g·L-1蔗糖、5 g·L-1
琼脂, pH 5.8), 于(24±2) ℃、30~40 μmol·m-2·s-1光
照强度、14 h·d-1光照下诱导发芽。取7 d左右的无
菌苗子叶, 接种于芽诱导培养基(MS+2.0 mg·L-1
BA+0.2 mg·L-1 IAA)上。然后将诱导出的不定芽接
种在含0、30、50和70 μmol·L-1 AgNO3 的继代(增
殖)培养基(MS+0.4 mg·L-1 BA+0.05 mg·L-1 IBA)上
培养, 每隔30 d继代1次, 第1次继代完成时统计玻
璃化率和增殖率, 第3次继代完成时分别取正常苗
和玻璃苗的所有叶片进行生理指标的测定。试管
苗的继代培养次数和时间会影响植物的遗传稳定
性。一般随继代次数和时间的增加, 变异频率不
断提高, 且分化能力有所下降。
糖含量的测定依据Qi等(2003)的方法; 糖代谢
相关酶活性的测定参照郝敬虹等(2009)的方法; 过
氧化物酶(peroxidase, POD)活性采用愈创木酚法测
定(Quintanilla-Guerrero等2008); 超氧化物岐化酶
(superoxide dismutase, SOD)活性采用氮蓝四唑
(NBT)法测定; 过氧化氢酶(catalase, CAT)活性采用
紫外吸收法测定; 丙二醛(MDA)含量的测定参照赵
世杰等(1994)的方法; 苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine
ammonialyase, PAL)活性采用苯丙氨酸脱氨显色法
测定; 木质素含量测定参照林葵(1996)等的方法。
用DPS数据处理软件进行数据统计分析, 用
Origin 7.5软件进行绘图。
实验结果
1 AgNO3对网纹甜瓜试管苗玻璃化的影响
在网纹甜瓜试管苗增殖阶段添加AgNO3可
以显著降低玻璃苗的发生率, 不加AgNO3的玻璃苗
发生率为25.93%, 30 μmol·L-1 AgNO3处理后为
3.7%, 而50和70 μmol·L-1 AgNO3处理则完全抑制了
玻璃化的出现(图1)。
玻璃化试管苗为半透明、水浸状、浅绿色,
说明玻璃苗超度含水且叶绿素含量低于正常苗(图
2)。30 μmol·L-1 AgNO3处理的玻璃苗较对照组玻
璃苗外观没有明显改变(图2-b、d); 当AgNO3浓度
为50 μmol·L-1时, 试管苗生长最健壮; 而浓度增加
到70 μmol·L-1时, 试管苗全部生长畸形, 说明高浓
度的AgNO3会对网纹甜瓜试管苗产生毒害(图2)。
2 AgNO3对网纹甜瓜试管苗蔗糖代谢的影响
由图3可知, 对照组玻璃苗的果糖、葡萄糖和总
可溶性糖含量显著低于正常苗, 而蔗糖含量显著高
于正常苗 , 说明玻璃苗糖代谢出现异常。3 0
μmol·L-1 AgNO3处理后, 玻璃苗中葡萄糖和总可溶
性糖含量仍然显著低于正常苗; 而果糖和蔗糖含
量分别低于和高于正常苗, 但是差异都不显著。
随AgNO3浓度的增大, 正常苗果糖、葡萄糖及可溶
性糖含量逐渐降低; 而蔗糖含量先升高后降低, 当
AgNO3浓度为50 μmol·L-1时, 蔗糖含量显著高于其
它处理。
不作处理玻璃苗的酸性转化酶(acid invertase,
AI)和中性转化酶(neutral invertase, NI)活性显著低
于正常苗, 而30 μmol·L-1 AgNO3处理后, 玻璃苗的
AI和NI活性与正常苗差异减小且不显著。当
AgNO3浓度为50 μmol·L-1时, 正常苗AI和NI的活性
比30 μmol·L-1 AgNO3处理的高, 与对照组的差异不
图1 不同浓度AgNO3对网纹甜瓜试管苗玻璃化的影响
Fig.1 Effects of different AgNO3 concentrations on
vitrification of netted melon plantlet
不同小写字母表示同一处理时间下不同处理间差异显著
(P<0.05)。下图同此。
植物生理学报288
图2 不同浓度AgNO3对网纹甜瓜试管苗生长的影响
Fig.2 Effects of different AgNO3 concentrations on growth of netted melon plantlet
a: AgNO3为0的正常苗; b: AgNO3为0的玻璃苗; c: AgNO3为30 μmol·L
-1的正常苗; d: AgNO3为30 μmol·L
-1的玻璃苗; e: AgNO3为50
μmol·L-1的正常苗; f: AgNO3为70 μmol·L
-1的畸形苗。
图3 不同浓度AgNO3对网纹甜瓜试管苗糖含量的影响
Fig.3 Effects of different AgNO3 concentrations on carbohydrate contents of netted melon plantlet
刘雪超等: AgNO3对网纹甜瓜试管苗糖代谢及抗氧化酶活性的影响 289
显著;而AgNO3为70 μmol·L-1时两种转化酶活性又
显著降低(图4-a、b)。
对照组玻璃苗的蔗糖合成酶(sucrose synthase,
SS)在合成活性显著高于正常苗, 而在分解活性显
著低于正常苗, 说明玻璃苗蔗糖的分解代谢出现
异常, 从而造成蔗糖的积累。而30 μmol·L-1 AgNO3
处理后, 玻璃苗与正常苗在SS合成和分解活性差
异均不显著。随着AgNO3浓度的提高, SS合成活
性升高, 50和70 μmol·L-1 AgNO3处理的差异不显著;
而分解活性显著被抑制, 两处理间差异显著。由
此可知, AgNO3处理对SS分解活性影响较大(图
4-c、d)。
图4 不同浓度AgNO3对网纹甜瓜试管苗糖代谢相关酶活性的影响
Fig.4 Effects of different AgNO3 concentrations on activities of sugar-metabolizing enzymes of netted melon plantlet
3 AgNO3对网纹甜瓜试管苗抗氧化系统的影响
由图5-a可以看出, 对照组玻璃苗SOD活性显
著低于正常苗; 30 μmol·L-1 AgNO3处理后, 正常苗
与玻璃苗的SOD活性均显著降低, 但两者之间差异
不显著; 当AgNO3浓度为50 μmol·L-1 (试管苗生长最健
壮)时, SOD活性显著低于其它处理; 而70 μmol·L-1
AgNO3处理的SOD活性又开始升高。
对照组玻璃苗POD活性显著高于正常苗的
(图5-b), 30 μmol·L-1 AgNO3处理后正常苗和玻璃苗
两者的POD活性均显著降低, 但玻璃苗的POD活
性依然显著高于正常苗。50 μmol·L-1 AgNO3处理
的POD活性有所升高, 而70 μmol·L-1 AgNO3处理则
使POD活性显著低于其它处理。
玻璃苗的CAT活性均显著高于正常苗, AgNO3
处理的玻璃苗CAT活性显著升高; 正常苗中CAT活性
呈先上升后下降的趋势, 但都显著高于对照(图5-c)。
由图5-d可以看出, 玻璃苗MDA含量均显著高
于正常苗的, 表明玻璃苗的脂质过氧化程度较严
重。AgNO3处理显著降低玻璃苗MDA含量。随
AgNO3浓度增大, 正常苗的MDA含量逐渐增加, 但
都低于对照的。
对照组中玻璃苗超氧阴离子(O2·﹣)产生速率显
著低于正常苗; 而30 μmol·L-1 AgNO3处理后与两者
差异不显著, 但是均显著低于对照组的。随AgNO3
浓度增大, 正常苗中O2·﹣产生速率先降低后显著升
高, 但均显著低于对照组正常苗(图6-a)。
对照和30 μmol·L-1 AgNO3处理玻璃苗的过氧
化氢(H2O2)含量均显著低于同处理条件下的正常
苗。AgNO3处理使正常试管苗的H2O2含量有所降
低, 其中50 μmol·L-1 AgNO3处理的显著低于对照,
而30和70 μmol·L-1 AgNO3处理的与对照差异不显
著(图6-b)。
植物生理学报290
图6 不同浓度AgNO3对网纹甜瓜试管苗O2·﹣产生速率及H2O2含量的影响
Fig.6 Effects of different AgNO3 concentrations on O2·﹣ production rate and H2O2 concentration of netted melon plantlet
4 AgNO3对网纹甜瓜试管苗木质素合成的影响
由图7-a可以看出, 对照组玻璃苗PAL活性显
著低于正常苗。30 μmol·L-1 AgNO3处理后, 玻璃苗
和正常苗PAL活性显著低于对照, 但两者之间差异
不显著; 50 μmol·L-1 AgNO3处理的PAL活性显著高
于30 μmol·L-1 AgNO3处理, 但与70 μmol·L-1 AgNO3
处理差异不显著。
而对照组玻璃苗的木质素含量显著低于正常
苗, 仅为正常苗的50.9%; 30 μmol·L-1 AgNO3处理的
玻璃苗与正常苗木质素含量差异不显著, 为正常
苗的83.5% (图7-b)。但是, AgNO3处理显著降低了
正常苗木质素的含量。
图5 不同浓度AgNO3对网纹甜瓜试管苗抗氧化酶活性及MDA含量的影响
Fig.5 Effects of different AgNO3 concentrations on antioxidant enzyme activities and MDA content of netted melon plantlet
讨　　论
实验结果表明, 玻璃苗不仅在外观表现上发
生了较大的改变, 其内在生理代谢同样发生了很
大的改变。AgNO3处理降低并抑制了玻璃化的发
生, 这与周音等(2000)在生菜上的研究结果一致,
可能是AgNO3抑制了培养过程中ACC向乙烯的转
化, 从而抑制了玻璃苗的产生。但Ag+浓度过高会
对试管苗产生毒害现象, 导致试管苗畸形, 不利于
其生长。
目前关于玻璃苗糖代谢方面的研究不多, 结
论也不一致。孙庆春等(2009)对菊花的研究表明
玻璃苗的蔗糖含量明显低于正常苗, 而本研究表
刘雪超等: AgNO3对网纹甜瓜试管苗糖代谢及抗氧化酶活性的影响 291
明玻璃苗蔗糖含量显著高于正常苗, 葡萄糖、果
糖及可溶性糖含量显著低于正常苗, 说明玻璃苗
的蔗糖代谢出现异常, 与陈岩(2010)的研究结果一
致。这可能是植物种类不同造成的, 因为不同植
物吸收、利用糖的途径有所差异, 也可能是取材
时期不一致造成的。进一步对糖代谢相关酶的分
析发现, 与正常苗相比玻璃苗的SS在合成方向的
活性显著升高, 在分解方向的活性显著降低, 两种
转化酶活性也显著降低。说明玻璃苗的蔗糖合成
能力增强, 分解能力降低, 因此导致了蔗糖的积
累。但鉴于玻璃苗组织结构的改变, 我们不能排
除培养基中的蔗糖进入试管苗, 而引起蔗糖浓度
的升高。杨俊英等(1998)也研究认为, 蔗糖含量的
增加有可能是其它多糖降解所致, 或者由于玻璃
苗的细胞壁破裂, 组织空洞, 而使培养基中的蔗糖
进入细胞所致。AgNO3处理使试管苗蔗糖含量显
著增加, 而蔗糖作为植物体中有机物运输的主要
形式, 不仅为植物生长发育提供碳架和能量, 同时
能够有效调节植物的渗透压，从而有效抑制了试
管苗玻璃化的发生。
SOD、POD和CAT作为植物代谢过程中清除
活性氧的主要酶类, 可以有效避免细胞受到损伤
(Tian等2003)。本研究表明玻璃苗的SOD、PAL活
性、O2·﹣产生速率及H2O2含量显著低于正常苗, 而
POD、CAT活性和MDA含量则显著高于正常苗,
这种保护酶活性调节不同步的现象说明玻璃苗抗
氧化系统发生紊乱 , 并发生了严重的脂质过氧
化。杨俊英等(2005)研究认为, 大蒜试管苗玻璃苗
POD活性显著高于正常苗, 且电泳图谱表明玻璃
苗的谱带较正常苗深且多, 因此认为试管苗内源
图7 不同浓度AgNO3对网纹甜瓜试管苗木质素合成的影响
Fig.7 Effects of different AgNO3 concentrations on lignin biosynthesis of netted melon plantlet
IAA水平下降而细胞分裂素水平上升, 从而导致玻
璃化的出现。杨芸等(2008)也研究表明大蒜玻璃
苗CAT和POD活性均显著高于正常苗, 但谢芝馨等
(2004)则研究发现大葱玻璃苗CAT活性比正常苗
偏低, 这可能是因为材料不同造成的。活性氧自
由基的积累可以导致膜脂上不饱和脂肪酸的过氧
化增强, 从而产生MDA等过氧化产物。而玻璃苗
中活性氧的含量较正常苗低, MDA含量则显著高
于正常苗, 所以我们认为活性氧对试管苗玻璃化
的发生可能具有一定作用, 但是在玻璃苗的继代
培养过程中, 活性氧代谢降低。AgNO3处理使正常
苗SOD和POD活性、O2·﹣产生速率、MDA含量降
低, 同时CAT活性显著上升, H2O2含量下降, 说明试
管苗受到的活性氧胁迫得到了一定程度的缓解,
从而降低了脂质过氧化的发生。其中, 70 μmol·L-1
AgNO3处理的POD和CAT活性显著下降, 试管苗
SOD活性及MDA含量显著上升, O2·﹣产生速率及
H 2O 2含量也略有上升。因此 , 我们认为30~50
μmol·L-1 AgNO3有效缓解了试管苗所受到的活性
氧胁迫 , 使细胞脂质过氧化程度降低 ; 而 7 0
μmol·L-1的AgNO3虽然也缓解了试管苗受到的活性
氧胁迫, 但由于浓度过高而导致了Ag+毒害的发生,
使试管苗生长畸形。
同时, POD也是木质素合成过程的关键酶, 和
PAL共同调节木质素合成。玻璃苗虽然POD活性
显著升高, 但PAL活性显著降低, 导致玻璃苗木质
素含量降低, 使构成细胞壁的物质缺乏, 这与张洪
胜等(1991)的研究结果一致。30~70 μmol·L-1 AgNO3
处理虽然显著降低了玻璃苗发生率, 但同时也抑
制了POD和PAL的活性, 从而显著降低了试管苗的
植物生理学报292
木质素含量。因此, 我们认为试管苗的木质素含
量高低并不是导致玻璃化发生的原因, 相反, 由于
试管苗发生玻璃化而导致PAL活性降低, 从而导致
木质素合成降低或者分解加速。
综上所述, 我们认为适当浓度30~50 μmol·L-1
AgNO3有效地调节了试管苗的渗透压, 为试管苗的
正常生长提供了充足的碳源和能量, 有效降低了
试管苗的脂质过氧化程度, 从而降低或抑制玻璃
化的发生。但有关AgNO3对试管苗其它方面生理
代谢的影响还有待进一步研究。
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