全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 5期，2009年 5月 439
收稿 2008-11-20 修定 　2009-02-21
资助 国家重点基础研究发展计划( 9 7 3 计划)项目( 2 0 0 9 C B
118500)、国家自然科学基金(30571119和 30800071)
和教育部重点项目(108110 和 NCET-05 -0786)。
* 通讯作者(E-mail: honghuilin@vip.sina.com; Tel: 028-
8 5 4 1 5 3 8 9 )。
光下叶绿素缺乏的大麦突变体NYB中叶绿素合成再探
田文娟, 袁明, 陈洋尔, 张中伟, 徐飞, 袁澍, 林宏辉*
四川大学生命科学学院, 成都 610064
提要: 研究一种原叶绿素酯还原酶(POR)的大麦突变体NYB光下合成叶绿素的结果表明, NYB中PORB的含量比野生型低。
NYB前质体中原片层体的大小和数量与野生型差不多, 但其结构比野生型的松散。暗中生长的突变体内POR蛋白复合物
LHPP比野生型少。不同光照强度下叶绿素积累的结果显示, 光照度越强, 突变体与野生型的叶绿素差异越显著。由于porB
是单拷贝的, 所以推测突变体中部分porB mRNA可能产生错误的剪切拼接, 以致光下突变体NYB仍然能合成叶绿素。
关键词: 叶绿素; 黄化大麦; POR; LHPP
Further Study on Chlorophyll Synthesis of a Chlorophyll-Less Barley Mutant
NYB in Light
TIAN Wen-Juan, YUAN Ming, CHEN Yang-Er, ZHANG Zhong-Wei, XU Fei, YUAN Shu, LIN Hong-Hui*
College of Life Science, Sichuan University, Chengdu 610064, China
Abstract: The chlorophyll synthesis of a protochlorophyllide oxidoreductase (POR) in barley mutant NYB was
studied, and we found that the content of PORB was less in NYB than that in the wild type (WT). In the
etioplasts of NYB, prolamellar bodies had similar size and amount with WT, but had a more incompact structure.
The content of POR complex LHPP also was much less in the dark-grown mutant than that in WT. The data
about the accumulation of chlorophyll in different intensities of light demonstrated that the stronger the illumina-
tion was, the more prominent difference of chlorophylls between the mutant and WT was. As the porB gene is
a single copy, we extrapolated that probably partial porB mRNAs had wrong cutting and splicing, and therefore
the mutant NYB could synthesize chlorophyll in the light.
Key words: chlorophyll; yellowish barley; POR; LHPP
叶绿素合成的第一步依赖光的反应, 是将叶绿
素前体物质原脱植基叶绿素(pchlide)还原成脱植基
叶绿素(chlide), 催化这一步反应的关键酶是原叶绿
素酯还原酶(原脱植基叶绿素氧化还原酶, NADPH:
protochlorophyllide oxidoreductase, POR) (EC 1.33.
3.1)。POR广泛存在于上至陆地植物下至蓝细菌
的光合生物中, 只有具有最原始光合系统的厌氧光
合细菌不含 POR (Schoefs和 Franck 2003; Masuda
和 Takamiya 2004)。高等植物从种子刚刚发芽到
破土这一段时间约处于黄化状态, 不含叶绿素, 因
此无从进行光合作用。这种黑暗条件下, 在植物前
质体里的片层体内, 原脱植基叶绿素 a (Pchlide a)
和原脱植基叶绿素 b (Pchlide b)与NADPH以及两
种相关的POR蛋白PORA和PORB相结合形成一种
超分子复合体 LHPP。光照后, LHPP即有防止光
氧化的作用, 同时迅速解聚成 PORA 和 PO RB
(Reinbothe等 1999)。
大麦中POR蛋白有2种亚型。PORA和PORB
在黑暗中同时存在, 光照后 PORA迅速减少, 而
PORB保持稳定(Holtorf等 1995; Reinbothe等
1996)。所以, PORB在脱黄化过程中的植物幼苗
和光适应的成熟植物中都起作用, 而PORA只在黄
化幼苗的最初光照阶段起作用。
本文的材料为一种叶绿素缺失大麦(Hordeum
vulgare L.)突变体NYB, 是以 ‘早熟三号 ’野生型大
麦为原始材料, 经60Coγ射线辐射后诱变选育的单一
核基因控制的稳定突变体(Tan等 1997)。突变体
在表观上是严重缺绿, 叶片呈黄绿色(Lin等1999)。
Liu等(2008)确定其porB的ORF框中段插入了一个
95 bp的片段, 其中包含一个终止密码子。因此, 推
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测黄化大麦的PORB蛋白被截短, 活性会丧失。但
既然 PORB是光照下唯一存在的 POR蛋白, 那么
PORB失活突变体应该不能合成叶绿素而导致死
亡。但事实上是 NYB仍然正常生长和结实, 只是
叶绿素含量比野生型的小一半左右。
为了探讨其存活的原因, 我们对突变体中POR
蛋白、LHPP复合物、前质体结构和不同强度光
照下叶绿素的积累进行了研究。发现 NYB并不缺
失 PORB蛋白, 只是蛋白含量显著减少。考虑到
porB只有一个拷贝, 推测我们以前报道的存在插入
片段的 porB mRNA是错误拼接导致的。突变体中
可能仍保留部分正确拼接的 porB mRNA, 从而造
成 PORB部分失活。
材料与方法
大麦(Hordeum vulgare L.)叶绿素缺乏突变体
(NYB)和其野生型(WT)种子于 25 ℃浸种 1 d, 然后
置于 28 ℃培养箱中催芽 l d。选取萌发一致的种
子植入装有石英砂的白瓷盘中, 部分幼苗放在正常
培养条件[光照度 200 μmol·m-2·s-1, 12 h/12 h光暗周
期, (25±1) ℃]下生长至三叶期; 另一部分放在完全
黑暗条件下生长 7 d, 再进行 3 种 0 . 1、5 0 和
1 000 μmol·m-2·s-1光照强度处理。
叶中总蛋白按如下方法提取: 1 g叶子加入 5
mL提取缓冲液(4% SDS、6% β-琉基乙醇、50
mmol·L-1 Tris-HCl、4 mol·L-1尿素、10%甘油, pH
6.8), 置 80 ℃温浴中 40 min, 后以 500×g离心 5
min。按照 Lin等(1999)文中的方法提取前质体的
膜蛋白并进行温和电泳。总蛋白以及类囊体蛋白
的含量按照李妍等(2008)文中的方法测定。
相同含量的蛋白样品(20 μg)用 15%的丙烯酰
胺胶进行分离(PAGE), 分离胶含6 mol·L-1尿素。按
Liu等(2008)文中的方法进行Western杂交, 一抗为
POR和LHCII多克隆抗体(AgriSera公司, 瑞典), 二
抗为碱性磷酸酶偶联的山羊抗兔抗体(TaKaRa公
司 ) 。
叶绿素含量用Lichtenthaler和Wellburn (1983)
文中的方法测定。
黑暗中生长的叶片和见光7 h的叶片用3%戊
二醛和 0.1 mol·L-1二甲胂酸钠于 4 ℃下固定过夜,
然后按照Lin等(1999)文中的方法进行透射电镜(日
立公司 TEM 300)观察拍照。
叶中DNA按照Xi等(2007)文中的方法提取, 经
PstI、EcoRI、EcoRV、BamHI、NcoI和HindIII酶
切以后转移到尼龙膜上。探针为 porB基因片段,
用[α]-32P进行标记, 与上述酶切的DNA杂交后放
射性自显影在 X 光片上。
结果与讨论
1 转绿过程中的PORA和PORB在大麦叶中的表
达
野生型大麦及黄化突变体 NYB中 PORA和
PORB在转绿过程中的含量表达变化(图1)表明, 随
着光照时间的延长, 野生型和突变体中的PORA的
含量都逐渐降低直至完全消失, PORB含量基本上
不变。但野生型中的 PORB含量明显高于突变体
中的。另外, LHCII蛋白在野生型和突变体中都随
着光照时间的延长而逐渐合成和增加, 但突变体中
的 LHCII蛋白含量较野生型的明显要少。Liu等
(2008)发现突变体中LHCII种类较野生型并未减少,
图 1 黑暗转光照(48 h)对大麦野生型和NYB突变体中 POR和 LHCII蛋白含量的影响
Fig.1 Effect of dark-to-light transition on the protein contents of POR and LHCII in WT and NYB barley
WT: 野生型; NYB : 突变体。下图同此。
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LHCII蛋白在 NYB中含量低的原因可能是叶绿素
含量减少并导致色素结合蛋白的稳定性降低所致
(Liu等 2008)。
2 POR对大麦叶中原片层体形成的影响
未经光照的大麦叶绿体中的类囊体并不形成,
有人认为只有类囊体的前体——原片层体(prolamellar
bodies)存在。拟南芥的 porB突变体的原片层体比
野生型小很多(Frick等 2003; Masuda等 2003); 而
在大麦中, 我们观察到野生型和NYB突变体中的原
片层体的数量和外形以及大小都非常相似, 但从结
构上来说野生型的显得致密, NYB突变体的则要疏
松很多。黑暗中生长的苗转入光照下 7 h后, 野生
型和突变体中的原片层体都消失, 类囊体形成(图
2)。这说明 PORB对大麦原片层体的形成有一定
作用, 与拟南芥是类似的。
此外, 还要指出的是, 与原片层体的形成有关
图 2 黑暗和转光照(7 h)的大麦野生型和NYB幼苗质体的电镜观察
Fig.2 Observation of electron microscope on plastid ultrastructures WT and NYB barley seedlings
in dark-grown and dark-to-light
系的是一种由 Pchlide与NADPH以及两种POR蛋
白形成的一种超分子复合体——LHPP (Reinbothe
等 1999, 2004)。非变性电泳和Western分析的结
果(图3)显示, 黑暗下生长的野生型大麦和突变体中
的POR都是以LHPP复合体的形式存在, 而在见光
1 min后, LHPP迅速解聚, 产生游离的 PORA和
PORB。由于NYB突变体中的PORB含量比野生型
的少, 因此其形成的LHPP复合体也比野生型的少,
这可能就是 NYB突变体的原片层体与野生型大麦
的产生差别的原因。我们在大麦中观察到的结果
与Masuda等(2003)在拟南芥中观察到的有所不同,
这可能是由于拟南芥的 porB突变体中PORB蛋白
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几乎完全缺失, 而大麦NYB突变体中的PORB只发
生部分失活, 其中部分还存有活性的缘故。
图 4 不同光照强度对大麦野生型和NYB中叶绿素积累的影响
Fig.4 Effect of different light intensities on the accumulation of total chlorophylls in WT and NYB barley seedlings
3 光照强度对大麦叶绿素合成的影响
Masuda等(2003)报道, 高光强下(1 000 μmol·m-2·
s-1)的拟南芥porB突变体的叶绿素积累速率与野生
型差不多; 中等光强(50 μmol·m-2·s-1)下, porB突变
体的叶绿素积累速率比野生型低一些; 而低光强(0.1
μmol·m-2·s-1)下的这种差异更大。本文的结果(图
4)表明, 大麦与拟南芥相反: 高光强下突变体 NYB
叶绿素含量与野生型差异很大, 中等光强下略有差
异, 而在低光强下则无显著差异。这可能与 POR
蛋白的类型有关。拟南芥中除了光抑制的 PORA
和光稳定的 PORB之外, 还存在受光强烈诱导的
PORC亚型(Su等 2001; Frick等 2003)。
另据Masuda等(2003)拟南芥porB突变体中是
含有PORC的, 而在高光强下, 即使PORB缺失, 其
作用仍可以由PORC补充, 从而导致porB突变体和
野生型的叶绿素合成速率接近; 而在低光强下, 由
于PORC不可受诱导, porB突变体中又缺乏PORB,
所以它的叶绿素积累将大大受阻。但大麦并不含
有 PORC, 因此在高光强下 NYB突变体就因缺少
PORB而与野生型的叶绿素合成差异较大; 在低光
强下, NYB突变体中微量有活性的PORB则可以满
足缓慢的叶绿素合成, 所以叶绿素的合成速率与野
生型的差异不大。
4 大麦突变体NYB的 porB基因为单拷贝
我们对 NYB突变体的 porB 进行不同酶切,
Southern杂交后发现, NYB的porB基因只有一个拷
贝(图 5)。这就排除了光下NYB仍然能够合成叶绿
素的原因是porB存在2个或2个以上的拷贝, 只是
其中一个拷贝发生突变的可能。
综上所述, 有两个问题值得考虑: (1)鉴于porB
只有一个拷贝, 我们推测 porB基因转录生成的
mRNA在剪切、拼接时部分发生了错误, 致使一部
分生成的PORB蛋白失活。但剩余有活性的PORB
蛋白仍然能够维持一定的叶绿素合成。NYB的存
活机制还待进一步研究。(2)大麦很难通过转基因
的方法获得突变体, 所以大麦的单一位点突变体就
显得甚为珍贵。而叶绿素合成关键酶 POR的经典
模型是建立在大麦上的(Reinbothe等 1999, 2004),
探明黄化大麦 NYB的突变机制将会推进叶绿素合
图 3 黑暗和转光照(1 min)大麦野生型和NYB的 LHPP
复合物及 POR蛋白含量变化
Fig.3 Changes in LHPP complex and POR contents of WT
and NYB barley seedlings in dark-grown and dark-to-light
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成的研究。此外, NYB的镁原卟啉的含量很高, 是
研究叶绿体信号的好材料(Strand等 2003; Liu等
2008)。NYB具有高于野生型的叶绿素荧光和对水
分胁迫的抗性, 也是光合作用和非生物逆境研究的
好材料(刘文娟等 2007; Yuan等 2007)。对其突变
机制的深入了解将会有助于确定相关研究中实验材
料的遗传背景。
参考文献
李妍, 赵小英, 郭明, 李旭, 黄绿红, 唐冬英, 郭新红, 刘选明(2008).
GA2ox8基因过量表达诱导蓝光下拟南芥光形态建成. 植物
生理学通讯, 44(3): 421~425
刘文娟, 袁澍, 林宏辉 (2007). 高等植物光系统 II 蛋白磷酸化机
制及其对环境胁迫的响应. 植物生理学通讯, 43: 995~1001
Frick G, Su Q, Apel K, Armstrong GA (2003). An Arabidopsis porB
porC double mutant lacking light-dependent NADPH:
protochlorophyllide oxidoreductases B and C is highly chlo-
rophyll - deficient and developmentally arrested. Plant J,
35: 141~153
Holtorf H, Reinbothe S, Reinbothe C, Bereza B, Apel K (1995).
Two routes of chlorophyllide synthesis that are differen-
tially regulated by light in barley (Hordeum vulgare L.). Proc
Natl Acad Sci USA, 92: 3254~3258
Lichtenthaler HK, Wellburn AR (1983). Determinations of total
carotenoids and chlorophylls a and b of leaf extracts in
different solvents. Biochem Soc Trans, 11: 591~592
Lin HH, He JX, Liang HG, Du LF (1999). Qualitative and quanti-
tative differences in the light harvesting complexes of pho-
tosystem II (LHCII) between a chlorophyll-less barley mu-
tant “NYB” and its wild type. J Plant Physiol, 154: 152~156
Liu ZL, Yuan Sh, Liu WJ, Du JB, Tian WJ, Luo MH, Lin HH
(2008). Mutation mechanism of chlorophyll-less barley
mutant NYB. Photosynthetica, 46: 73~78
Masuda T, Fusada N, Oosawa N, Takamatsu K, Yamamoto YY,
Ohto M, Nakamura K, Goto K, Shibata D, Shirano Y et al
(2 003 ). Fu nct ional analysi s of isoforms of NADPH:
protochlorophyllide oxidoreductase (POR), PORB and
PORC, in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol, 44:
963~974
Ma su da T , Ta ka miya K (2 00 4) . Novel insight s in to the
enzymology, regulation and physiological functions of light-
dependent protochlorophyllide oxidoreductase in angiosperms.
Photosynth Res, 81: 1~29
Reinbothe C, Lebedev N, Reinbothe S (1999). A protochlor-
ophyllide light-harvesting complex involved in de-etiola-
tion of higher plants. Nature, 397: 80~84
Reinbothe C, Pollmann S, Desvignes C, Weigele M, Beck E,
Reinbothe S (2004). LHPP, the light-harvesting NADPH:
protochlorophyllide (Pchlide) oxidoreductase: Pchlide com-
plex of etiolated plants, is developmentally expressed across
the barley leaf gradient. Plant Sci, 167: 1027~1041
Reinbothe S, Reinbothe C, Lebedev N, Apel K (1996). PORA and
PORB, two light-dependent protochlorophyllide-reducing
enzymes of angiosperm chlorophyll biosynthesis. Plant Cell,
8: 763~769
Schoefs B, Franck F (2003). Protochlorophyllide reduction:
mechanisms and evolution. Photochem Photobiol, 78:
543~557
Strand A, Asami T, Alonso J, Ecker JR, Chory J (2003). Chloro-
plast to nucleus communication triggered by accumulation
of Mg-protoporphyrin IX. Nature 421: 79~83
Su QX, Frick G, Armstrong G, Apel K (2001). PORC of Arabidopsis
th a l ia n a : a th i rd l ight - a nd N AD PH - dependent
protochlorophyllide oxidoreductase that is differentially regu-
lated by light. Plant Mol Biol, 47: 805~813
Tan XX, Xu DQ, Tang ZS (1997). A cause of higher photochemi-
cal efficiency of photosystem II in a chlorophyll-deficient
barley mutant. Acta Phytophysiol Sin, 23: 251~256
Xi DH, Feng H, Lan LQ, Du JB, Wang JH, Zhang ZW, Xue LW,
Xu WL, Lin HH (2007). Characterization of synergy be-
tween Cucumber mosaic virus and Tobacco necrosis virus in
Nicotiana benthamiana. J Phytopathol, 155: 570~573
Yuan S, Liu ZL, Liu WJ, Lei T, Luo MH, Du JB, Wang JH, Lin HH
(2007). A chlorophyll-less barley mutant “NYB” is insensi-
tive to water stress. Z Naturforsch, 62c: 403~409
图 5 大麦突变体NYB中 porB基因的 Southern杂交分析
Fig.5 Southern blot analysis of porB gene
in barley mutant NYB