全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (7): 1009~1013　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0044 1009
收稿 2014-02-12　　修定 2014-04-23
资助 河南省科技发展计划项目(12300410042)。
* 通讯作者(E-mail: lidahong27@163.com; Tel: 15036913921)。
转拟南芥P5CS1基因增强羽衣甘蓝的耐旱性
李鸿雁, 李大红*
黄淮学院生物工程系, 河南驻马店463000
摘要: 为提高羽衣甘蓝的耐旱性, 本文将拟南芥Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS1)基因经农杆菌介导转入羽衣甘蓝植株中,
检测转基因株系与野生型植株在干旱胁迫下P5CS1 mRNA表达量、幼苗脯氨酸含量、株系根系性状、整株干重、鲜重和
整株存活率。结果表明, 在15% PEG6000渗透胁迫下, 转基因植株的P5CS1基因mRNA表达量明显增加, 转基因植株脯氨酸
含量是野生型的2.4倍; 主根长、最长侧根长、侧根数目、整株干重和鲜重均高于野生型, 干重/鲜重则低于野生型, 转基因
植株的平均存活率为78%, 极显著高于野生型。数据显示, AtP5CS1基因在羽衣甘蓝中的表达明显改善了转基因植株的耐
旱性。
关键词: Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS); 羽衣甘蓝; 脯氨酸; 耐旱性
Expression of AtP5CS1 Gene Enhanced Drought Tolerance of Transgenic Brassica
oleracea Plants
LI Hong-Yan, LI Da-Hong*
Department of Bioengineering, Huanghuai University, Zhumadian, Henan 463000, China
Abstract: To increase drought tolerance in Brassica oleracea, Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS)
cDNA from Arabidopsis thaliana was transferred to B. oleracea plants mediated by agrobacterium, the P5CS1
mRNA expression, proline content, root traits, dry weight, fresh weight and whole plant survival rate of trans-
genic lines and wild type plants under drought stress were detected. The results showed that under 15%
PEG6000 osmotic stress, the expression of P5CS1 mRNA was significantly increased. The proline content of
transgenic plants was 2.4 times that of the wild type. The length of taproot, lateral root length, lateral root num-
ber, the fresh weight and dry weight of whole plant were higher than those of the wild type, and the dry weight/
fresh weight was lower than those of the wild type. The average survival of transgenic plants was 78%, signifi-
cantly higher than that of wide type. These data showed AtP5CS1 gene expression in B. oleracea significantly
improved drought tolerance of transgenic plants.
Key words: P5CS; Brassica oleracea; proline; drought tolerance
作物在干旱或盐的渗透胁迫影响下, 生长受
到抑制, 产量将有所下降。有学者认为植物的抗
逆机制可能是植物产生了一些低分子量渗透调节
物质, 如脯氨酸(proline)和甘氨酸等(Greenway和
Munns 1980)。脯氨酸在渗透平衡中起着重要的调
节作用, 对细胞的膨压增加有保护作用(Kumar等
2010)。Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(Δ1-pyrroline-5-car-
boxylate synthetase)是脯氨酸合成限速酶。目前有
几种植物已分离出P5CS基因, 最早是从豇豆(Vigna
unguiculata)植物克隆出P5CS基因。但在某些物种
中, P5CS基因往往不止一种, 他们功能也不相同
(Strizhov等1997)。例如, 在拟南芥中, AtP5CS1是受
干旱、盐和ABA等诱导表达, 而AtP5CS2是看家基因
(Fabro等2004); 然而, 甘蓝型油菜中, 无论BnP5CS1
和BnP5CS2都可能是通过ABA、NaCl和PEG诱导
增加表达(Xue等2009)。在高等植物中, 脯氨酸的
积累可能是合成增加或分解减少。但如果增加
P5CS的酶活性, 脯氨酸生物合成会增加, 从而增加
植物的耐渗透性(Yamchi等2007)。在植物中转入
P5CS基因, 也可能增加脯氨酸的表达, 如Kishor等
(1995)在转基因烟草中过表达VaP5CS, 干旱胁迫下
与非转基因亲本相比, 脯氨酸大量积累, 生物量也
增加。在马铃薯、水稻和小麦等植物中也有类似
研究(Hmida-Sayari等2005; Anoop和Gupta 2003; Su
和Wu 2004; Vendruscolo等2007)。
植物生理学报1010
羽衣甘蓝为十字花科芸苔属的1个变种, 1~2
年生草本植物。原产于地中海和小亚细亚地区, 栽
培历史悠久。现在欧洲和美国等国家广泛种植。
羽衣甘蓝有多个不同品种, 其叶形态多样, 丰富多
彩, 叶色丰富, 全株形如牡丹, 也有食用羽衣甘蓝
(赵华渊和李莹莹2011)。
本文研究把拟南芥的AtP5CS1导入羽衣甘蓝
基因中, 检测转基因植株的根系性状、脯氨酸含
量及存活率, 研究转基因植株的耐旱能力, 以获得
抗旱较强的羽衣甘蓝品种, 为羽衣甘蓝育种和栽
培提供新品种和理论依据。
材料与方法
植物材料以羽衣甘蓝‘名古屋’ (Brassica oler-
acea L. var acephala DC. f. tricolor Hort.)品种作为
受体材料, 大肠杆菌DH5α为受体菌, 介导根癌农
杆菌为LBA4404, 表达载体pCAMBAI1301。带有
AtP5CS1基因的质粒pMD-T-P5CS由黄淮学院实验
室保存; DNA聚合酶和限制性内切酶购于大连宝
生物公司; DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒
购于上海捷瑞生物公司, DIG试剂盒购自Roch公
司。其他试剂采用国产或进口分析纯。
由引物P1 (5 cggatccAAACTATGACGGAGAT-
CG 3)和P2 (5 cgagctcTGGTACAAACCTCAAGGA 3)
从质粒pMD-T-P5CS克隆出P5CS1基因, 并与载体
pMD18-T质粒连接, 转化大肠杆菌后挑选培养基
上的白色菌落进行PCR, 阳性的菌落送上海捷瑞公
司测序。用BamHI和SacI分别酶切表达载体和克
隆载体, 回收后把目的基因与表达载体3:1用T4连
接酶连接后转化大肠杆菌, 卡拉霉素筛选, 挑取单
克隆PCR鉴定, 阳性菌落37 ℃扩大培养12 h, 按质
粒提取试剂盒说明提取质粒, 用紫外分光光度计
测定浓度后用于转化农杆菌, PCR鉴定正确后4 ℃
保存。
羽衣甘蓝遗传转化用无菌羽衣甘蓝苗的下胚
轴作为转化材料, 接种到预培养基(MS+2.0 mg·L-1
2,4-D+0.2 mg·L-1 6-BA)中, 经过2 d (光照强度25
μmol·m-2·s-1, 16 h光/8 h暗)预培养, 将处理过的下胚
轴用OD600值为0.5的农杆菌浸染5 min, 取出后用无
菌吸水纸吸干, 然后在再生培养基(MS+0.1 mg·L-1
NAA+25 mg·L-1 6-BA)中共培养2 d, 后转入选择培
养基(再生培养基+300 mg·L-1潮霉素+15 mg·L-1 卡
那霉素)培养, 每2周继代1 次, 1个月后, 将幼苗转
入生根培养基(1/2MS+0.1 mg·L-1 NAA+150 mg·L-1
潮霉素+25 mg·L-1卡那霉素)中生根培养。当根长
到3 cm左右时, 炼苗移栽。
转基因羽衣甘蓝与对照基因组DNA提取参照
Murray和Thompson (1980)的CTAB法。以P1和P2为
引物, 羽衣甘蓝基因组DNA为模板, 对转基因和对
照植株的基因组DNA进行PCR分析。以PCR扩增
为阳性的DNA为模板进行Southern blot检测, 参考
萨姆布鲁克等(2002)方法进行。
随机挑取PCR阳性及Southern blot单拷贝的T1
代羽衣甘蓝种子(4个株系, 经潮霉素浸种)筛选, 待
羽衣甘蓝胚根长2~5 mm时, 每株系3组, 每组选取
20粒发芽正常、胚根整齐一致的种子, 转移至10
mL 15% PEG6000培养瓶中, 对照用等量蒸馏水。
培养箱中光照培养。培养条件为温度24 ℃, 湿度
80%, 光照强度100 μmol·m-2·s-1, 16 h光照/8 h黑暗。
处理5 d后, 用异硫酸胍法提取T1代叶片内总RNA,
进行RT-PCR, 以actin (GenBank登录号AF111812.1)
的表达作为内参, 方法参照文献进行(Li等2009)。
测定所有单株的主根长、最长侧根长、侧根
数、根干重/鲜重(DW/FW)、整株干重和鲜重, 并
计算存活率。试验重复3次。
脯氨酸含量的测定参照陈建勋和王晓峰(2006)
的方法。
数据统计与方差分析用Excel和SPSS 17.0。
实验结果
1 转基因羽衣甘蓝的PCR检测
对获得的转基因羽衣甘蓝经潮霉素抗性筛选
的8株转基因苗进行PCR检测, 均为转基因阳性株
(图1)。
2 转基因植株Southern blot检测
提取抗潮霉素的抗性植株叶片的总DNA。利
用潮霉素基因作为杂交探针 , 用EcoRI消化总
DNA。结果(图2)表明, 空白对照和阴性对照植株
无杂交条带, 而转基因植株PCR阳性植株都出现了
杂交条带, 而且大多数是单拷贝的, 部分是多个拷
贝。由此确定P5CS1基因确实整合进羽衣甘蓝基
因组中。
3 转基因植株RT-PCR检测
选用actin作为内参, 从图3可以看出, P5CS1基
李鸿雁等: 转拟南芥P5CS1基因增强羽衣甘蓝的耐旱性 1011
图1 转基因植株PCR检测
Fig.1 PCR analysis of transgenic plants
M: 2000 DNA marker; 1~8: 转基因植株; CK: 空白对照(野生
型); NON-T: 阴性对照(空载体)。
图2 转基因植株Southern blot检测
Fig.2 Southern blot analysis of transgenic plants
CK: 空白对照(野生型); NON-T: 阴性对照(空载体); 1~8: 转基
因株系。
图3 P5CS1基因表达的RT-PCR检测
Fig.3 P5CS1 gene expression by RT-PCR
CK: 野生型; NON-T: 阴性对照; Y1~Y4: 转基因株系。
因的mRNA表达水平在Y2和Y3株系中表达较高,
Y1和Y4株系中表达稍低, 对照没有表达。这表明,
转P5CS1基因在羽衣甘蓝中过表达, 株系之间的表
达有差异。
4 转基因植株耐旱性分析
4.1 在干旱胁迫下转基因植株的性状
PEG6000处理后, 对照与转基因株系生长均
受到不同程度的抑制, 不同株系之间有很大差异
(图4)。与野生型相比, 转基因P5CS1表达量高的株
系Y2和Y3主根长度较长, 其中Y3比野生型的主根
长43%, 最长侧根长27%, 侧根数目多60.5%, 根干
重/鲜重降低6.05%, 植株干重增强59.1%, 植株鲜重
图4 在干旱胁迫下转基因植株的性状
Fig.4 Traits of transgenic plants under drought stress
图中数据为means±SD; CK: 空白对照(野生型); NON-T: 阴性对照(空载体); Y1~Y4: 转基因株系。下图同此。
植物生理学报1012
增加63.7%, 株系Y3与野生型的各性状有显著差异
(P<0.05)。而Y1和Y4的各指标与野生型有差异,
但没有达到显著程度。P5CS1的表达量较高的植
株生长状态较好, 但各株系表现有差异。
4.2 干旱胁迫下转基因植株脯氨酸含量及存活率
干旱胁迫下, 转基因株系Y3的脯氨酸含量是
野生型的240%; 存活率为53.3%, 远高于对照的
27.6%, 两者有极显著差异(P<0.01) (图5)。Y2与
Y3类似, 但Y1和Y4与野生型差异不显著(P<0.05)。
这说明转基因植株有明显的耐旱性, 但株系之间
有差异。
图5 在干旱胁迫下转基因植株的存活率及脯氨酸含量
Fig.5 Survival rates and proline contents of transgenic
plants under drought stress
以积累游离脯氨酸来响应高渗应激性。Yamada等
(2005)进一步研究, 把AtP5CS转化到矮牵牛属植
物, 脯氨酸含量是其它氨基酸总含量的1.5~2.6倍,
而野生型植株的正常条件下仅为其他氨基酸含量
的0.57%~1.01%。此外, 把豇豆P5CS转入水稻, 在
水分胁迫8 d后, 脯氨酸含量是对照的182% (Su和
Wu 2004)。本研究中 , 在PEG6000处理5 d后 ,
P5CS1的mRNA表达量增加, 转基因株系脯氨酸含
量的平均值是野生型的2.4倍, 说明由于AtP5CS1基
因的转入到羽衣甘蓝中, 增加了P5CS1 mRNA表达
量, 明显提高了转基因羽衣甘蓝脯氨酸的合成速
度。陈吉宝等(2010)的研究结果与本试验相似。
转AtP5CS1基因株系与未转化对照相比 ,
P5CS表达量明显提高, 但表达量在不同转化子间
存在差异。分析其原因可能是因为转入基因的整
合位置不同影响了基因的最终表达效果。P5CS表
达的差异对其生长特征也有影响, 这可能是脯氨
酸积累程度有关。
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南芥P5CS1导入羽衣甘蓝。与我们结果类似的有
P5CS转基因小麦植株等(Sawahel和Hassan 2002)。
P5CS是脯氨酸合成的关键酶, 提高酶活性可增加
游离脯氨酸含量 , 增强植物的抗逆性。如Kavi
Kisho等(1995)在烟草中过表达P5CS1, 转基因植物
中该酶活性显著提高。Armengaud等(2004)以蒺藜
苜蓿(Medicago truncatula)为研究对象, 发现植物
李鸿雁等: 转拟南芥P5CS1基因增强羽衣甘蓝的耐旱性 1013
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