全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (11): 1933~1941　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0363 1933
收稿 2015-07-02　　修定 2015-11-02
资助 海南耕地改良关键技术研究与示范专项(HNGDhs2015)和中国热带农业科学院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项
(ITBB130302和ITBB130505)。
* 通讯作者(E-mail: yangchenglong208@163.com; Tel: 0589-3911295)。
海马齿Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(SpP5CS)基因的克隆和表达分析
申龙斌1, 杨成龙2,*, 郭建春3, 段瑞军3
1中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所, 农业部华南作物基因资源与种质创制重点开放实验室, 海南儋州571737;
2贵州省亚热带作物研究所, 贵州兴义562400; 3中国热带农业科学院生物技术研究所, 农业部热带作物生物学与遗传资源利
用重点实验室, 海口571101
摘要: 以海马齿为材料, 根据已克隆的P5CS基因的保守序列设计简并引物, 利用RT-PCR和RACE技术从海马齿中获得了一
个海马齿Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因。该基因cDNA序列全长2 452 bp, 其中包括开放读码框为2 169 bp、5′-UTR 52 bp和
3′-UTR 231 bp, 推断其编码722个氨基酸, 分子量79.4 kDa, 根据序列比对将其蛋白命名为SpP5CS。对该蛋白质序列进行生
物信息学分析表明: SpP5CS与冰叶日中花、海蓬子和葡萄等双子叶植物相似性较高, 而与小麦、狗尾草和水稻等单子叶
植物相似性较低。荧光定量PCR分析表明, 该基因在海马齿的叶中表达量最高, 在茎中其次; 海马齿SpP5CS基因在各部分
中的表达量随着盐胁迫的时间延长在叶中变化最为明显: 在400和600 mmol·L-1 NaCl胁迫9 h表达量最高, 在800 mmol·L-1
NaCl胁迫12 h最高, 其表达均表现先升高后降低的趋势。P5CS基因是植物体内合成脯氨酸的关键酶基因, SpP5CS基因的
克隆将为作物抗逆分子育种和进一步的功能分析打下基础。
关键词: 海马齿; SpP5CS; 盐胁迫; 表达分析
Cloning and Expression Analysis of Δ1-Pyrroline-5-Carboxylate Synthetase
(SpP5CS) from Sesuvium portulacastrum
SHEN Long-Bin1, YANG Cheng-Long2,*, GUO Jian-Chun3, DUAN Rui-Jun3
1Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China, Ministry of Agriculture, Tropi-
cal Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou, Hainan 571737, China;
2Guizhou Institute of Subtropical Crops, Xingyi, Guizhou 562400, China; 3Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of
Tropical Crops, Ministry of Agriculture, Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricul-
tural Sciences, Haikou 571101, China
Abstract: In this study, taking Sesuvium portulacastrum as an experimental material, SpP5CS gene has been
cloned by designed primers according to conserved sequence of cloned P5CS genes through the means of RT-
PCR and RACE technology. There are 2 452 bp in this gene cDNA which include 2 169 bp of open reading
frame, 52 bp of 5′-URT and 213 bp of 3-UTR. 722 amino acids were coded according to estimation with 79.4
kDa formed this proton which named SpP5C5 by alignment. This kind of SpP5CS sequence has higher similar-
ity to dicotyledon such as Mesembryanthemum crystallinum, Salicornia and grape, etc., but lower similarity to
monocotyledon such as wheat, rice and foxtail through bioinformatics analysis. As a result, it has highest gene
expression in the leaves of S. portulacastrum, and low expression level in its stems through RT-PCR analysis.
With the prolonging the stress of salt, the SpP5CS gene expression level in the leaves of S. portulacastrum has
been significant impacted: with treatment of 400 and 600 mmol·L-1 NaCl, the highest expression level reached
at 9 h, with treatment of 800 mmol·L-1 NaCl, the highest expression level reached at 12 h, and with the same
trend that: firstly increase and then decreasing. P5CS gene is a key enzyme gene in the synthesis of proline in
plants, so the cloning of SpP5CS gene might lay a foundation for the adversity resistance molecular breeding of
crop and further function analysis.
Key words: Sesuvium portulacastrum; SpP5CS; salt stress; expression profiles
植物生理学报1934
盐碱、低温和干旱等环境因子不仅严重限制
了植物生长, 也限制了农作物种植面积的扩增和
产量的提高。研究表明, 脯氨酸(proline)在植物体
内具有重要的生理功能: 脯氨酸具有渗透调节作
用, 在植物受到环境胁迫时作为一种渗透调节物
质 , 起到维持细胞内水分和氧化还原反应的平
衡、调节细胞渗透压、清除活性氧、保护蛋白质
分子和亚细胞结构的稳定的作用(Lehmann等2010;
Chen等2010), 使植物在逆境胁迫下维持正常生
长。虽然脯氨酸在植物体内可通过鸟氨酸或谷氨
酸两个途径合成, 但在逆境胁迫下, 谷氨酸合成途
径起主要作用(Delauney等1993)。Δ1-吡咯啉-5-羧
酸合成酶(P5CS)是谷氨酸合成途径中的限速酶, 具
有谷氨酸激酶和谷氨酸-γ-半醛脱氨酶活性, 催化
脯氨酸合成的前2步反应, 同时, P5CS的反馈调节
在控制植物处于正常和胁迫条件下脯氨酸的水平
起着重要作用(Zhang等1995; Verbruggen和Her-
mans 2008)。
近年来, 人们对P5CS研究逐渐深入, 已在拟南
芥、水稻(Choudhary等2005)、烟草(Kishor等
1995)、马铃薯(Hmida-Sayari等2005)、蒺藜状苜
蓿(Kim和Nam 2013)、甜高粱(Su等2011)等高等植
物中被克隆, 并通过转基因技术诱导P5CS基因过
量表达, 发现该基因能够显著提高植物的耐旱性
和耐盐性。因此, 植物积累脯氨酸的能力被视为
植物抗逆性强弱的重要指标之一, 而P5CS已被认
为是一个重要的抗逆相关基因(Zhu等1998)。
海马齿为真盐生红树林植物, 番杏属, 该属一
共有8个种, 我国只有一个种, 多生长于福建、广
东、海南、台湾中南部及澎湖列岛海岸(唐昌林
1996)。海马齿逆境生活能力非常强, 主要表现为
耐盐、耐旱和抗重金属(杨成龙等2010)。目前, 海
马齿P5CS基因的克隆与功能研究还未见报道。本
研究从海马齿中分离脯氨酸合成关键酶基因P5CS
的全长cDNA序列, 分析该基因的序列特征、进化
关系和不同盐胁迫诱导下的表达模式, 揭示其对
盐胁迫诱导的应答机制, 为利用该基因改良作物
的抗逆境胁迫能力提供理论指导。
材料与方法
1 试验材料和试剂
海马齿(Sesuvium portulacastrum L.)采自海南
省海口市郊区白沙门海滨。将同一株海马齿剪
成带有2个节间的茎段, 每个茎段上带有叶芽和2
片真叶, 将这些茎段放入Hoagland全营养液中培
养1周左右, 使其根长至5~10 cm。选取大小一致
的幼苗分别在200、400、600和800 mmol·L-1 NaCl
处理0、3、6、9、12、24和48 h, 然后取根、茎和
叶, 液氮速冻, –80 ℃保存备用。
植物RNA抽提试剂RNAplant plus Reagent购
自天根生物公司、LA Taq DNA聚合酶、pMD18-T
克隆载体、T4 DNA连接酶、Real-time PCR和RT-
PCR相关试剂购自大连宝生物工程公司, DNA琼
脂糖凝胶回收试剂盒、DNA Marker购自东盛公
司, 限制性内切酶、Taq DNA聚合酶购自Fermen-
tas公司, 引物合成及序列测定均由上海生物工程
股份有限公司完成。大肠杆菌感受态DH5α由本
实验保存。
2 RNA提取和cDNA第一链的合成
所有植物材料RNA采用RNAplant plus Re-
agent试剂说明书提取总RNA, 参照大连宝生物工
程公司PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA
Eraser试剂盒说明书合成cDNA第一链。
3 SpP5CS基因的克隆
3.1 SpP5CS基因cDNA部分片段的扩增及克隆
参照GenBank登录的植物P5CS基因的核苷
酸保守区序列, 设计一对简并引物P1和P2 (表1,
上海生物工程股份有限公司合成), 以反转录产物
为模板进行中间片段扩增: 94 ℃ 4 min; 94 ℃ 45 s,
57 ℃ 45 s, 72 ℃ 2 min, 共35个循环; 72 ℃延伸10
min。
3.2 SpP5CS基因5′RACE 和 3′RACE的克隆
根据P5CS基因片段的测序结果设计5′RACE
和3′RACE特异引物(表1)。通用引物APP和AUAP
的序列和RACE操作流程参照文献(Scotton-Lavino
等2006), 方法略有改动。
进行5′RACE时, 以P5CS2为引物进行cDNA第
1链合成, 反应产物经PCR纯化试剂盒纯化去除多
余dNTP和引物后, 利用末端转移酶TdT对产物加
polyA尾巴。以加尾的cDNA为模板, APP和P5CS3
(表1)为引物进行第1轮扩增: 94 ℃ 4 min; 94 ℃
45 s, 50 ℃ 45 s, 72 ℃ 3 min, 共35个循环; 72 ℃ 10
min。第1轮扩增产物稀释100倍后, 取1 μL稀释产
物作为模板, AUAP和P5CS1 (表1)为引物进行第
申龙斌等: 海马齿Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(SpP5CS)基因的克隆和表达分析 1935
2轮嵌套扩增: 94 ℃ 4 min; 94 ℃ 45 s, 58 ℃ 1 min,
72 ℃ 3 min, 共35个循环; 72 ℃ 10 min。进行
3′RACE时, 以QT为引物进行cDNA第1链合成。以
cDNA产物为模板, 用QO和P5SC32 (表1)进行第
1轮PCR扩增, 扩增程序与5′RACE的第1轮PCR扩
增程序相同。第1轮PCR产物稀释100倍后, 取1 μL
稀释产物作为模板, QI和P5SC33 (表1)为引物进行
第2轮嵌套扩增, 扩增程序与5′RACE的第2轮PCR
扩增程序相同。
3.3 SpP5CS基因全长cDNA的克隆
利用D N A M A N软件对海马齿P 5 C S基因
cDNA部分片段、5′端和3′端序列进行拼接, 得到
海马齿P5CS基因全长cDNA的拼接序列。根据5′
端和3′端序列设计一对引物P5CS-F和P5CS-R (表
1), 用LA Taq DNA聚合酶进行PCR扩增。扩增程
序为: 94 ℃ 4 min; 94 ℃ 45 s, 61 ℃ 45 s, 72 ℃ 3
min, 共35个循环; 72 ℃ 10 min。
上述PCR产物均进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳
检测, 并回收纯化目的条带, 克隆到pMD18-T载体
上, 送上海生物工程股份有限公司测序。
4 SpP5CS基因的生物信息学分析
利用NCBI在线分析软件(http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/gorf/gorf.html)对SpP5CS基因全长cDNA序
列的开放读码框进行预测, 并通过网站中的软件
对SpP5CS基因核苷酸序列利用Blastn软件进行比
对, 对其推测的氨基酸序列利用Blastp软件进行比
对和保守性功能域预测, 最后利用(http://www.ex-
pasy.ch/tools/pi_tool.html)网站分析SpP5CS基因编
码蛋白质的等电点和分子量, 利用MEGA 5.0软件
分析SpP5CS基因氨基酸序列的结构域、同源性,
并构建系统进化树。
5 SpP5CS基因的不同盐胁迫条件下的表达模式分析
根据已获得 S p P 5 C S基因全长设计引物
qP5CS-F和qP5CS-R (表1), 扩增200 bp左右的基因
片段, 以海马齿看家基因GAPDH作为内参。qPCR
体系按照SYBR Premix Ex TaqTM II说明书进行加
样。扩增程序为95 ℃ 1 min; 95 ℃ 5 s, 61 ℃ 30 s,
45个循环。每个处理分别设3个重复, 用Excel进行
数据分析。
实验结果
1 海马齿叶片总RNA的提取
参考PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA
Eraser试剂盒说明书提取海马齿总RNA, 1%非变性
琼脂糖凝胶检测, 图1结果表明RNA条带清楚, 且
28S rRNA与18S rRNA之比为2:1, 带与带之间无弥
表1 海马齿SpP5CS基因克隆引物
Table 1 Primers of cloning SpP5CS cDNA from S. portulacastrum
引物 引物序列(5′→3′) 碱基数
P1 CTTGATGGGAAAGCATGTGC 20
P2 CCTCGAGCATGAATCCTACTT 21
P5CS1 CCGTCACCAGAAGTTGAGCAGA 22
P5CS2 TCTGTTTGATGCTTCTCTCGGAC 23
P5CS3 AAGTCGTTGTCCGTCACCAGAA 22
P5CS32 GTACTGTGGAAATAGTGGATGA 22
P5CS33 TTGGGTTGGGTGCTGAGGTCGG 22
APP GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG 36
AUAP GGCCACGCGTCGACTAGTAC 20
QT CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTT 52
QO CCAGTGAGCAGAGTGACG 18
QI GAGGACTCGAGCTCAAGC 18
P5CS-F CGCGGATCCGCTTCGCTGGTTGCTATGGGC 30
P5CS-R CCGGTCGACGAGAGGAGGCGAAAAACACGA 30
qP5CS-F TATGGAGGAGCCTATTGGTAAAA 23
qP5CS-R TCTGAACTAAAGCATCTGGACGA 23
GAPDH-1 TTGGCATCGTTGAGGGTCT 19
GAPDH-2 CAGTGGGAACACGGAAAGC 19
植物生理学报1936
散现象, 说明RNA完整性比较好。因此, 可以选取
这样的RNA样品进行反转录, 作为后续的分子实
验的模板。
2 SpP5CS基因克隆和序列分析
利用简并引物扩增得到一条1 500 bp左右的
中间片段(图2-B), 通过Blastn软件比对分析表明,
该片段与多种植物的P5CS基因有较高的同源性,
由此判断该片段为海马齿SpP5CS基因cDNA的部
分序列。根据中间片段设计RACE特异性引物,
5′RACE扩增获得1条特异性较强的700 bp左右的
片段(图2-A), 3′RACE扩增得到1条1 000 bp的片段
(图2-C)。在 3′端和5′端拼接后的全长序列的起始
密码子和终止密码子附近设计一对特异引物, PCR
扩增获得约2 275 bp的目的条带, 测序结果与拼接
的编码区序列结果完全吻合(图2-D)。将该基因命
名为SpP5CS, 该cDNA推导编码722个氨基酸。
将两端的通用引物序列去除, 使用DNAMAN
软件将1 000 bp的3′RACE序列、1 500 bp的中间序
列和700 bp 5′RACE序列进行拼接, 获得一条长度
为2 452 bp的全长基因cDNA序列。ORF Finder软
件分析表明, 该基因含有一段52 bp的5′端非编码区
(5′-UTR)、一段包含polyA尾巴的231 bp的3′端非
编码区(3′-UTR)和一个长度为2 169 bp的完整的阅
读框, 编码722个氨基酸, 分子量为79.4 kDa, 等电
点(pI)为6.23。
Blastp比对结果显示, SpP5CS基因编码的氨基
酸与其他植物P5CS基因编码的氨基酸序列具有很
高的同源性, 与冰叶日中花McP5CS (Mesembryan-
themum crystallinum, O65361.1)同源性为90%, 与
海蓬子SbP5CS (Salicornia bigelovii, AGW51410.1)
同源性为87%, 与葡萄VvP5CS (Vitis vinifera,
CBI31612.3)同源性为81% (图3)。该结果表明, 本
研究所克隆的cDNA序列为海马齿二氢吡咯-5-羧
酸合成酶基因, 该基因命名为SpP5CS (S. portulac-
astrum Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase)。
3 SpP5CS基因的生物信息学分析
利用DNAMAN软件对SpP5CS基因编码的氨
基酸序列与冰叶日中花、海蓬子、麻疯树(Jatro-
pha curcas)、黄瓜(Cucumis sativus)和葡萄等P5CS
基因编码的氨基酸序列进行多序列比对发现, Sp-
P5CS基因的保守区域与冰叶日中花、海蓬子、麻
图1 海马齿总RNA提取
Fig.1 Extraction of total RNAs from S. portulacastrum
M: DL2000 Marker; 1: RNA。
图2 海马齿SpP5CS基因PCR扩增
Fig.2 Agarose gel electrophoresis for the cloning of SpP5CS from S. portulacastrum
A: 5′端编码区片段; B: 中间片段; C: 3′端cDNA 片段; D: cDNA全长; M: DNA Marker; 1~4: 扩增条带。
申龙斌等: 海马齿Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(SpP5CS)基因的克隆和表达分析 1937
图3 SpP5CS基因氨基酸序列和其他物种P5CS基因比较分析
Fig.3 Comparison of the deduced amino acid sequences of SpP5CS with other plants
I: ATP 结构域; II: 亮氨酸功能域; III: 谷氨酸激酶结构域; IV: NAD(P)H结构域; V: 谷氨酸-γ-半醛(GSA)结构域。S. bigelovii: 海蓬子; S.
portulacastrum: 海马齿; V. vinifera: 葡萄; C. sativus: 黄瓜; J. curcas: 麻风树; M. crystallinum: 冰叶日中花。
植物生理学报1938
疯树、黄瓜和葡萄的保守结构域一致, P5CS蛋白
保守结构域含有以下5个主要功能域(图3): 谷氨
酸激酶 (γ-GK)保守域、谷氨酸 -γ-半醛脱氢酶
(GSADH)保守域、一个假想的亮氨酸保守域及
ATP结合位点、NAD(P)H结合位点。SpP5CS基因
编码产物具有的这些特征表明, 该基因编码的氨
基酸序列为典型的植物二氢吡咯-5-羧酸合成酶。
利用NCBI数据库对SpP5CS的结合位点和结
构域分析表明: SpP5CS多肽的N端为氨基酸激酶
(AAK)超家族成员G5K结构域, 含有ATP结合位
点、 磷酸结合位点和脯氨酸的变构结合位点, G5K
催化ATP释放能量并转移末端磷酸基团给L-Glu生
成谷氨酰磷酸(CGP); C端为醛脱氢酶(ALDH-SF)
超家族γ-谷氨酸磷酸还原酶(GPR, 等同于GSADH)
结构域, 催化NADPH传递氢给CGP生成GSA。
利用MEGA5.0工具对SpP5CS与植物中其他
已克隆的P5CS氨基酸序列进行同源性分析比对:
结果表明SpP5CS与冰叶日中花P5CS的同源性为
90%; 而与拟南芥、蓖麻和小麦等的P5CS同源性
相对较低。进化树(图4)分析表明, P5CS类蛋白在
进化过程中出现了较大差异, 大致可以分为3个类
群, 来源于单子叶植物的P5CS, 来源于双子叶植物
的P5CS, 以及亲缘关系较近且相对抗逆性较强的
一类植物。
图4 SpP5CS蛋白与其他植物P5CS的氨基酸序列进化树
Fig.4 Phylogenetic tree of amino acid sequences between SpP5CS and other P5CS proteins
蛋白质序列为: 海马齿SpP5CS, 蓖麻RcP5CS (XP_002524230.1), 麻疯树JcP5CS (ADK37758.1), 杨树PtP5CS (XP_002315202.1), 大
叶黄杨EjP5CS (ACF19677.1), 亚洲棉GaP5CS (ACI62865.1), 苎麻BnP5CS (AEV46825.1), 牛枝子LpP5CS (AFW04294.1), 黄瓜CsP5CS
(XP_004138450.1), 琴叶拟南芥AlP5CS2 (XP_002878042.1), 拟南芥AtP5CS2 (NP_191120.2), 拟南芥AtP5CS1 (NP_181510.1), 欧洲油
菜BnP5CSA (AAK01360.1), 冰叶日中花McP5CS (O65361.1), 海蓬子SbP5CS (AGW51410.1), 葡萄VvP5CS (CBI31612.3), 可可TcP5CS
(EOY07413.1), 大豆GmP5CS (XP_003516890.1), 蒺藜状苜蓿MtP5CS (AET35478.1), 蒺藜状苜蓿MtP5CS2 (AET87351.1), 大豆GxP5CS2
(XP_003552202.1), 水茄StP5CS (AEN04068.1), 番茄SlP5CS (NP_001233907.1), 烟草NtP5CS (ADL61840.1), 罗布麻AvP5CS (ABO70348.1),
斑茅SaP5CS (ABV03819.1), 甘蔗SoP5CS (ABV03819.1), 狗尾草SiP5CS (XP_004961886.1), 水稻OsP5CS (BAA19916.1), 小麦TaP5CS
(AAX35536.1), 二穗短柄草BdP5CS (XP_003568327.1), 高粱SbP5CS2 (ACU65227.1)。I: 单子叶类植物的PSCS蛋白; II: 双子叶类植物的
PSCS蛋白; III: 亲缘关系较近且相对抗逆性较强的一类植物的PSCS蛋白。
申龙斌等: 海马齿Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(SpP5CS)基因的克隆和表达分析 1939
4 SpP5CS基因表达特征分析
4.1 海马齿SpPSCS在根茎叶中的表达量分析
分别提取海马齿的根、茎和叶部位的RNA进
行荧光定量PCR, 分析SpP5CS在海马齿不同器官
中的表达模式。图5结果表明, SpP5CS在海马齿的
各组织中均有表达, 其中在叶表达较高, 茎表达量
图5 正常条件下SpP5CS基因在海马齿根、茎和叶表达量
分析
Fig.5 Expression analysis of SpP5CS in root, stem, and leaf
of S. portulacastrum under normal condition
图6 不同浓度NaCl处理后SpP5CS基因在根(R)、茎(S)和叶(L)中表达的动态规律
Fig.6 The dynamic rule of expression of SpP5CS in root (R), stem (S), and leaf (L) of S. portulacastrum under different
concentrations of NaCl stresses
A: 200 mmol·L-1 NaCl; B: 400 mmol·L-1 NaCl; C: 600 mmol·L-1 NaCl; D: 800 mmol·L-1 NaCl。
次之, 在根中表达最弱。表明正常生长情况下, Sp-
P5CS在海马齿的各组织中都有表达, 其中地上部
器官中表达量显著高于地下器官中的表达量。
4.2 SpP5CS在盐胁迫下的表达模式分析
在200 mmol·L-1 NaCl胁迫下, 随着盐胁迫时
间的增加, 海马齿茎的SpP5CS基因的表达量变化
最为明显, 表达量在12 h最高(图6-A)。在高浓度
盐胁迫下, 海马齿SpP5CS基因在各部分中的表达
量随着盐胁迫的时间延长在叶中变化最为明显:
在400和600 mmol·L-1 NaCl时9 h表达量最高(图
6-B、C), 在800 mmol·L-1 NaCl时12 h最高(图6-D);
在400和600 mmol·L-1 NaCl时, SpP5CS基因在茎中
的表达量分别在12和6 h时最高。
讨　　论
植物在盐胁迫、干旱等逆境条件下积累脯氨
酸是一种较普遍的现象(Hare和Cress 1997), 植物
通过积累小分子有机物来调节体内的渗透调节,
植物生理学报1940
抵御不利环境对其的伤害。大量研究表明, 脯氨
酸是植物在受到各种非生物胁迫时在体内大量积
累维持渗透压稳定和氧化还原反应平衡的一种重
要的物质(Lehmann等2010; Szabados和Savouré
2010; Strizhov等1997; Hong等2000)。研究发现,
P5CS具有ATP结合位点、NADPH结合位点、谷
氨酰激酶(GK)结构域和谷氨酸半醛(GSA)结构域,
催化从L-Glu到脯氨酸等过程中的关键酶(Fujita等
1998)。本研究通过RT-PCR结合RACE技术从海马
齿中克隆到SpP5CS基因的全长cDNA序列, 通过对
其功能域分析和Clustal W多重比对发现, 该基因
推测的氨基酸序列与其他物种P5CS基因氨基酸序
列在蛋白质结构上很类似, 且在ATP结合位点、
NADPH结合位点、谷氨酰激酶(GK)结构域和谷
氨酸半醛(GSA)结构域均较为保守, 这与其他人的
研究结果相一致(Su等2011), 从而证明该基因保守
性很高。本试验发现, 随盐胁迫浓度的升高, 海马
齿叶片中SpP5CS基因的变化最为明显(图6), 这为
实验室前期研究发现盐胁迫下海马齿叶片中脯氨
酸含量增加, 并与盐浓度之间呈正相关提供了理
论依据(杨成龙等2010), 说明了海马齿的叶片是盐
胁迫最敏感的部位, 并且盐离子最终被贮藏在海
马齿叶片的液泡中(Yeo和Flowers 1977)。海马齿
在受到盐胁迫时, 能主动通过大量增加脯氨酸来
缓解盐胁迫引起的渗透胁迫, 从而对盐碱起到抵
抗作用, 即海马齿体内脯氨酸含量的积累可能是
其耐盐性的生理机制之一(杨成龙等2010)。
利用实时荧光定量PCR, 分析海马齿不同部
位SpP5CS基因的表达情况发现: (1)非胁迫条件下,
SpP5CS基因在叶中的表达量最高, 根中最低。盐
处理后, SpP5CS基因显著上调表达, 茎和叶中的表
达量最高, 这与黑麦草的表达模式相同(曹丽等
2010); 未处理海马齿SpP5CS叶中的表达量最高,
盐处理后叶和茎中表达量最高, 根中最低。(2) Sp-
P5CS基因在高盐胁迫下海马齿叶中明显增加, 为
海马齿更加适应盐胁迫提供渗透调节物质, 也为
海马齿叶片内酶系统提供一个更适的微环境, 从
而说明SpP5CS基因在盐胁迫下脯氨酸含量的变化
中起关键作用。本研究获得了SpP5CS基因并对其
表达模式进行初步研究, 为研究SpP5CS基因在海
马齿抗逆过程所起到的作用以及为培育耐盐作物
奠定基础。
参考文献
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