全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 3期，2009年 3月258
收稿 2008-11-27 修定 　2009-01-08
资助 国家 “863”计划(2007AA10Z100)和河南农业大学博士
启动基金(30 40 0 24 7)。
* 通讯作者(E-ma il : l i jw55 5 @sohu .com; T el: 0 37 1 -
6 3 5 5 4 9 5 9 )。
甜瓜EST序列中微卫星的分布特征
胡建斌, 刘颖, 王兰菊, 李建吾 *
河南农业大学园艺学院, 郑州 450002
提要: GenBank中 35 547条甜瓜 EST经去冗余处理后, 得到总长度为 250.3 Mb的无冗余 EST 34 438条。这些序列中有 2
813个微卫星简单重复序列(Simple sequence repeat, SSR), 分布于 2 107条EST中, 出现频率为 8.16%, 平均分布距离为 8.90
kb。三核苷酸重复是主导重复类型, 占SSR总数的47.14%; 其次是二核苷酸和单核苷酸重复, 分别占SSR总数的20.72%和
16.99%。AAG/TTC是优势重复基元, 占微卫星总数的 29.26%, AG/CT和A/T分别占 14.61%和 16.25%。在所有的 SSR中,
重复次数为 4~10次的占 70.32%, 长度为 12~20 bp的占 51.12%。并对这些SSR的多态性潜能进行了评价。
关键词: 甜瓜; EST序列; 微卫星; 特征
Characteristics of Microsatellites in Melon (Cucumis melo L.) EST Sequences
HU Jian-Bin, LIU Ying, WANG Lan-Ju, LI Jian-Wu*
College of Horticulture, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
Abstract: 34 438 melon expressed sequence tags (ESTs) were obtained after the removal of redundant se-
quences from 35 547 melon ESTs deposited in GenBank. In these ESTs, 2 813 microsatellites (simple sequence
repeat, SSR) were tested and distributed in 2 107 ESTs. The occurrence frequency of SSR was 8.16% and the
average distribution distance was 8.90 kb. Trinucleotide repeats were dominant repeat types and accounted for
47.14%. Dinucleotide and mononucleotide repeats accounted for 20.72% and 16.99%, respectively. AAG/TTC
was most frequent repeat motif and accounted for 29.26% in all SSRs. AG/CT and A/T accounted for 14.61%
and 16.25%, respectively. Among all SSRs, SSRs which repeated 4 to 10 times accounted for 70.32%, and SSRs
which was 12 to 20 bp long accounted for 51.12%. The potential polymorphism of these SSRs was also analyzed.
Key words: melon (Cucumis melo L.); EST sequence; microsatellite; characteristic
微卫星或简单重复序列(simple sequence repeat,
SSR)广泛存在真核生物的基因组中, 因其数量丰
富、多态性高、多等位性、共显性等特点(Powell
等 1996; Varshney等 2005a), SSR标记被公认为目
前遗传学研究中最令人信赖的分子标记之一。然
而, SSR引物的开发通常需构建文库、筛选、测
序等工作, 费时费力。公共数据库中数量不断增加
的表达序列标签(expressed sequence tag, EST)极大
地增强了对基于EST的SSR标记开发能力。迄今,
在多种农作物中, 大量的EST-SSR标记已经得到开
发, 并广泛用于遗传图谱的构建、基因发掘、遗
传进化及比较基因组的研究(李永强等 2004; 李小
白等 2006)。
甜瓜(Cucumis melo L.)为葫芦科(Cucurbitaceae)
黄瓜属植物, 是一种世界性的园艺作物, 栽培历史
悠久, 种质资源丰富, 世界各国都非常重视其遗传
学研究。甜瓜基因组学的研究进展较快, 现已构建
了12张遗传图谱, 一些控制重要经济性状和抗病性
的基因或QTL已定位在图谱中(苏芳等2007), 为甜
瓜基因结构和功能的研究奠定了基础。然而, 现已
发表的甜瓜遗传图谱主要由同工酶、R A P D、
RFLP、AFLP等标记构成, 与小麦、水稻和棉花
等农作物的图谱相比, 甜瓜遗传图谱所包含的SSR
标记较少。另一方面, RAPD、AFLP、基因组
SSR等分子标记或是扩增非编码区域, 或是随机在
基因组中扩增, 得到的位点一般与目标性状基因的
距离较远, 以致分子标记在应用上与其目标有一定
的偏差。EST-SSR来源于编码区DNA, 代表基因
表达信息, 这使得直接鉴定决定重要表型性状的等
位基因的工作成为可能(Kumpatla和Mukhopadhyay
2005)。到现在为止, 甜瓜基因组测序已得到 3万
多条EST, 为EST-SSR标记的开发提供了丰富的资
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源。本文从GenBank公布的EST中查找甜瓜SSR,
分析这些SSR在甜瓜转录组中的特点和分布规律,
从而为 EST-SSR标记的开发建立基础。
材料与方法
以 “melon mRNA”为关键词采用FASTA格式
从GenBank/dbEST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
entrez)下载35 547条甜瓜(Cucumis melo L.) EST序
列(以 2008年5月 20日NCBI公布的数据为准), 它
们主要来自甜瓜的果实、叶片、根等组织。
采用 EST-trimmer (http://pgrc.ipk-gatersleben.
de/misa/download/est_trimmer.pl)、cross-match
(www.phrap.org)等网络软件除去 EST中重复、
ployA/T “ 尾巴 ”、载体等赝象序列。用MISA
(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)在无冗
余 EST中搜索 SSR, 并结合手工查寻。搜索条件
为: 含有单、二和三核苷酸基元的最小重复数分别
为 20、8和 5, 四核苷酸或四核苷酸以上的 SSR最
小重复数均为4。分别统计甜瓜不同组织中SSR的
数目和出现频率。为了便于统计和分析SSR序列,
将重复基元所有循环序列和互补序列视为一类。
如ACT、CTA、TAC、TGA、GAT和ATG均归
为一类。
实验结果
1 甜瓜EST-SSR的频率和分布密度
从NCBI网站下载的 35 547条甜瓜EST序列,
主要来源于甜瓜的根(13 853条)、果实(10 585
条)、子叶(5 664条)、叶片(3 212条)和韧皮部
(1 800条), 另外还有少量来自悬浮细胞和愈伤组
织。经净化处理(除去重复、ployA/T、载体等)
后共获得 34 438条无冗余的 EST, 序列总长度为
250.3 Mb。按照查找标准, 共发现 2 107条至少含
有1个SSR的EST序列, 占无冗余EST总数的6.12%,
表明甜瓜 EST中微卫星含量较为丰富。在 2 107
条 EST中, 含有单个 SSR的 EST为 1 458条, 含有
2个或 2个以上 SSR的EST为 649条, 其中还有 69
条序列出现两个 SSR串联。共检出 2 813个精确
重复的 SSR, 占无冗余 EST的 8.16%, 即甜瓜基因
组中 EST-SSR的出现频率。
甜瓜EST-SSR的优势重复基元为单、二和三
核苷酸, 三者共占 EST-SSR总数的 84.85%, 其中
又以三核苷酸重复所占的比例最大(47.14%), 二核
苷酸重复次之 ( 2 0 . 7 2 % ) , 单核苷酸重复最少
(16.99%)。基元长度大于等于 4的重复序列所占
的比例较小, 共计 15.15%。从 SSR的分布密度来
看, 甜瓜 EST中平均每 8.90 kb就出现 1个 SSR, 但
不同重复单元出现的平均距离各不一致, EST-SSR
出现的频率越高, 其平均距离越小(表 1)。甜瓜不
同组织中SSR的分布密度不尽相同, 韧皮部中SSR
密度最大(1/6.14 kb), 子叶次之(1/8.44 kb), 果实中
最少(1/10.53 kb)。
表 1 甜瓜中 EST-SSR的数量、比例和平均距离
Table 1 Number, percentage and mean distance of EST-SSRs
in melon
重复类型 数目 所占比例 出现频率 平均距离
/% /% 1) /kb 2)
单核苷酸 478 16.99 1.39 52.37
二核苷酸 583 20.72 1.69 42.94
三核苷酸 1326 47.14 3.85 18.88
四核苷酸 115 4.09 0.33 217.67
五核苷酸 180 6.40 0.52 139.07
六核苷酸 131 4.66 0.38 191.08
总计 2813 100.00 8.16 8.90
　　1) 出现频率 =检出的 SSR数目 /无冗余 EST总数;
　　2) 平均距离 =无冗余 EST总长度 /SSR总数。
2 甜瓜EST-SSR中基元类型及比例
在搜索到的2 813个甜瓜EST-SSR中共观察到
69种重复基元, 一至六核苷酸重复分别有 2、3、
10、14、22和 18种。不同类型的基元的出现频
率不一致, 存在明显的偏倚性。单核苷酸重复基元
中A/T占绝对优势, 所占比例为 16.25%, C/G极少
(18个, 占 0.64%); 二核苷酸重复基元中AG/CT比
例最高, 达 14.61%, AT次之(3.63%), AC/GT较少
(2.49%), 而 CG则没有出现; 三核苷酸重复基元中
AAG/TTC比例高达29.26%, 除CCG/CGG外(15个,
占0.53%), 其他各类三核苷酸重复基元的比例均在
1%~5%之间; 四核苷酸重复基元中比例最高的是
AAAG/CTTT (1.78%); 五核苷酸重复基元AAAAG/
CTTTT比例最高(2.13%); 六核苷酸中AAAAAG/
CTTTTT和 ACCACG/CTGGTG的比例分别为
0.64%和 0.60% (表 2)。
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表 2 甜瓜 EST中主要重复基元
Table 2 The major repeat motifs in melon ESTs
重复类型 重复基元 数量 所占比例 /% 出现频率 /%
单核苷酸 A/T 457 16.25 1.33
C/G 1 8 0.64 0.05
二核苷酸 AG/CT 411 14.61 1.19
AT/AT 102 3.63 0.30
AC/GT 7 0 2.49 0.20
三核苷酸 AAG/CTT 823 29.26 2.39
AGG/CCT 116 4.12 0.34
AAC/GTT 9 7 3.45 0.28
AGC/CGT 6 7 2.38 0.19
AGT/ATC 5 4 1.92 0.16
AAT/ATT 3 9 1.39 0.11
ACC/GGT 4 0 1.42 0.12
ACT/ATG 3 8 1.35 0.11
ACG/CTG 3 7 1.32 0.11
CCG/CGG 1 5 0.53 0.04
四核苷酸 AAAG/CTTT 5 0 1.78 0.15
AAAT/ATTT 3 0 1.07 0.09
AAGG/CCTT 1 0 0.36 0.03
AAAC/GTTT 6 0.21 0.02
AATG/ACTT 5 0.18 0.01
五核苷酸 AAAAG/CTTTT 6 0 2.13 0.17
AAAAT/ATTTT 1 7 0.60 0.05
AATAC/ATGTT 1 6 0.67 0.05
AAGAG/CTCTT 1 5 0.53 0.04
AAAAC/GTTTT 1 2 0.43 0.03
AAAGG/CCTTT 9 0.32 0.03
AACCT/ATTGG 9 0.32 0.03
AATCCAGGTT 8 0.28 0.02
AAACC/GGTTT 5 0.18 0.01
AATTC/AAGTT 5 0.18 0.01
六核苷酸 AAAAAG/CTTTTT 1 8 0.64 0.05
ACCACG/CTGGTG 1 7 0.60 0.05
AAGAGG/CCTTCT 1 0 0.36 0.03
AAAAAT/ATTTTT 7 0.25 0.02
AGGTAT/ATATCC 6 0.21 0.02
AACACG/CTTGTG 6 0.21 0.02
AAGATG/ACTTCT 5 0.18 0.01
AACCTC/AGTTGG 5 0.18 0.01
AAGACG/CTTCTG 5 0.18 0.01
　　出现频率小于 0 .0 1% 的重复基元未列出。
3 甜瓜EST-SSR重复次数和长度
SSR重复次数的变异引起位点长度的变化是
产生SSR多态性的主要原因。对2813个甜瓜EST-
SSR以及主要重复类型(二核苷酸和三核苷酸重复)
进行分类统计, 结果表明, 随着重复次数的增加, SSR
数量迅速减少(图 1)。甜瓜 EST-SSR按重复次数
可分为3个区间, 即4次至10次重复为第一个区间,
11次至 20次重复为第二区间, 20次重复以上为第
三区间。统计结果发现, 甜瓜 EST-SSR主要分布
在第一区间, 这一区间共有 1 978个微卫星, 约占
全部微卫星的70.32%, 一至六核苷酸重复基元均有
分布, 其中三核苷酸重复比例最大; 第二区间有437
个微卫星, 约占总数的 15.54%, 主要为二核苷酸和
三核苷酸重复; 第三区间有 398个微卫星, 主要是
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单核苷酸和部分二核苷酸重复, 占 14.15%。
重复基元长度变化是EST-SSR位点多态性的
主要表现形式。甜瓜 EST-SSR长度分布情况见图
2。由于搜索标准的严格度, 部分SSR被过滤掉(特
别是部分长度小于 20 bp的单核苷酸重复), 因此
EST-SSR长度分布是不连续的, 如长度为 13 bp、
17 bp和 19 bp的 SSR没有出现。总的来说, 大部
分甜瓜 EST-SSR长度集中在 12~20 bp范围内
(1 466个SSR, 占52.12%), 几乎全为二核苷酸和三
核苷酸重复; 其次是21~30 bp (920个SSR, 占32.71%),
这一区间三核苷酸所占比例最大; 30 bp以上的SSR
数量相对较少(427个 SSR, 占 15.18%), 主要由单
图 1 甜瓜 EST-SSR重复次数分布
Fig.1 Distribution of EST-SSR repeat numbers in melon
图 2 甜瓜 EST-SSR长度分布
Fig.2 Distribution of EST-SSR length in melon
核苷酸和三核苷酸重复组成。
讨　　论
公共数据库中数量不断增加的EST信息极大
地增强了 SSR标记的开发能力。国际葫芦科基因
组计划已全面启动, 甜瓜作为葫芦科研究作物之一,
已经产生 3万多条 EST序列, 这为 EST-SSR标记
的开发提供了宝贵的资源。但现已开发的甜瓜
EST-SSR标记引物却不足 30对(Danin-Poleg等
2001; Kong等 2007), 这与 EST数量极不相配, 因
此甜瓜 EST-SSR标记还有进一步开发的潜力。明
确甜瓜基因组中 EST-SSR的分布特征是开发新的
SSR标记的前提。本文发现, 甜瓜 EST-SSR基元
类型丰富、出现频率高、密度大, 平均距离仅为
8.17 kb, 高于拟南芥(14.9 kb)、小麦(15.6 kb)、棉
花(20.0 kb)和番茄(11.1 kb)等作物(李永强等2004),
这说明大规模开发 EST-SSR标记的可能性较大。
例如, 雷蒙德氏棉 EST中 SSR的平均距离是 14.8
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kb, 目前已从 58 906条非冗余雷蒙德氏棉 EST中
成功开发 1 554对 EST-SSR引物(王长彪等 2006)。
Kong等(2007)从 5747条甜瓜EST (2006年 7月 31
日前NCBI公布的数据)中发现了 383个 SSR位点,
主要是二核苷酸重复(49.9%)和三核苷酸重复(43.6%),
EST-SSR出现频率是 1/4.7 kb, 高于本研究结果
(1/14.8 kb), 这主要是由于搜索标准不同(最小重复
数为 5)所致。本文中甜瓜 EST-SSR中主要重复类
型为单、二和三核苷酸(约占总数的 85%), 这与大
多数植物中的报道相似(李永强等 2004; Kumpatla
和Mukhopadhyay 2005)。甜瓜 EST-SSR中出现频
率最高的基元是AAG/CTT (29.26%), 这与柑橘(14.2%)
(Jiang等 2006)、棉花(26.13%) (王长彪等 2006)和
拟南芥(29.00%) (Cardle等 2000)中的报道相似, 进
一步验证了Gao等(2003)认为AAG/TTC是双子叶
植物中优势重复基元的观点。甜瓜 EST中AAG/
TTC的高频率出现可能与其作为三联体密码编码
相应蛋白质时的高频率使用有关。
SSR位点多态性主要是因重复基元数量和基
元碱基数不同所产生的简单序列长度多态性和随机
扩增微卫星多态性。一般认为, SSR位点的变异频
率与基元重复数存在一定的正相关, 即重复次数越
多 SSR产生变异的可能性越大(Schlötterer 2000)。
而本文结果表明, 甜瓜 70.32%的 EST-SSR是低重
复数基元(4至10次重复), 只有29.68%的EST-SSR
重复数在 10以上。从这个角度讲, 本研究所发掘
的 EST-SSR中, 仅有少部分具有多态性潜能。而
Xu等(2000)认为微卫星变异依赖于等位基因的长
度, 等位基因的重复序列扩张和收缩的频率在总体
上是相等的, 即重复序列长度存在一个阈值, 长度
在阈值以下的SSR倾向扩张, 而长度在阈值以上的
SSR倾向收缩, 大多数真核生物阈值约为 20 bp。
甜瓜 EST-SSR中, 长度在 20 bp以下的占 42.48%,
长于 20 bp的占47.88%, 这些位点因未达到或超过
阈值长度而倾向于扩张或收缩。因此, 按照Xu等
(2000)观点, 我们所发掘的甜瓜EST-SSR位点大部
分具有多态性潜能。在Kong等(2007)所开发的 22
对甜瓜EST-SSR引物中, 约 1/4 SSR位点长度小于
或等于20 bp, 但在品种间均能表现出多态性, 充分
说明SSR多态性潜能与其长度(或重复次数)没有直
接关系。
由于 EST来源于编码区DNA, EST-SSR代表
了基因表达的信息, 能为功能基因提供 “绝对 ”标
记。此外, EST-SSR标记具有物种间通用性, EST-
SSR遗传作图将使物种之间连锁信息的转换更快,
实现多个图谱整合, 从而更有利于比较基因组学的
研究(Lan等 2000; Varshney等 2005b)。现在, 依
据本文结果所进行的甜瓜 EST-SSR引物大规模开
发, 已在本实验室全面展开。
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