全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 5期，2008年 10月 973
盐生肉质化植物海马齿(Sesuvium portulacastrum L.)中总RNA提取方法
的优化
杨成龙, 段瑞军, 郭建春 *
中国热带农业科学院生物技术研究所, 海口 571101
Optimization Methods for Extracting Total RNA from Salt-living and Succu-
lent Plant Sesuvium portulacastrum L.
YANG Cheng-Long, DUAN Rui-Jun, GUO Jian-Chun*
Institute of Biotechnology and Bioscience, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China
提要: 以海马齿为材料, 分别用 CTAB法、SDS法、Trizol方法以及改进的 CTAB法提取其总RNA, 并比较了各RNA的产
率、纯度和完整性等。 结果表明, 改进的CTAB法对海马齿总RNA的提取有较好的效果, 所得总RNA的 28S、18S和 5S
条带清晰, A260/A280比值为2.0, A260/A230比值为2.08, RNA产量可达56 µg·g-1 (FW)。经RT-PCR获得了特异条带, 说明利用改
良的CTAB法从海马齿中提取到的RNA质量好、产率高、完整性强, 完全适合于进一步的分子生物学研究。
关键词: 海马齿; 多糖; 多酚; 总RNA; 改良CTAB
收稿 2008-06-30 修定 2008-09-12
资助 中国热带农业科学院(RKy0725)、国家重点基础研究发
展计划(“973”计划) (92007CB108903)、中央级公益性
科研院所基本科研项目(CATASITBBYB072)。
* 通讯作者(E-mail: jianchunguoh@163.com; Tel: 0898-
6 6 8 9 0 6 3 5 )。
植物中的RNA是分子生物学研究的重要材料,
如: 用于Northern杂交分析、RT-PCR、cDNA文
库构建、差示 PCR分析及体外转译、基因分离
和基因转录表达调控等分子研究(李宏和王新力
1999)。海马齿又名滨水菜, 属于番杏科(Aizoaceae)
海马齿属(Sesuvium), 生长在海边沙地或盐碱地的多
年生匍匐性肉质草本植物。海马齿的组织中存在
大量的多糖、多酚和其他次生类代谢物质, 这些物
质很容易与RNA共沉淀, 干扰RNA的提取和纯化,
影响 RNA的产量和质量。因此, 要获得完整的、
高纯度的 RNA是一项较为困难的工作。另外, 一
些常用的RNA酶强烈变性剂和较高温度处理都会
使多糖类物质糊化, 溶液变得粘稠而不易处理, 因
此, 去除多糖等物质是分离这类植物组织中RNA的
关键。目前应用较多的有CTAB法(曾会才 2003)、
SDS法(刘海等 2006; 杜中军等 2005)、异硫氰酸
胍法(张志刚等 2006)、热硼酸盐法(李宏和王新力
1999)以及商业试剂盒 Trizol等。由于各种不同植
物有其各自的生理结构特点和含有不同的生理代谢
产物, 因此, RNA的提取方法也不尽相同(望飞勇等
2007)。本研究综合了多种 RNA的提取方法, 在
CTAB法基础上进行了改良, 成功地从盐生肉质化
海马齿中提取了较为完整的 RNA。
材料与方法
1 植物材料
海马齿(Sesuvium portulacastrum L.)采自海南
省海口市郊区白沙门海滨, 用同一株海马齿进行大
量扦插, 使其成活后, 取培养 30 d后的健康幼苗植
株作为实验材料。
2 方法
2.1 CTAB法 参照曾会才(2003)、方孝东等(1998)
的 CTAB法进行。
2.2 改良CTAB法 通过综合多种植物RNA提取的
CTAB方法而获得(方孝东等 1998; 李宏和王新力
1999; Bekesiova等 1999; 曾会才 2003; 史宝胜和卓
丽环 2006; 葛晓萍和石琰璟 2007)。取 3 g材料磨
成粉末, 加入到 15 mL提取缓冲液[2% CTAB、100
mmol·L-1 Tris-HCl (pH 8.0)、1.4 mol·L-1 NaCl、20
mmol·L-1 EDTA (pH 8.0)、2% PVP, 用前加入 β-巯
基乙醇至终浓度为 2%], 用力混匀, 于 65 ℃中放置
30 min, 每隔 5~10 min 混匀 1次。然后冷至室温,
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加入 0.25倍体积的无水乙醇和 0.11倍体积的 5
mol·L-1 KAc溶液(pH 4.8), 旋涡混匀。用等体积的
氯仿 /异戊醇(24:1)抽提, 4 ℃下以17 000×g离心15
min。上清液加 8 mol·L-1 LiCl至终浓度为 3 mol·L-1
(0.6体积), 加入 80 µL β-巯基乙醇至终浓度达到
2%。-20 ℃放置过夜或 8 h以上, 4 ℃下以17 000×
g离心 30 min。RNA沉淀用 4 mL SST缓冲液[0.5%
SDS、l mmol·L-1 EDTA (pH 8.0)、l mol·L-1 NaC1、
10 mmol·L-1 Tris-HCl (pH 8.0)]溶解, 加入 80 µL β-
巯基乙醇至终浓度达到2%。混匀后加入等体积的
酚:氯仿:异戊醇(25:24:1), 涡旋混匀, 冰浴 10 min。
4 ℃下以 17 000×g离心 15 min。上清液中加入等
体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1), 涡旋混匀, 冰浴 10
min。上清液按照以上方法重复沉淀 2次。然后
上清液加入0.11倍体积的5 mol·L-1 KAc (pH 4.8)和
0.25体积的无水乙醇, 冰上放置 30 min, 4 ℃以下
17 000×g离心 20 min, 沉淀多糖。上清液加等体
积的异丙醇, -20 ℃沉淀 30 min以上, 然后 4 ℃下
以 17 000×g离心20 min沉淀RNA。沉淀物用75%
乙醇洗涤 2次, 真空干燥, 用适量体积的DEPC水
溶解RNA, 取少量用于琼脂糖凝胶电泳, 其余置于
-70 ℃冰箱中保存备用。
2.3 Trizol试剂法 具体步骤按照 Trizol试剂盒(上
海生工生物工程技术服务有限公司)说明进行, 但在
研磨时加入 0.2 g PVP。
2.4 SDS法 参照刘海等(2006)、杜中军等(2005)
的 SDS法进行, 略有改动。
3 RNA纯度及完整性检测
分别取5 µL提取的样品RNA溶液, 在0.8%非
变性琼脂糖凝胶中电泳, GoldViewTM Nucleic Acid
Stain染色, 而后在凝胶成像系统下观察并拍照。
取 2 µL RNA溶液稀释至 200 µL, 用紫外 -可见分
光光度计测量 A230、A260、A280值, 并计算A260/A230、
A260/A280的比值, 确定其纯度, 再计算得率。
4 RT-PCR分析
cDNA第一链的合成按反转录酶说明指导书进
行。实验所用的目的基因为 Actin基因(GenBank:
EU697920), 以P1 (5 CAGTGGTCGTACAACTGGTAT
3 和P2 (5 ATCCTCCAATCCAGACACTGT 3 )为引
物进行 PCR反应。PCR反应条件为: 94 ℃ 5 min预
变性; 然后 94 ℃ 1 min, 50 ℃ 1 min, 72 ℃ 45 s, 30个
循环; 最后 72 ℃ 10 min。PCR产物在 1%非变性琼
脂糖凝胶电泳检测。
实验结果
1 RNA完整性比较
将提取得到的总RNA经0.8%非变性琼脂糖凝
胶检测, 改良CTAB法提取的总RNA有28S、18S、
5S三条清晰的带型, 且 28S rRNA与 18S rRNA之
比为 2:1, 带与带之间无弥散现象, 说明 RNA在提
取过程中结构基本完整, 降解很少(图 1-2)。而用
上述描述的CTAB法和SDS法提取的总RNA带型
弥散, 说明多糖、多酚等次生代谢物质还有残留,
不能完全去除。Trizol试剂盒法提取的总 RNA的
28S条带的亮度低于18S, 说明此方法总RNA的完
整性较差(图 1)。
2 纯度和浓度比较
从4种方法提取的总RNA溶液中分别取2 µL
稀释成 200 µL, 于 Beckman DU-70 Spectrophotom-
eter中分别测量 A230、A260和 A280值, 结果见表 1。
从表1可以看到, Trizol法和改良CTAB法所提取的
RNA纯度高于 SDS法和 CTAB法所提取的 RNA,
A260/A280都可以达到1.9以上, 而改良CTAB法纯度
最高, 说明此方法可以满足分子实验的要求。由于
吸光比值A260/A280的大小直接反映多糖、多酚和蛋
白质污染程度(Logemann等 1987; Manning 1991)。
因此我们认为, 改良 CTAB法和Trizol法都可以很
好地去除这些杂质。从A260/A230的比值小于2.0, 表
明其中有大量的小分子或盐存在, 表明其他 3种方
法所得的RNA有待进一步纯化(望飞勇等 2007), 从
而可以看出改良CTAB法所提的RNA小分子或盐
去除较干净。从 RNA产量而言, 改良 CTAB法较
图 1 RNA电泳图
1: CTAB法; 2: 改良 CTAB法; 3: Trizol法; 4: SDS法。
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CTAB法、Trizol法和 SDS法产量都高。所以综
合纯度、完整性和产量等方面, 我们认为该改良
CTAB 法提取肉质化盐生植物的RNA是比较理想
的。
3 RT-PCR结果
分别取相同OD (A260)值的反转录产物为模板
进行 PCR扩增, 这几种方法提取的总 RNA都可以
扩增出一条 600 bp的条带(图 2), 这与我们预期推
测的片段和最后测序所得到的结果相吻合。但是,
从条带的亮度可以说明改良的 CTAB法提取的总
RNA反转录活性高, 而其他3种方法由于多糖、多
酚或者完整性不好等原因影响了RT-PCR的结果。
同时也说明改良的CTAB法提取的总RNA的完整
性和纯度都达到了我们预期的要求。
酚等物质去除干净, 而 Trizol法完整性较差, 小分
子物质较多, DNA未除干净, 对以后的分子操作将
有可能产生影响。所以, 以上这 3种方法都没有获
得达到要求的 RNA。
本实验把原来 CTAB法提取液中加入 2%的
PVP, 并在提取液中增加 1% β-巯基乙醇, 保证了
酚类物质保持还原态, 然后再将其与 RNA分开。
通过Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以将未被氧化的
酚类化合物去除。与 PVP、不溶性 PVPP或 BSA
结合的多酚, 可以直接通过离心去除掉或在苯酚、
氯仿抽提时除去(Wang和Vodkin 1994)。同时, 在
开始进行氯仿抽提时先加入0.25倍无水乙醇和0.11
倍体积的5 mol·L-1 KAc替代原来CTAB法中直接用
氯仿抽提植物材料匀浆液, 这样, 植物材料匀浆液
中的多糖和多酚在无水乙醇和 5 mol·L-1 KAc作用
下能部分去除。其次, 用 SST缓冲液溶解 RNA沉
淀替代原CTAB法中用异硫氰酸胍溶解RNA沉淀,
再进行第二次苯酚、氯仿抽提。然后用 1/10体积
3 mol·L-1 NaAC (pH 5.2)和 2倍体积无水乙醇换成
等倍体积的异丙醇沉淀 RNA, 取得了较好的结
果。
比较几种RNA提取方法, 改良CTAB法成本较
低, 试剂配制简单, 操作简便, RNA质量高, 是多
酚、多糖和次生物质含量高的植物总RNA提取比
较有效的方法。
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表 1 使用不同方法提取的RNA的纯度与产量
方法 A230 A260 A280 A260/A230 A260/A280 产量 /µg·g-1 (FW)
CTAB法 0.055 0.079 0.047 1.43 1.67 50.0
改良 CTAB法 0.210 0.457 0.219 2.08 2.00 56.7
Trizol法 0.760 0.777 0.398 1.02 1.95 50.0
SDS法 1.305 0.626 0.359 0.48 1.74 41.7
图 2 RT-PCR电泳图
M: DNA Marker; 1: 阴性对照; 2: 以 SDS法提取的总 RNA为
模板; 3: 以 Trizol法提取的总 RNA为模板; 4: 以 CTAB法提取
的总 RNA为模板; 5: 以改良 CTAB 法提取的总 RNA为模板。
讨　　论
相对于其他植物来说, 肉质化的盐生植物海马
齿植物组织中多糖、多酚等次生产物的含量较多,
为提取完整性好、纯度高的 RNA带来困难。本
实验运用的 SDS法和 CTAB法都不能把多糖、多
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