全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 2 期，2009 年 2 月 119
水稻硝酸还原酶的RNA干涉及其酶活性分析
田华 1, 韩瑞宏 3, 王兰 1, 彭新湘 2,*
华南农业大学 1 农学院, 2 生命科学学院, 广州 510642; 3 仲恺农业工程学院农业与园林学院, 广州 510225
提要: 分析水稻硝酸还原酶(NR)基因生物信息学的结果显示: 水稻基因组中有2个NR基因成员: 一个为NR[NADH] (NR1);
另一个为NR[NAD(P)H] (NR2)。两者的蛋白序列相似性为 70%。用 RT-PCR技术从水稻 cDNA中获得了 NR1和 NR2的
cDNA片段, 其大小分别为 1 086 bp和 892 bp。构建 RNA干涉载体(称 pRNAi-NR1和 pRNAi-NR2)转化水稻愈伤组织后
检测转基因后代酶活性的结果表明: 两种干涉植株的根叶中的NR活性均大幅度下降, 并且根叶中的活性变化呈线性正相
关关系。表明 2个基因可能均有调控根叶中NR活性的作用。
关键词: 硝酸还原酶; 克隆; 表达; RNA干涉; 水稻
RNA Interference of Nitrate Reductase and Analysis of Nitrate Reductase Ac-
tivities in Rice
TIAN Hua1, HAN Rui-Hong3, WANG Lan1, PENG Xin-Xiang2,*
1College of Agriculture, 2College of Life Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 3 School of
Agriculture and Landscape Architecture, Zhongkai Collage of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China
Abstract: Bioinformatic analysis showed that there were two members of NR genefamily in rice genome. One
have been annotated as NR[NADH] (NR1), the other is named as NR[NAD(P)H] (NR2). There were more than
70% similarities between NR1 and NR2 protein sequences. Both NR1 and NR2 cDNA fragments were obtained
by RT-PCR, with 1 086 bp and 892 bp, respetively. Then cDNAs were constructed into two interference
vectors, named as pRNAi-NR1 and pRNAi-NR2, respectively. NR activities were measured in roots and leaves
of the two kind transgenetic plants harbouring interference NR1 or NR2 genes. The results showed that NR
activities were significantly decreased in leaves and roots of both transgenic plants, and there was a positive
correlation between NR activities in leaves and roots. Our data suggested that the NR1 and NR2 genes may play
an important role in controlling NR activities in leaves and roots.
Key words: nitrate reductase; cloning; expression; RNA interference; rice
收稿 2008-10-22 修定 2008-12-23
资助 中国博士后科学基金(20070420142)和中国博士后科学
基金特别资助(20 0 80 12 5 6)。
* 通讯作者(E-ma i l : xp eng@ sca u .edu .cn; T el : 0 2 0 -
8 5 2 8 2 0 2 3 )。
硝酸还原酶(nitrate reductase, NR)是高等植物
氮素同化的限速酶(Solomonson和Spehar 1977), 可
直接调节硝酸盐还原, 从而调节氮代谢, 并影响光合
碳代谢。探讨NR 新的生理功能及其作用机制有一
定的理论和实际意义。Hackett 和Macgregor (1981)
证明在微生物中有 NR 前体存在。Funkhouser 等
(1983)认为小球藻中存在 NR 前体, 并已分离得到
了硝酸还原酶的脱辅基酶蛋白——酶前体; Somers
等(1983)用火箭免疫电泳技术证明NO3-诱导NR活
性从零逐渐增大, 并与 NR 蛋白质水平增加呈平行
关系, 从而否定了酶前体的存在。张德颐等(1987)
也报告有酶前体的存在; 在非诱导条件下植物组织
含有一定的NR活性, 也是有NR前体存在的佐证。
Müller (1983)用烟草NR突变体杂交试验后指出: NR
受 2 个不连锁基因的控制。Cannon 和 Pendleton
(1994)、Dawson 等(1996)都认为 NR 的编码基因
可以合成稳定性不同的 2 种 mRNA。拟南芥中也
存在 2 个 NR 基因(Nia1 和 Nia2) (Wang 等 2004)。
随着分子生物学技术的发展, 人们已从分子水平上
深入了解水稻NR的生理功能和作用机制; 此外还
可能由此深入了解氮代谢及其与其他生理过程之间
的关系。
本文以水稻为材料, 用生物信息学进行 NR
[NADH]和 NR[NAD(P)H]序列相似性比对分析。
采用RT-PCR技术, 从水稻叶片的 cDNA序列中分
别扩增出NR[NADH]和NR[NAD(P)H]基因的干涉
片段, 进而分别构建RNA干涉表达载体, 转化水稻
后得到2个载体的转基因植株来研究NR[NADH]和
植物生理学通讯 第 45 卷 第 2 期，2009 年 2 月120
NR[NAD(P)H]分别对 NR 活性的影响。
材料与方法
粳稻(Oryza sativa L. ssp. Japonica)品种‘中花
1 1 ’。农杆菌菌株( E H A 1 0 5 )和大肠杆菌菌株
(DH10B、DH5α和TOP10)为本实验室所保存。干
涉所用组成型载体pRNAi-Ubi由本校刘耀光研究员
提供(胡旭霞和刘耀光 2006)。
搜索GenBank中的NR基因的信息, 得知水稻
基因组中存在 2个NR基因成员。利用DNAstar进
行比对, 通过对目标基因同源性较低的区段应用
Primer 5.0 设计特异引物, 然后作 RT-PCR 扩增, 扩
增产物即为要装载的基因目的片段。实验中所用
引物序列如下: NR1-F (5-TTATAAGGATCCGAC-
CAGTCGCACAACACCCAG-3)和 NR1-R (5-
ATATCCAAGCTTCAGGTGCATCTCCGTCGTGTC-
3); NR2-F (5-ATGGATCCGTTCCTCAACACGGC-
CACCAC-3)和 NR2-R (5-TAAAGCTTCTCCCG-
GAGGAGCATGTCGT-3)。为了能够正确地将目
的基因片段插入到干涉所用组成型载体pRNAi-Ubi
的多克隆位点区 1 (MCS1)之间, 在引物的 5 端分
别设计了加上酶切位点和保护碱基, 其中NR1-F和
NR2-F 加 BamHI 酶切位点, NR1-R 和 NR2-R 加
HindIII 酶切位点。RNAi 转化载体的构建需要将
目的片段分别以正向和反向的形式插入到MCS1和
MCS2, 在 MCS1 有 BamHI 和 HindIII 酶切位点, 并
在 MCS1 两侧有通用引物 MluKpn (RNAi-MluI 5-
CACCCTGACGCGTGGTGTTACTTCTGAAGAGG-
3)和ApaPst2 (RNAi-PstI 5-ACTAGAACTGCAGC-
CTCAGATCTACCATGGTCG-3)的结合位点, 上游
引物 MluKpn 上带有 MluI 酶切位点, 下游引物
ApaPst2 上带有 PstI 酶切位点; 在 MCS2 有 PstI 和
MluI 酶切位点, 酶切位点 PstI 位于上游, MluI 则位
于下游, 这样在连入第一个目的片段后, 利用
pRNAi-Ubi上的通用引物MluKpn和ApaPst2就可
以扩增出带有 MluI和PstI两个酶切位点的目的片
段。将目的片段和载体分别用 MluI和 PstI双酶切
后连接, 则相对于第一次连接, 目的片段反向连接
到MCS2处, 形成反向重复序列。由于反向重复序
列由一个共同的启动子控制, 经转录后就可形成含
内含子的具发夹环结构的 dsRNA。
NR1和NR2构建的载体分别称为pRNAi-NR1
和pRNAi-NR2, 菌液送上海博亚生物技术有限公司
进行测序分析。测序正确的载体 pRNAi-NR1 和
pRNAi-NR2分别转化农杆菌EHA105感受态细胞,
农杆菌转化子再转回大肠杆菌后酶切鉴定其稳定
性。将鉴定稳定的农杆菌直接浸染水稻愈伤组织,
通过共培养、筛选、抗性愈伤的预分化、分化、
生根成苗和最后移栽获得转基因植株。
Southern杂交时, 取基因组DNA 3 µg用HindIII
限制性内切酶酶切(酶切缓冲液由供应商提供)。
探针标记(按TaKaRa公司Random primer DNA La-
beling Kit Ver 2.0试剂盒说明书) α-32P-dCTP (同位
素) 5 µL, 37 ℃下标记反应 10~30 min, 加入等体积
的0.8 mol·L-1 NaOH溶液使DNA变性, 加入到杂交
液中杂交。杂交完洗膜后, 用保鲜膜包裹, 压上分
子磷屏, 根据信号强弱曝光3~12 h后, 用BIO-RAD
FX 成像系统扫描, 分析杂交结果。
水稻幼苗长至三叶期, 挑选长势均匀一致的幼
苗移栽到体积为4 L的培养盆中继续在木村B营养
液(Yoshida 等 1976)(N 浓度 1.65 mmol·L-1)中培养
5 d 左右, NO3--N 营养液处理 1 d。
水稻中NR活性的测定参考Scholl等(1974)文
中的方法。提取 NR 时, 取 0.5 g 鲜样或-80℃冷
藏样品, 加入适量液氮研磨成粉末, 分次加入2.5 mL
(W/V=1:5)样品提取液[PBS (pH 7.5) 50 mmol·L-1,
EDTA 1 mmol·L-1, Cys 3 mmol·L-1]快速匀浆, 匀浆液
倒入2.0 mL EP管中, 低温下离心(15 000×g, 5 min),
上清液作为粗酶液, 立即用于酶活性测定。先向 1.5
mL EP 管中加入 0.7 mL 50 mmol·L-1 反应缓冲液
PBS (pH 7.5)、0.1 mL 0.2 mol·L-1 KNO3 溶液和 0.1
mL 5 mmol·L-1 NADH溶液, 混匀, 30 ℃恒温水浴中
保温 10 min。加入 0.1 mL 上述的粗酶液, 反应 15
min后加入0.1 mL 0.6 mol·L-1醋酸锌溶液中止反应,
低温下离心(15 000×g, 10 min), 取1 mL上清液转入
玻璃试管中, 加入0.1 mL 12 mmol·L-1 PMS溶液, 室
温下反应 10 min后, 加入 1.0 mL 1%磺胺及 1.0 mL
0.02%萘乙二胺溶液, 室温下反应20 min后以分光
光度计测定 540 nm处的吸光值。对照的反应液中
以蒸馏水代替 NADH 溶液。
可溶性蛋白含量的测定参考 Bradford (1976)
的方法。
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结果与讨论
1 NR1和NR2的生物信息学分析
生物信息学分析结果表明, 水稻基因组中存在
2个NR基因成员, 一个叫NR[NADH], 其 cDNA全
序列大小约为 3 147 bp, ORF片段大小为 2 751 bp;
另一个叫 NR[NAD(P)H], cDNA 全序列大小约为
3 050 bp, ORF 片段大小为 2 670 bp。二者 ORF
的cDNA核酸序列相似性为76%; 蛋白序列相似性
为 70% (图 1)。
图 1 水稻 NR 基因成员编码蛋白序列的相似性比对
Fig.1 The similarity blast of NR gene family members in rice
植物生理学通讯 第 45 卷 第 2 期，2009 年 2 月122
2 RNA干涉载体的构建
2.1 RT-PCR扩增目的片段NR1和NR2 设计 2对
引物, 以水稻叶片 cDNA 为模板, PCR 扩增出 2 个
cDNA片段, 预测片段NR1从ORF第 1 366个到第
2 451 个碱基, 大小 1 086 bp, NR2 从 ORF 第 1 521
个到第 2 412 个碱基, 大小 892 bp。扩增产物经
0.8%琼脂糖凝胶电泳检测, 显示扩增片段的特异性
强, 无非特异带, 大小分别为 1.1 kb 和 0.9 kb 左右,
与报道的NR1和NR2基因的 cDNA片段大小相符,
初步确定扩增片段为目的片段(图 2、3)。
图 2 RT-PCR 扩增水稻 NR1 基因的 cDNA片段
Fig.2 The RT-PCR of NR1 cDNA fragment in rice
M: DL2000 分子量标记; 1~3: RT-PCR 扩增产物。
图 3 RT-PCR 扩增水稻 NR2 基因的 cDNA片段
Fig.3 The RT-PCR of NR2 cDNA fragment in rice
M: DL2000 分子量标记; 1~3: RT-PCR 扩增产物。
图 5 装载完的质粒 pRNAi-NR2 用 BamHI 单酶切检测
Fig.5 Identification of the final recombination pRNAi-NR2
by BamHI digestion
M: DL2000 分子量标记; M1: λHindIII 分子量标记; 1: 阳性
克隆的 Ba m H I 单酶切。
3 转化植株的 Southern杂交检测分析
为了检测转化是否成功和转化植株中插入子
的插入位点数, 对 Hpt基因进行 Southern杂交以检
测 T0 代转化植株的株系。结果显示: 目标基因片
段的转化是成功的(图 6、7), 各株系的插入位点数
不一, 有的为单一位点T-DNA插入的, 如图6中2、
3、6 泳道的株系和图 7 中 1、3、13 泳道的株系,
这些单拷贝的株系为以后筛选纯合子提供了有力的
图 6 T0 代部分 pRNAi-NR1 转化植株的 Southern 杂交
Fig.6 Southern blotting of some T0 transgenic plants
harbouring pRNAi-NR1
M: λHindIII 分子量标记; 其余为转基因植株编号。
2.2 酶切鉴定 二次装载完的质粒都可选用BamHI
单酶切检测。由图 4 中可以看出: pRNAi-NR1 切
出的片段大小约为 2.4 kb, 其中包括了反向重复序
列间导入的内含子250 bp, 由此证实pRNAi-NR1重
组载体已成功构建。同时, 由图5可以看出pRNAi-
NR2切出的片段大小约为2.2 kb, 证实pRNAi-NR2
重组载体也已成功构建。最后的测序结果表明: 所
扩增的NR1片段与GenBank中NR1的 cDNA的相
似性为99%, 扩增的NR2片段与GenBank中NR2的
cDNA的相似性为 98%, 所构建的 2 个载体已达到
RNA 干涉的要求。
图 4 装载完的质粒 pRNAi-NR1 用 BamHI 单酶切检测
Fig.4 Identification of the final recombination pRNAi-NR1
by BamHI digestion
M: DL2000 分子量标记; 1~3: 阳性克隆。
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保障。转化事件不同的株系干涉基因表达的效果
不同, 说明不同的转化事件会影响干涉基因表达的
效果。
4 干涉NR1和NR2对水稻NR活性的影响
4.1 NR1干涉植株中的NR活性变化 从图8和图9
中可以看出, NR1 干涉植株根和叶中的 NR 活性均
下降, 当叶片NR活性被抑制95%以上时, 根的NR
活性被抑制 80% 左右, 二者呈线性正相关关系, 表
明 NR1 同时控制着根和叶中的 NR 活性。
图 7 T0 代部分 pRNAi-NR2 转化植株的 Southern 杂交
Fig.7 Southern blotting of some T0 transgenic plants
harbouring pRNAi-NR2
M: λHindIII 分子量标记; 其余为转基因植株编号。
图 9 干涉 NR1 对叶片中 NR 活性下调与根中 NR 活性下调
的关系
Fig.9 The relationship between NR activities in leaves and
roots of NR1 interference transgenetic plants
4.2 NR2干涉植株中的NR活性变化 从图10和图
11中可以看出, NR2干涉植株根和叶中的NR活性
也同步下降, 二者也呈线性正相关关系, 说明 NR2
也同时控制着根和叶中的 NR 活性。此外, 干涉
NR1和NR2均能导致水稻根叶中的NR活性大幅度
降低, 并且根叶中活性变化呈线性正相关关系, 表
明这2个基因可能均在调控根叶NR活性中起重要
的作用。产生这一结果可能有 2 种原因: (1) NR1
图 11 NR2 干涉对叶片中 NR 活性下调与根中
NR 活性下调的关系
Fig.11 The relationship between NR activities in leaves and
roots of NR2 interference transgenetic plants
图 8 干涉 NR1 对水稻根和叶中 NR 活性的影响
Fig.8 Effects of NR1 interference on NR activitities in rice
leaves and roots
图 10 干涉 NR2 对水稻根和叶片中 NR 活性的影响
Fig.10 Effects of NR2 interference on NR activitities in rice
leaves and roots
和 NR2 可能分别编码 NR 酶蛋白的不同亚基。(2)
由于2个干涉片断的相似性导致了2个基因间的相
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互干涉效果。前人的研究结果显示: 只要存在连续
41个碱基相同, 片段相似性达到88%时, 就能有效
引发干涉效应(Parr ish 等 2000; Tijsterman 等
2002)。我们所获得的 2 个干涉片断的相似性为
73%, 无连续 41 个碱基相同, 但并不能排除 2 个基
因之间的非特异干涉作用。
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