全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (10): 1523~1528　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0323 1523
收稿 2014-07-08　　修定 2014-09-02
资助 “十二五”国家科技支撑项目(2012BAD21B03)。
* 通讯作者(E-mail: wangjh@caf.ac.cn; Tel: 010-62888539)。
黄金树花器官特征决定的CaspAG基因克隆和表达分析
夏燕, 景丹龙, 王军辉*
中国林业科学研究院林业研究所, 国家林业局林木培育重点实验室, 国家林木种质资源平台, 北京100091
摘要: 以黄金树的花芽为材料, 采用同源基因克隆技术, 获得黄金树花器官特征决定的AG同源基因, 将其命名为CaspAG,
其开放阅读框(ORF)为738 bp, 编码245个氨基酸。分子系统发生和蛋白序列比对分析表明: CaspAG是拟南芥的AG同源蛋
白, 被归为euAG进化分支, 其MADS区有57个氨基酸, I区有32个氨基酸, K区有83个氨基酸, C区有55个氨基酸, 其中C末端
的转录激活区含有两个保守的基序: AGI和AGII基序。半定量RT-PCR分析表明, 在花发育过程中, CaspAG基因仅在雄蕊和
雌蕊中表达, 而在茎、叶片、萼片和花瓣中几乎不表达。实时荧光定量PCR分析结果表明, CaspAG基因在雌雄蕊原基分化
期至雌雄蕊成熟期均有表达, 在雌雄蕊发育成熟期表达量达到最高; 且在雄蕊的表达高峰的时间明显早于雌蕊, 这与雌、
雄蕊形态成熟的时间基本吻合。
关键词: 黄金树; 花发育; AGAMOUS同源基因; 实时荧光定量PCR
Cloning and Expression Analysis of an AGAMOUS-Like Gene (CaspAG) from
Catalpa speciosa
XIA Yan, JING Dan-Long, WANG Jun-Hui*
Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation, State Forestry Administration, China Forest Genetic Resource, Research Institute
of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China
Abstract: A MADS-box gene CaspAG involved in flower development was isolated from the flower bud of
Catalpa speciosa via homology cloning technique. The open reading frame (ORF) of CaspAG was 738 bp,
which encoded 245 amino acid. Protein sequence alignment and molecular phylogeny analysis suggested that
CaspAG was an AG homology in Arabidopsis, grouped with euAG clade. Conceptual translation revealed that
the MADS domain contained 57 amino acid, the I domain contained 32 amino acid, the K domain contained 83
amino acid, the C domain contained 55 amino acid. Moreover, two highly conserved motifs specific to C pro-
teins, AG motifs I and II, were found in the C-terminal regions of the CaspAG protein. Semi-quantitative RT-
PCR analysis showed CaspAG transcriptional activity mainly concentrated on stamens and carpels while no-ex-
pression in plant stem, leaves, sepals and petals during different stages of flower development. The qRT-PCR
analysis showed that the expression of CaspAG was detected at the primordium to mature stages of stamen and
pistil during morphological differentiation of organs. The expression was highest at the mature stages of stamen
and pistil during morphological differentiation of organs. The date of expression peak appeared in stamens ear-
lier than that in pistils, and the time of expression was the same with morphological differentiation of the sta-
men and pistil.
Key words: Catalpa speciosa; flower development; AGAMOUS-like gene; qRT-PCR
黄金树(Catalpa speciosa)为紫葳科(Bignoniace-
ae)梓树属高大落叶乔木, 原产于美国的中东部地区,
20世纪初引种我国, 因其树型高大, 叶片秋天呈金
黄色, 美丽壮观, 在我国的北京等各地常作为庭园
观赏树种植(陈晓2002)。目前, 有关黄金树的报道,
主要集中在育苗(盛淑艳等2005)、园林栽培(李发
兵和香玉萍2010)、花器官形态发育的描述(陈旭辉
等2009)及有性生殖的细胞学观察(李利平等2013)等
方面, 但对其花器官的分子调控机理仍缺乏研究。
AGAMOUS (AG)同源基因是调控被子植物雌
雄蕊发育的关键转录因子, 属于C类MADS-box基
因, 在花发育过程中决定花分生组织的形成, 参与
控制雄蕊和心皮的发育, 并抑制A类基因活性(Coen
和Meyerowitz 1991; Weigel和Meyerowitz 1994;
植物生理学报1524
Krizek和Fletcher 2005)。花是被子植物特有的创
新性状和最具观赏价值的器官, 其丰富多变的外形,
使其成为研究被子植物器官形态建成和组织发育
模式的理想材料(Krizek和Fletcher 2005), 因此对调
控花发育的基因进行研究具有重要的学术意义。
目前, 有关AG同源基因参与调控模式植物、重要花
卉和农作物花器官形态建成的分子机制已有广泛
的研究(Coen和Meyerowitz 1991; Immink等2010),
但其调控木本植物花发育方面的研究少见报道。
本研究采用逆转录RT-PCR和同源克隆技术获
得了调控黄金树雌雄发育的AG同源基因(CaspAG)。
利用半定量PCR (semi-quantitative RT-PCR)和荧光定
量PCR技术(qRT-PCR)技术, 检测了CaspAG基因在黄
金树花芽形态分化和发育关键时期表达的组织特异
性和表达水平的变化, 进而推测该基因在黄金树花
发育雌雄蕊形态建成中的作用。
材料与方法
1 材料
黄金树(Catalpa speciosa Ward.)的花芽采自
4~5月北京林业大学校园, 所采的不同花芽长度见
表1, 对所采集花芽进行形态学观察(固定液为
FAA, 使用徕卡RM2016切片机, 切片厚片6 μm, 固
绿染色后在Leica DM6000B显微镜下镜检、拍照;
并使用Leica M205 FA和尼康S9100进行形态拍照
记录) (图1)。同时, 采集的不同长度花芽先放入液
氮中保存, 然后置于–86 ℃冰箱中, 保存备用。
2 方法
2.1 黄金树的AG同源基因全长cDNA序列的克隆
根据NCBI上黄金树近缘AG同源基因5′和3′非
翻译区(untranslated region, UTR)的保计序列, 用软
件Oligo 6分别在5′-UTR和3′-UTR设计黄金树AG同
源基因全长上下游引物FLAGF和FLAGR (表2)。
使用EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂
盒(Aidlab, 中国), 提取黄金树13 mm花芽的总
RNA, 用DNase I (TaKaRa, 日本) 37 ℃反应30 min,
去除RNA中混有的DNA, 使用M-MLV反转录酶
(TaKaRa, 日本)逆转录成cDNA。PCR反应程序为:
94 ℃预变性5 min; 94 ℃ 45 s, 57 ℃ 45 s, 72 ℃ 45 s,
30个循环; 72 ℃延伸10 min。反应结束后, 进行琼
脂糖凝胶电泳检测, 回收, 连接到pMD18-T载体
(TaKaRa, 日本), 转入大肠杆菌top10感受态细胞,
摇菌, 测序(华大基因)。
表1 采集的黄金树的花芽长度(平均值±标准误)
Table 1 The acquisition size of the flower buds of C. speciosa
序号 花芽长度/mm
S1 1.12±0.01
S2 2.22±0.02
S3 3.13±0.03
S4 4.24±0.03
S5 5.33±0.04
S6 13.39±0.04
S7 30.25±0.06
S8 55.24±0.09

图1 黄金树花器官形态学和切片观察
Fig.1 The characterization of the floral organ in C. speciosa
A、B: 1 mm花芽和刚分化出的雄蕊(S1); C、D: 2 mm的花芽和雌蕊原基(箭头所示) (S2); E、F: 3 mm的花芽和刚分化的雌蕊(S3); G:
4 mm花芽(S4); H: 5 mm花芽(S5); I: 13 mm花芽(S6); J: 开花期30 mm花芽(S7); K: 开花期55 mm花芽(S8)。A、C、E、G、H: 标尺为1 mm;
B、D、F: 标尺为500 μm。
夏燕等: 黄金树花器官特征决定的CaspAG基因克隆和表达分析 1525
2.2 蛋白质序列比对及分子系统发生分析
将黄金树AG同源基因开放阅读框(open read-
ing frame, ORF)编码的氨基酸序列进行BLAST分
析。用Clustal W程序(Thompson等1994)将推导的
氨基酸序列同NCBI上C类同源基因蛋白序列进行
多重比较, 选择连接近邻算法NJ (Neighbour join-
ing)构建系统进化树(Saitou和Nei 1987)。
2.3 黄金树的AG同源基因表达的组织特异性
提取黄金树的茎、幼叶、13 mm长花芽(萼
片、花瓣、雄蕊和雌蕊)的总RNA, 去除总RNA样
品中微量的DNA。第一链cDNA的合成方法同上,
半定量实验使用引物为RTactinF和RTactinR、
RTAGF和RTAGR。PCR反应使用高保真Ex-Taq
DNA聚合酶(TaKaRa, 日本), 程序为: 94 ℃预变性
5 min; 94 ℃ 45 s, 57 ℃ 45 s, 72 ℃ 45 s, 25个循环;
72 ℃延伸10 min。每个植物组织设3个生物学重
复, 且每个cDNA样品设3个重复。反应结束后, 进
行琼脂糖凝胶电泳检测。
2.4 黄金树的AG同源基因在花发育不同时期雌雄
蕊中的表达量检测
用试剂盒分别提取黄金树不同大小花芽雌蕊
和雄蕊的总RNA, 每个长度阶段的花芽设3个生物
学重复, 用DNase I反应30 min, 消化DNA, 之后用
M-MLV反转录酶反转录成cDNA。实时半定量实
验使用引物为qRTactinF和qRTactinR、qRTAGF和
qRTAGR。利用凯杰Rotor-gene-Q Real-time PCR
Detection System [参考SYBR Green qPCR Mix
(KAPA, 美国)试剂盒说明书], 采用三步法进行Re-
al-time PCR扩增, 每个反应重复3次。PCR反应程
序为: 94 ℃预变性3 min; 94 ℃ 20 s, 55 ℃ 20 s, 72
℃ 20 s, 40个循环; 之后温度降至60 ℃预溶解90 s,
然后以1.0 ℃·s-1升至95 ℃, 每升1.0 ℃后, 保持5 s。
根据得到的CT值, 利用Livak和Schmittgen
(2001)报道的2-∆∆CT方法, 分别计算CaspAG基因在
花分化时期的混合花芽、花芽成熟期雌蕊和雄蕊
中的表达量。在研究不同时期CaspAG基因的相对
表达量时, 将该基因在4 mm花芽雄蕊中的表达量
设为对照 , 其他时期设为不同处理。利用公式:
∆∆CT=(CTTarget–CTActin)处理–(CTTarget–CTActin)对照, 分别计
算其他不同时期黄金树雌、雄蕊中CaspAG基因的
2-∆∆CT值。以上数据均使用Rotor-gene Q series soft-
ware (Qiagen)软件进行分析。
实验结果
1 黄金树AGAMOUS同源基因全长cDNA序列克隆
利用同源基因克隆技术获得黄金树AG同源
基因全长cDNA序列, 结果表明: 其开放阅读框
(ORF)为738 bp, 编码245个氨基酸和1个终止密码
子。通过NCBI网站的BLAST比对及序列分析, 它
与MADS-box基因家族中euAG进化分支基因的同
源性最高, 命名为CaspAG, 在NCBI上的基因登录
序列号: KM095648。
2 蛋白质序列比对及分子系统发生分析
蛋白质序列同源比对发现, CaspAG属于C类
MADS-box基因家族成员, 具有一个高度保守的
MADS结构域, 一个次级保守的K区, 一个保守性
较低的I区。其M区有57个氨基酸, I区有32个氨基
酸, K区有83个氨基酸, C区有55个氨基酸, 其中C
末端的转录激活区含有两个保守的基元: AGI和
AGII基元(图2)。分子系统发生分析表明, 黄金树
CaspAG同13种被子植物的AG同源蛋白共同聚于
C类基因的euAG进化分支(图3)。
3 不同组织CaspAG表达的组织特异性
用半定量RT-PCR技术检测CaspAG在黄金树
的茎、幼叶、萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊6种组织
中表达的组织特异性, 以黄金树的Actin基因作内
参(图4)。结果显示, CaspAG在黄金树雌雄蕊中均
有表达, 在茎、叶片、萼片和花瓣中不表达。
4 黄金树CaspAG基因在雌、雄蕊发育过程中的表
达变化
利用qRT-PCR技术分析CaspAG基因在黄金树
雌、雄蕊花原基分化时期以及雌雄蕊成熟期不同
阶段表达量的变化规律(图5)。在花原基早期分化
表2 引物序列
Table 2 The sequences of primers
引物名称 引物序列(5′→3′)
FLAGF CCTTCAACTCCTACTTATTACCA
FLAGR CCATTCTGCTCGTTCTTACTTAT
RTAGF CCAAGTTACCTTCTGCAAAC
RTAGR GGTGTAAGTCAATCTCCTGC
qRTAGF CTTAATCGTCTTCTCCACCA
qRTAGR TGTTCCTGTTCTGATTCTGC
RTactinF ATGATGCTCCAAGAGCTGTG
RTactinR AGCAAGATCGAGACGTAGGA
qRTactinF GATGATGCTCCAAGAGCTGT
qRTactinR TCCATATCATCCCAGTTGCT

植物生理学报1526
阶段(表1-S1~S3时期和图1-A~F), CaspAG基因表
达量较高, 之后随着生长的减慢开始下降, 并趋于
平缓(图5-A)。在开花阶段(表1-S3~S8和图1-E~K),
雌雄蕊在短期内迅速发育 , 此时雌雄蕊中的
CaspAG基因表达量开始上升 , 并达到最高(图
5-B)。从花发育过程的表达趋势来看, 雄蕊的表达
高峰出现的时间明显早于雌蕊, 其表达高峰出现
的时间与花芽发育成熟过程中, 雌雄蕊形态成熟
的时间基本吻合。
讨　　论
本研究结果表明 , C a s p A G基因属于C类
MADS-box基因家族, 其蛋白序列聚类于euAG分
支, 其C末端有2个高度保守euAG型蛋白基序: AG
motif I和AG motif II (Kramer等2004)。这2个基序
在AG同源基因的转录激活和功能特化方面起重要
作用(Egea-Cortines等1999; Honma和Goto 2001;
Lamb和Irish 2003)。分子系统发生分析表明, 黄金
树CaspAG同13种被子植物的AG同源蛋白共同聚
于C类基因的euAG进化分支。物种间亲缘关系越
近, 序列同源性越高。本研究发现, 黄金树、黄瓜
和陆地棉的AG同源蛋白聚类较近, 即同亚科植物
AG同源蛋白聚类较近, 与传统分类学所得的结果
完全吻合。同时, 樱、桃、苹果、梅、太行花、
黑樱桃和玫瑰共7种蔷薇科植物的AG同源蛋白共
同聚于同一个小分支, 再次支持了本进化树的聚
类合理性。类似的结果也在P L E同源蛋白和
AGL11同源蛋白聚类中得到很好的支持(图3)。
在黄金树的花发育过程中, CaspAG基因仅在
雌蕊和雄蕊中表达, 在茎、幼叶、萼片和花瓣中不
表达。在拟南芥中, AG基因是参与调控雌雄蕊发
育的重要C类MADS-box基因, 并抑制A类基因的
活性(Zahn等2006; Krizek和Fletcher 2005; Conner和
Liu 2000)。在矮牵牛中, 其AG同源基因pMADS3主
要在发育的雄蕊和雌蕊中表达, 参与决定雄蕊和心
皮的特征(Tsuchimoto等1993)。而在原始的基部被
子植物红花玉兰中, 其AG同源基因MwAG也仅在
雌雄蕊中表达(Wu等2012)。本研究中 , 黄金树
CaspAG基因表达的组织特异性与模式植物拟南
芥、以及非模式植物如红花玉兰、玫瑰和樱花的
AG同源基因的表达模式相同。以上的研究结果表
明, 核心真双子叶植物不同类型的AG同源基因在
表达的组织特异性上具有高度的保守性。
在黄金树的花发育过程中, 花芽的分化、生
长发育与CaspAG基因的表达量高低密切相关。
CaspAG基因在黄金树花发育的整个时期均有表
达, 尤其是在雌雄蕊发育成熟期表达量达到最高,
这是因为在开花期, 随着花芽的迅速伸长, 该基因
图2 CaspAG基因编码的氨基酸序列与AG亚家族相关蛋白的比较
Fig.2 Comparison of deduced amino acid sequence encoded by CaspAG and related members of the AG subfamily
氨基酸的位置在右侧标注。比对中的第一个下划线区域表示M区, 第二个下划线表示K区, 在M区和K区之间的是I区, AGI基序和
AGII基序用黑框标出。
夏燕等: 黄金树花器官特征决定的CaspAG基因克隆和表达分析 1527
图4 黄金树不同组织中CaspAG基因的半定量RT-PCR分析
Fig.4 Semi-quantitative PCR of CaspAG gene in different
tissues of C. speciosa
图3 AG亚家族基因分子系统发生分析
Fig.3 Phylogenetic analysis of AG subfamily
的表达量相应达到最高。在对黄金树的胚胎学特
征的显微观察发现, 雄蕊先于雌蕊发育, 并在大孢
子母细胞进行减数分裂后趋于同步 (李利平等
2013)。CaspAG基因的表达变化与雌、雄蕊形态
发育成熟的时间基本吻合。在其他相关研究中,
拟南芥的AG基因的表达除了调控雌雄蕊的发育,
还影响开花时间(Hu等2014), 同时雄蕊和雌蕊器官
的发育对AG表达量的需求不同(Sieburth等1995;
丁一和徐启江2014)。唐松草ThtAG1基因的表达
减弱, 会导致其雌蕊同源异型转变为萼片状的器
官(Galimba等2012)。而红花玉兰MwAG基因的表
达量在其花芽不同发育时期, 差异也很大, 但其表
达量在花芽分化初期达到最高(景丹龙等2013)。
有关CaspAG基因如何参与黄金树花器官形态建
成, 仍有待进一步研究。
植物生理学报1528
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图5 黄金树CaspAG基因在花芽不同生长时期的表达量
Fig.5 CaspAG expression in floral buds of C. speciosa at different developmental stages