全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (8): 1079~1088　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0127 1079
收稿 2014-03-25　　修定 2014-05-16
资助 国家自然科学基金(31371407)、浙江省钱江人才计划
(2013R10074)和浙江省自然科学基金(LY12C14001)。
* 同等贡献。
** 通讯作者(E-mail: jzliu@zjnu.cn; Tel: 0579-82288053)。
蛋白质亚硝基化检测和鉴定方法的研究进展
汪达丽*, 张双双*, 刘建中**
浙江师范大学化学与生命科学学院, 浙江金华321004
摘要: 蛋白的亚硝基化是近期发现的一种类似于磷酸化、可逆的、不依赖于环磷酸鸟苷(cGMP)的一氧化氮修饰和调节蛋
白功能的新途径。一经发现, 有关亚硝基化的研究呈指数级递增。亚硝基化参与从生长发育到抗病、抗逆等多个生理和
病理过程。已有大量综述对亚硝基化调控蛋白功能从而影响某一生理生化及病理过程进行了总结。但迄今为止, 对检测
蛋白亚硝基化的手段和鉴定亚硝基化位点的方法进行总结的文献综述仍屈指可数。据此, 我们对蛋白亚硝基化检测手段
的发明、改进提高、亚硝基化位点的结构特点以及亚硝基化位点预测软件的开发等进行综述, 旨在为该领域内科研工作
者提供方便。
关键词: 亚硝基化; 一氧化氮; 生物素置换法; 翻译后修饰; LC-MS/MS
Advances in Methodologies for Detection and Identification of the S-nitrosylat-
ed Proteins
WANG Da-Li*, ZHANG Shuang-Shuang*, LIU Jian-Zhong**
College of Chemistry and Life Science, Zhejiang Normal University, Jinhua, Zhejiang 321004, China
Abstract: Similar to phosphorylation, S-nitrosylation is a newly identified protein modification in which nitric
oxide (NO) moiety covalently attached to thiol group. S-nitrosylation is a reversible process and it can result in
the alteration of protein functions in guanosine 3′, 5′-cyclic phosphate (cGMP) independent manner. It has been
shown that S-nitrosylation plays important regulatory roles in various physiological and pathological processes
from growth and development to biotic and abiotic stress responses. The research publications in this field have
grown exponentially since its discovery. Up to date, numerous review articles have been published on how S-ni-
trosylation exerts its influences on protein functions. However, review articles that summarize the detection of
S-nitrosylated proteins and the identification of the sites of this modification are rare. Thus, we reviewed the de-
velopment, evolution and current status of the methodologies for protein S-nitrosylation studies.
Key words: S-nitrosolation; nitric oxide (NO); biotin switch assay (BSA); post-translational modification; LC-
MS/MS
一氧化氮(nitric oxide, NO)是一个小型气体信
号分子, 极易通过扩散作用进行跨膜运输。NO因
具有自由基的特性, 决定了它可以与细胞内不同
的生物靶标以依赖于浓度和氧化还原状态的方式
进行广泛的互作, 从而影响众多生物学过程。在
植物中, NO影响开花时间(He等2004)、种子萌发
(Wendehenne等2001)、光形态学建成(Wendehenne
等2001)、气孔的关闭(Neill等2002; Guo等2003)、
果实成熟和叶片衰老(Wendehenne等2001; Guo和
Crawford 2005)等生长发育过程。它同时在非生物
协迫(肖强和郑海雷2004; Xuan等2010; Fan和Liu
2012; He等2012)和防御反应(Delledonne等1998;
Durner等1998; Wendehenne等2001)中也发挥着至
关重要的作用, 例如在激活防御基因、调控程序
性细胞死亡中都起着关键作用。
亚硝基化(S-nitrosylation)是近年来新发现的
一种不依赖于环磷酸鸟苷(guanosine 3′, 5′-cyclic
phosphate, cGMP)的NO信号传导途径, 即NO可逆
地共价结合到蛋白质半胱氨酸巯基(Cys-SH)上形
成亚硝基硫醇(RCys-SNO)的过程。蛋白质的亚硝
基化可以改变蛋白质的功能, 包括增强或抑制蛋
白酶的活性、改变蛋白质在细胞内的转运和亚细
胞定位等(Stamler 1997)。亚硝基化是继磷酸化
植物生理学报1080
(phosphorylation)、泛素化(ubiquitination)和乙酰化
(acetylization)等之后又一种新的蛋白质翻译后修
饰方式。自Stamler (1994)首次发现蛋白质的亚硝
基化途径后, 有关亚硝基化的研究成指数级增加,
证明其在不同的生理和病理过程中发挥着广泛的
作用(Hess和Stamler 2012)。
亚硝基化可由四种不同的发生方式: 氧化途
径、自由基介导的途径、金属催化途径以及转亚
硝基化途径(trans-nitrosylation) (Kovacs和Linderm-
yar 2013)。细胞内绝大多数的蛋白质亚硝基化是
以转亚硝基化的方式进行的(Dahm等2006)。在转
亚硝基化途径中, NO首先与小分子物质上的半胱
氨酸结合生成亚硝基硫醇, 其中NO与Cys直接结
合生成的亚硝基谷胱甘肽(S-nitrosoglutathione,
GSNO)是细胞内主要的NO供体。GSNO作为NO
在细胞内的临时储蓄库, 可以将NO反式转移到蛋
白质半胱氨酸巯基(Cys-SH)上, 即发生转亚硝基化
作用(trans-nitrosylation) (Foissner等2000; Moreau
等2010; Fröhlich和Durner 2011)。因此, 细胞内
GSNO的浓度可以间接反映蛋白质亚硝基化的程
度(Liu等2004; Feechan等2005; Dahm等2006)。亚
硝基化是一个由细胞内NO或GSNO浓度和氧化还
原状态共同决定的可逆过程(Liu等2004; Feechan
等2005; Tada等2008)。亚硝基化的蛋白在细胞内
GSNO浓度降低或还原性增强的情况下可发生去
亚硝基化作用(de-nitrosylation)。去亚硝基化有酶
促反应和非酶促反应两个途径。亚硝基谷胱甘肽
还原酶(S-nitrosoglutathione, GSNOR1) (Liu等2004;
Feechan等2005)和硫氧还原蛋白(thioredoxin, TRX)
(Stoyanovsky等2005; Sengupta等2007; Benhar等
2008; Tada等2008)是去亚硝基化的两个关键酶。
NO是通过亚硝基化某一生理过程中起关键作用的
蛋白来发挥作用。因此, 鉴定出亚硝基化的靶蛋
白及其靶位点对揭示NO调控某一生理过程的机理
具有重要意义; 同时, 对创制不能被亚硝基化修饰
和调控的突变体蛋白进而通过基因工程手段改良
某一性状和进行基因治疗等方面也具有重要意
义。因此, 鉴定亚硝基化靶蛋白和靶位点的方法
对促进该领域的研究起着关键作用。
Jaffrey等(2001)首次开创性的应用生物素置
换法(biotin switch assay, BSA)鉴定亚硝基化的靶
蛋白 , 为亚硝基化靶蛋白的鉴定奠定了坚实基
础。以此方法为基础, 又相继衍生出多种鉴定亚
硝基化靶蛋白的方法。特别是随着蛋白质组学的
高速发展, 将BSA结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/
MS)技术实现了高通量鉴定亚硝基化靶蛋白及靶
位点的目标(Hess和Stamler 2012); 近期, 应用同位
素代码亲和标签(isotope-coded affinity tag, ICAT)
技术可同时完成亚硝基化靶蛋白、靶位点的鉴定
和比较不同样品中同一蛋白亚硝基化程度的任务
(Wu等2010; Kovacs和Lindermyar 2013; Fares等
2014)。根据已鉴定出的靶蛋白和靶位点, 总结出
了亚硝基化靶位点附近可能的氨基酸组成及结构
特点, 并由此开发出预测亚硝基化靶位点的程序
和软件。现将鉴定亚硝基化方法的演变过程、具
体原理和步骤总结如下, 旨在为从事该领域的科
研工作者提供方便。
1 生物素置换法
Jaffrey等(2001)发明了BSA检测亚硝基化靶
蛋白(图1)。该方法的创新点是将亚硝基化的半胱
氨酸残基替换成生物素化的半胱氨酸残基, 然后
用生物素抗体进行Western blots, 检测生物素化的
蛋白。其具体步骤如下: (1)使用巯基特异性试剂
MMTS (methyl methanethiosulfonate)将自由的巯基
(-SH)封闭, MMTS只能专一性地封闭蛋白中自由
的巯基(-SH), 使之甲基硫醇化, 但并不能封闭被亚
硝基化的巯基(-SNO), 也不能封闭二硫键(-S-S-);
(2)巯基封闭后, 用抗坏血酸盐将被亚硝基化的巯
基(-SNO)还原成自由的巯基(-SH), 而最初自由的
巯基(-SH)由于被MMTS封闭后形成甲基硫醇而不
能被还原; (3)用巯基专一性的生物素标记试剂bio-
tin-HPDP (N-[6-(biotinamido)hexyl]-3′-(2′-pyr-
idyldithio)propionamide)中的HPDP与新形成的自
由巯基(-SH)反应, 使其生物素化, 这样先前亚硝基
化的巯基(-SNO)就被生物素化了。值得注意的是,
用biotin-HPDP进行的生物素化反应是可逆的。由
于MMTS能够与biotin-HPDP相互竞争巯基, 所以
在使用抗坏血酸盐之前需要用过柱离心或用丙酮
沉淀法彻底除去MMTS; (4)生物素化以后, 用专一
性结合生物素的亲和树脂链霉亲和素 -琼脂糖
(streptavidin agrose)或抗生素蛋白-琼脂糖(avidin
agrose)对生物素化蛋白进行富集和纯化; (5)用生
汪达丽等: 蛋白质亚硝基化检测和鉴定方法的研究进展 1081
物素抗体对生物素化的蛋白进行Western blots检
测。该方法可以在蛋白未经亲和素纯化前做West-
ern blots检测, 也可以在纯化后做Western blots检
测。经亲和素纯化后, 能富集亚硝基化的蛋白, 这
样可以避免由于杂带的出现而导致背景过高。前
者适用于体外表达靶蛋白的检测, 而后者则适用
于鉴定某一特定组织或器官总蛋白提取液中靶蛋
白的亚硝基化水平。经富集和纯化后的蛋白, 也
可以用某一蛋白的特异性抗体进行Western blots检
测(Lindermyar等2005)。
在应用BSA时应注意以下几点: (1) MMTS封
闭要彻底, 如果不能有效地对自由巯基(-SH)进行
完全封闭, 会降低检测的灵敏度; (2) BSA第2步使
用还原剂抗坏血酸盐时会产生假阳性结果(Zhang
等2005; Huang和Chen 2006), 在避光的条件下可以
避免假阳性的发生(Forrester等2007)。
由于用biotin-HPDP进行的置换反应是可逆
的, 在还原状态下会发生去生物素化反应, 所以其
检测效率会受到影响。为了改进此方法, 后来用
与巯基发生不可逆反应的马来酰亚胺-生物素(ma-
leimide-biotin) (Huang和Chen 2010)和碘代乙酰基-
生物素(iodoacetyl-biotin)替换biotin-HPDP用于生
物素置换反应, 大大降低了做Western blots时的背
景并提高后续LC-MS/MS的检测效率。Thermal
Scientific公司根据Bomgarden等的方法开发了用于
检测亚硝基化蛋白的Western blots试剂盒(http://
www.piercenet.com/product/s-nitrosylation-western-
blot-kit)。
2 生物素置换法结合液相色谱-串联质谱法分离、
纯化及鉴定被亚硝基化的靶蛋白
以BSA为基础, 结合双向电泳及LC-MS/MS法
进行亚硝基化靶蛋白的鉴定, 是新衍生的一种能
有效鉴定亚硝基化蛋白的方法。该方法的样品处
理简便快速、特异性强和检测灵敏准确, 可满足
同时分离、纯化和鉴定亚硝基化蛋白的要求(图2)
(Jaffrey等2001; Martínez-Ruiz和Lamas 2004; Gao
等2005; Lindermyar等2005)。该方法前4个步骤与
BSA相同, (1)用MMTS将亚硝基化的蛋白进行自
由巯基(-SH)封闭; (2)用抗坏血酸盐将亚硝基化的
巯基(-SNO)还原成自由巯基(-SH); (3)将亚硝基化
的蛋白进行生物素化处理; (4)将生物素化蛋白使
用亲和树脂链霉亲和素-琼脂糖(streptavidin agrose)
或抗生素蛋白-琼脂糖(avidin agrose)进行富集纯
化; (5)将纯化的蛋白进行SDS-PAGE分离, 对凝胶
电泳结果进行银染和图像扫描; (6)将电泳条带进
行切胶, 用胰蛋白酶过夜处理; (7)将酶解所得肽段
经2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol, 2-ME)洗涤,
2-ME能够将肽段二硫键上的生物素还原成巯基;
图1 生物素置换法检测亚硝基化蛋白
Fig.1 Detection of S-nitrosylated proteins by BSA
参考Jaffrey等(2001)文献修改。
植物生理学报1082
(8)再经低温烘干、脱盐处理后进行LC-MS/MS分
析。经液相色谱处理后, 不同的多肽可根据在色谱
柱中保留时间不同而进行分离, 然后使用电喷雾离
子化串联质谱进行检测, 用串联质谱可获得多肽的
质量谱。现在已经有多种方法可以将多肽从头进
行解析, 其中较早的有Taylor和Johnson (1997)提出
的Lutefisk法, 较新的则有Dančík等(1999)提出的
Sherenga法。Taylor和Johnson (1997)用图论(graph
theory)的方法得到可能的多肽序列后, 用与Eng等
(1994)相似的分析对多肽序列进一步打分排序。
对串联质谱多肽序列进行解析的软件有PepMass
(http://onassis7.tripod.com/pepmass.html), 还有蛋白
质数据库搜索软件Protein Explorer (http://www.
umass.edu/microbio/chime/pe_beta/pe/protexpl/), 先
用PepMass对一些蛋白质的多肽串联质谱进行分
析, 再用Protein Explorer进行数据库搜索鉴定蛋白
质, 从而鉴定出亚硝基化蛋白的种类。
3 SNO位点鉴定法直接鉴定亚硝基化蛋白半胱氨
酸靶位点
通过BSA结合LC-MS/MS可以鉴定出亚硝基
化靶蛋白, 但并不能鉴定某一蛋白质氨基酸组成
中哪个(些)半胱氨酸残基被亚硝基化修饰了。为
此, Hao等(2006)开发的SNO位点鉴定法(SNO site
identification, SNOID)可以直接鉴定出某一蛋白中
被亚硝基化的半胱氨酸残基。该方法是BSA结合
LC-MS/MS的进一步提高和改进。其基本步骤与
BSA结合LC-MS/MS相同, 但在生物素化处理后不
是直接纯化, 而是先用胰蛋白酶消化, 然后再纯化
酶解后的肽段, 被纯化肽段中包含Cys的即为亚硝
基化的靶位点。
SNOID的具体步骤如图3所示, 前三个步骤与
BSA基本相同, (1)先用MMTS封闭自由巯基(-SH);
(2)使用抗坏血酸盐将亚硝基化的Cys选择性还原
成含自由巯基的半胱氨酸(Cys-SH); (3)再用bio-
tin-HPDH进行生物素化处理; (4)接下来并不是直
接用亲和树脂链霉亲和素-琼脂糖(streptavidin
agrose)或抗生素蛋白-琼脂糖(avidin agrose)对生物
素化的蛋白进行亲和纯化, 而是将生物素化蛋白
先进行SDS-PAGE分离; (5)将电泳分离得到的条带
进行彻底的胰蛋白酶处理; (6)利用亲和树脂链霉
图2 生物素置换法结合液相-串联质谱法检测和蛋白质组学鉴定亚硝基化蛋白
Fig.2 Detection and proteomic identification of S-nitrosylated proteins by combination of BSA and LC-MS/MS
参考Jaffrey等(2001)、Martínez-Ruiz和Lamas (2004)、Gao等(2005)、Lindermyar等(2005)文献修改。
汪达丽等: 蛋白质亚硝基化检测和鉴定方法的研究进展 1083
亲和素-琼脂糖(streptavidin agrose)或抗生素蛋白-
琼脂糖(avidin agrose)对生物素化多肽片段进行纯
化; (7)将纯化后的多肽片段经还原剂2-ME处理后,
切断二硫键, 脱掉biotin, 最后再根据LC-MS/MS获
得的多肽片段序列信息对蛋白质身份进行鉴定。
Hao等(2006)利用此方法从56种小鼠小脑蛋
白中成功鉴定出68个亚硝基化的Cys靶位点, 其中
包括α-微管蛋白、β-微管蛋白和甘油醛-3-磷酸脱
氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,
GAPDH)等。
后来, Forrester等(2009)对此方法进行了改进:
(1)用SNO亲和树脂硫丙基琼脂糖(thiopropyl sep-
harose)代替硫醇亲和树脂(biotin-HPDP)用以纯化
和分离靶蛋白; (2)直接在树脂上进行蛋白酶处理,
该方法不但简化了实验流程, 而且提高了检测的
灵敏度。为了避免抗坏血酸盐所造成的假阳性结
果, Doulias等(2010)用醋酸苯汞(phenylmercury)替
代biotin-HPDP直接与SNO发生反应, 形成相对稳
定的硫醇-汞键(thiol-mercury bond), 然后用合成的
有机汞树脂(organomercury)进行后续的富集和纯
化步骤。
4 同位素代码亲和标签技术结合生物素置换法同
时鉴定和定量亚硝基化位点
SNOID技术虽然能分别鉴定出亚硝基化的靶
蛋白和靶位点, 但却不能对蛋白亚硝基化的程度
进行精准的相对定量; 而要了解NO在不同生理和
病理条件下的作用, 对亚硝基化程度进行相对定
量是不可或缺的。
随着定量蛋白质组学技术的日益进步 , 在
BSA的基础上, 将其与同位素代码亲和标签技术
(isotope-coded affinity tag, ICAT)结合可同时完成
亚硝基化靶蛋白、靶位点的鉴定和比较不同样品
中同一蛋白亚硝基化程度的任务(Wu等2010; Fares
等2014)。该方法的另一个优点是省去了繁冗的凝
胶电泳步骤, 使分析蛋白亚硝基化的方法在技术
上又得到了进一步的改善和提升, 但该方法的缺
点是要使用同位素。
ICAT是Gygi等(1999)发明的新技术。ICAT化
学试剂由3部分构成: (1)亲和标签, 如生物素或其
他标签 , 用来分离ICAT标记的多肽; (2)连接区
(linker), 用于同位素标记; (3)活性基团, 用以特异
性结合半胱氨酸的巯基(Cys-SH)。目前, 商品化的
图3 SNOID法鉴定亚硝基化蛋白半胱氨酸靶位点
Fig.3 The SNOSID method for identifying protein SNO-Cys modification sites
参考Hao等(2006)文献修改。
植物生理学报1084
ICAT试剂可分为两种, 在连接区带8个氢原子(D0)
的轻试剂和8个氘原子(D8)的重试剂。由8个氢原
子(D0)和8个氘原子(D8)分别标记的ICAT分子量正
好相差8。ICAT最初是用来研究不同样品中蛋白
表达差异的。用轻、重ICAT试剂分别标记不同样
品中相同蛋白的肽段, 其总是一前一后相邻的分布
在质谱图上, 且分子量正好相差8或4 Da (肽段带两
个电荷)。通过LC-MS/MS鉴定出该片段属于何种
蛋白后, 计算、比较二者峰值的差异, 就可知这种
蛋白在2个不同样品中的相对表达情况。BSA结合
ICAT的一般实验步骤是将1个蛋白样品用轻试剂
标记, 另1个蛋白样品用重试剂标记。ICAT的反应
基团会专一性地与蛋白中的Cys共价结合, 待充分
反应后, 将二者等量混合, 用胰蛋白酶酶解, 然后就
可对含生物素化的ICAT酶解多肽片段进行LC-MS/
MS分析。本方法对低丰度蛋白的直接捕获测定以
及可靠性都较以往的检测技术有所提高。
ICAT 基本步骤如图4所示(Wu等2011; Fares等
2014) : (1)首先用100 mmol·L-1 的MMTS将提取的
组织蛋白进行自由巯基(-SH)封闭; (2)用5 mmol·L-1
的抗坏血酸盐和1 mmol·L-1 CuCl 2室温孵化1 h, 目
的是还原亚硝基化的半胱氨酸(Cys-SNO), CuCl2可
以增强还原反应的进行; (3)将实验样品用重试剂
(ICAT-H)标记, 而对照样品用轻试剂(ICAT-L)标记,
在平行实验中常可以采用交换标记试剂的方法来
检测试剂盒中标记试剂是否存在偏差; (4)用胰蛋
白酶按1:50或1:100的比例对以上标记的蛋白进行
消化处理, 将酶解消化后得到的轻、重多肽在同
一支离心管中均匀混合, 使用C18脱盐柱对已经标
记的多肽进行脱盐和清洗, 将洗净的多肽进行生
物素化, 再用亲和树脂链霉亲和素-琼脂糖(strepta-
vidin agrose)或抗生素蛋白-琼脂糖(avidin agrose)
图4 同位素代码亲和标签技术结合生物素置换法同时鉴定和定量亚硝基化位点
Fig.4 Simultaneous identification and quantification of nitrosylation sites by combination of biotin switch and ICAT labeling
参考Fares等(2014)文献修改。
汪达丽等: 蛋白质亚硝基化检测和鉴定方法的研究进展 1085
纯化生物素化的多肽; (5)去除生物素尾巴后, 对同
位素标记的多肽进行LC-MS/MS分析; 不同的多肽
可根据在色谱柱中保留时间不同而进行分离; (6)
用LC-MS/MS得到多肽的质量谱图, 使用PepMass
(http://onassis7.tripod.com/pepmass.html)等质谱解
析软件解析质谱数据, 得到多肽序列; 再使用Pro-
tein Explorer (http://www.umass.edu/microbio/
chime/pe_beta/pe/protexpl/)等软件进行蛋白数据库
搜索, 调查蛋白序列并鉴定蛋白种类; (7)根据质谱
图上不同ICAT试剂标记的一对肽段离子峰值高低
的差异就能对亚硝基化蛋白进行相对定量。
该标记方法的主要优点是样品在MMTS封闭
和纯化前就混合, 降低了不同样品准备和处理过程
中造成的误差, 可以提供更加精准的定量结果。
5 亚硝基化半胱氨酸位点的结构特点
能否被亚硝基化取决于蛋白半胱氨酸残基两
端的氨基酸组成及蛋白形成的空间结构。亚硝基
化一般只发生在其靶蛋白的1或2个半胱氨酸残基
上, 靶蛋白被亚硝基化后, 蛋白功能就会发生改变
(Hess和Stamler 2012)。大多数蛋白氨基酸编码序
列里都含有Cys, 但这些Cys对NO基团的亲和力有
着显著差异, 并不是每个Cys都可被亚硝基化修饰
(Stamler 1994; Hess和Stamler 2012)。通过对不同
亚硝基化蛋白线性氨基酸序列的分析比较找到了
一个酸-碱氨基酸结构域, 被该结构域包围的Cys更
易于被亚硝基化修饰(Stamler 1997)。该酸-碱结构
域指的是靶Cys两边由酸性氨基酸残基(D、E)与
碱性氨基酸残基(R、H、K)包围形成的[KRHDE]-
C-[DE]结构; 后来又找到了一个疏水的GSNO结合
域([HKR]-C-[hydrophobic]X[D-E]) (Hess等2005)。
虽然利用酸-碱结构域和疏水结构域可以预测一些
亚硝基化位点(Lindermyar等2006), 但其并不适用
于所有蛋白(Hao等2006)。随着高通量蛋白质组学
方法的应用, 被鉴定出的亚硝基化Cys靶位点越来
越多, 使精确分析亚硝基化靶位点周围的微环境
成为可能。Liu等(2010)采用位点专一性的高通量
蛋白质组学方法从人类乳腺癌细胞中鉴定出一些
亚硝基化靶位点, 并从中总结出一个共有的I-C疏
水中心, 左右两边由酸性(D/E)和碱性氨基酸残基
(R/K)围绕, 该结果为亚硝基化靶位点周围存在酸
碱结构域和疏水环境的重要性提供了直接证据
(Hess等2001)。对拟南芥悬浮细胞进行蛋白质组
学方法鉴定, 找到了53个内源亚硝基化的靶位点
(Fares等2011), 对这些亚硝基化的Cys和其周围的
氨基酸残基进行分析表明, 这些靶位点周围并不
存在明显的酸-碱结构域 , 只有3个非极性残基
(Ala、Gly、Ile)富集在被修饰的Cys周围。另一些
研究结果表明, 决定是否为亚硝基化靶位点的不
只是其线性氨基酸顺序, 而是形成的三级空间结
构(Hao等2006)。根据已经鉴定出的68个亚硝基化
的半胱氨酸(Cys-SNO)位点信息, 并不能有效地揭
示1个蛋白质的二级结构特点, 表明未知的蛋白质
三级结构特点可能决定亚硝基化的特异性(Hao等
2006)。因此, 到目前为止还没有一种能够十分准
确预测亚硝基化靶位点的方法, 最终一定要通过
实验检验才能确证亚硝基化靶位点。
6 亚硝基化靶蛋白的数据库和基于算法建立的预
测亚硝基化靶位点的软件及网页
对用实验证实的亚硝基化靶蛋白和靶位点已
建立了数据库, 这为通过算法(algorithm)开发预测
亚硝基化的靶蛋白及靶位点奠定了基础。下面重
点介绍几个新建的数据库和新开发的用于预测亚
硝基化靶位点的软件和网页。
6.1 GPS-SNO1和GPS-SNO3
Xue等(2010)开发了GPS-SNO1 (group-based
prediction system, GSP)的软件, 该软件使用1种新
算法, 基于公共数据库中已知的327个蛋白中504
个亚硝基化靶位点所开发的; 在GPS-SNO1的基础
上, 后来又开发了GPS-SNO3。在设定为低阈值的
条件下, GPS-SNO3预测的准确率为75.8%, 敏感性
为53.57%, 专一性为80.14%。用GPS-SNO1对485
个来自PubMed的蛋白进行预测, 74%的蛋白中
至少有一个靶位点。GPS-SNO1软件可以免费从
http://sno.biocuckoo.org下载。
6.2 SNOSite
Lee等(2011)根据系统信息学的方法研究亚硝
基化底物的专一性, 开发了SNOsite (an effective
web-based tool for identifying cysteine S-nitrosyla-
tion sites)软件, 此系统是基于小鼠表皮细胞中鉴定
出的586个亚硝基化靶位点开发的。在开发SNOs-
ite时, 他们同时考虑蛋白的结构因素, 如Cys侧翼
氨基酸组成、可接触的表面积和生理生化特性等,
植物生理学报1086
目的是区分亚硝基化和非亚硝基化位点。他们用
MDD (maximal dependence decomposition)法获得
统计学上显著的保守结构域, 将靶位点的聚类序
列划分为11个亚组。应用SVM (support vector ma-
chine)对每个聚类的结构域建立可预测的模型。
根据5倍的交叉验证(cross-validation), MDD聚类的
SVM准确度可以达到90%。SNOSite可以免费在
http://csb.cse.yzu.edu.tw/SNOSite/上使用。
6.3 SNObase
SNObase (a database for S-nitrosation modifi-
cation)是中国科学院生物物理所陈畅研究组在已
鉴定出的2 561个亚硝基化靶蛋白的基础上建立起
来的(Zhang等2012)。SNObase能够提供的详细信
息包括靶位点、生物功能模型、与之相关的疾
病、亚硝基化趋势和亚硝基化对蛋白功能的影响
等信息, 但其不能进行靶位点的预测。SNObase可
登陆http://www.nitrosation.org免费使用。
6.4 dbSNO
dbSNO (a database of cysteine S-nitrosylation)
是在对已鉴定出的3 000多个亚硝基化靶位点进行
分析的基础上建立起来的(Lee等2012)。dbSNOS-
ite提供对这些蛋白的结构和功能分析, 包括靶位
点周围的结构域、溶剂的可接触性、蛋白的二级
及三级结构、蛋白的结构域及功能分类等信息,
同时dbSNO也可以对任何蛋白进行靶位点的预
测。dbSNO可以免费在http://dbSNO.mbc.nctu.edu.
tw上使用。
6.5 iSNO-PseAAC
PseAAC (pseudo amino acid composition)是近
期开发的另一个用于亚硝基化靶位点预测的系统
(Xu等2013), 该系统所用的数据库源自于dbSNO。
为了降低重复, 该系统只选用了dbSNO中438个靶
蛋白的731个靶位点用于建立预测模型。这438个
靶蛋白中任意2个蛋白之间的氨基酸序列一致性
(identity)不高于40%, 与其他预测靶位点的软件比
较, 其交叉验证的成功率高于90%。可登陆http://
app.aporc.org/iSNO-PseAAC/免费使用。
Kovacs和Lindermyar (2013)选取了10个已证
实的拟南芥亚硝基化靶蛋白, 分别用GPS-SNO、
SNOSite和iSNO-PseAAC预测软件进行比较。结
果显示, 以上软件均能成功预测出靶位点, 但预测
的专一性有较大差异。iSNO-PseAAC和SNOsite
的预测专一性较差, 而GPS-SNO预测的专一性最
高, 是最可靠的预测软件。在实验前通过以上软
件预测可能的SNO靶位点, 将为科研人员在实验
设计上提供很大的便利。
7 总结与展望
越来越多的研究表明, 蛋白的亚硝基化修饰参
与调控动植物中众多不同的生物学过程。以上各
种检测和鉴定亚硝基化靶蛋白及靶位点的方法, 对
不同样品或组织器官中亚硝基化水平的相对定量,
都对该领域的研究起了巨大的推动作用。建立亚
硝基化靶蛋白数据库和开发预测亚硝基化靶位点
的软件, 为从事该领域的科研工作者提供了较大的
便利。未来该领域研究的焦点是要利用这些新技
术和新方法鉴定出更多的亚硝基化靶蛋白及靶位
点, 拟揭示亚硝基化调控各种生理过程的机理及建
立亚硝基化调控各种生理过程的信号网络。
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