全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 4期，2009年 4月 389
收稿 2009-01-15 修定 　2009-02-12
资助 江苏省自然科学基金(BK20 08 210 )。
* 通讯作者(E-mai l: wangyp@yzu .edu.cn; T el: 051 4-
8 7 9 9 7 3 0 3 )。
一种快速生长的甘蓝型油菜 DH 系的获得和鉴定
吴磊 1, 吴冕 1, Karin Sonntag2, 王幼平 1,*
1扬州大学生物科学与技术学院, 江苏扬州 225009; 2Julius Kuehn Institute, Federal Research Centre for Cultivated Plants,
Institute for Breeding Research on Agricultural Crops, Erwin-Baur-Str. 27, D-06484 Quedlinburg, Germany
提要: 从快速生长的甘蓝型油菜的小孢子培养中共获得23个再生植株。经倍性鉴定, 其中自发加倍成二倍体的有10株, 单
倍体13株。单倍体再用秋水仙碱处理后获得DH系, 所得材料对油菜功能基因组学的研究可能有一定的价值。
关键词: 甘蓝型油菜; 小孢子培养; DH系
Obtainment and Characterization of DH Lines of A Rapid-cycling Brassica napus L.
WU Lei1, WU Mian1, Karin Sonntag2, WANG You-Ping1,*
1College of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China; 2Julius Kuehn Institute, Federal
Research Centre for Cultivated Plants, Institute for Breeding Research on Agricultural Crops, Erwin-Baur-Str. 27, D-06484
Quedlinburg, Germany
Abstract: Tweety-three regenerated plants were recovered by microspore culture of a rapid-cycling Brassica
napus. Among them, ten plants were diploid and thirteen were haploid after ploidy characterization. The DH
(doubled haploid) lines were gained by treatment with colchicine. We generated completely homozygous DH
lines as a model system for functional genomics work in B. napus.
Key words: Brassica napus; microspore culture; DH lines
德国的 Lichter (1982)最早报道了甘蓝型油菜
小孢子培养获得再生植株, 随后又有人对油菜小孢
子培养技术开展了研究。迄今小孢子培养已在大
部分芸薹属植物中获得成功, 如埃塞俄比亚芥
(Chuong和 Beversdorf 1985)、黑芥(Leelavathi等
1987)、大白菜(Lichter 1989)、甘蓝(Rudolf等
1999)和芥菜型油菜(Thiagarajah和 Stringam 1993;
Lionneton等 2001)。甘蓝型油菜的小孢子培养已
成为一种常规技术, 广泛应用于油菜遗传分析和图
谱的构建(Teutonic和 Osborn 1994; Rygulla等
2008)、新品种选育(吴江生等 1999)、结合诱变
进行资源创新 (石淑稳等 2 0 0 4 )、基因克隆
(Formanova等 2006)、异附加系材料的保存(Wang
等 2006)和转基因的研究(Chan和 Paul 2007)等。
本文采用小孢子培养获得再生植株可以快速
实现基因型的纯合, 文中选用人工合成的一种快速
生长的甘蓝型油菜(AACC)为实验材料, 以小孢子培
养的方法获得纯合系, 从而为进一步构建油菜 T-
DNA插入突变体库以及油菜功能基因组学的研究
建立基础。
材料与方法
所用材料是人工合成的快速生长(在17~20 ℃
条件下从种植到成熟只需8~10周时间)的甘蓝型油
菜(Brassica napus L.)。从油菜植株主花序或第一
次分枝花序上取长2~3.5 mm的花蕾(经镜检为单核
晚期的小孢子), 用 96%酒精表面消毒 15 s, 再用
4% NaClO消毒花蕾 15 min, 无菌水冲洗 3次。
分离和培养小孢子时, 将消毒的花蕾置于灭菌
小烧杯中, 加 25 mL NLN培养基(Lichter 1982), 其
中蔗糖浓度为 13%, 用研磨杵轻轻将花蕾研碎, 通
过 45 μm的尼龙网膜过滤, 收集滤液, 离心 5 min
(230×g)。吸出有小块药壁残渣的上清液, 再加含
有 13%蔗糖的NLN培养基, 离心 5 min (180×g)。
吸去上清液, 将沉淀的小孢子悬浮于含13%蔗糖的
NLN液体培养基中, 按小孢子的密度 6×104个 · mL-1
定溶, 转入直径为 90 mm培养皿中, 每皿 10 mL。
植物生理学通讯 第 45卷 第 4期，2009年 4月390
将分离到的小孢子置于30~33 ℃黑暗条件下静置培
养 5 d, 然后转到 25 ℃继续暗培养 2~3周。再将
培养皿转移到光照条件下(约 19 μmol·m-2·s-1), 培养
皿上面盖一张白纸以减少光强, 用摇床震荡培养(90
rpm); 1周后去除白纸直接在光照条件下继续培养,
直到小孢子幼胚发育成子叶胚。
子叶胚生长至 4~5 mm时, 将其转入固体培养
基中(MS培养基 +20 g·L-1蔗糖 +7.5 g·L-1琼脂糖 +
0.2 mg·L-1 NAA+0.2 mg·L-1 6-BA) 24 ℃条件下培养,
光周期为 16 h光 /8 h暗, 3~4周后出现苗的分化,
然后转入不含激素的MS培养基中让苗进一步发
育, 再转入生根培养基(MS培养基 +20 g·L-1蔗糖 +
0.5 mg·L-1 NAA+8 g·L-1琼脂)中诱导根的形成。
鉴定再生植株的倍性时, 剪取 0.25 cm×0.2 cm
再生植株的幼叶放入 0.5 mL核酸分离提取液中
(Partec GmbH, 德国), 用刀将叶片切碎, 然后加入
1 mL的DAPI染液(Partec GmbH, 德国), 经 30 μm
滤网过滤, 滤液在 4 ℃条件下放置 20 min, 用细胞
流式测量仪(Partec Cell Analyzer CA-II, 德国)进行
植株的倍性分析。
单倍体植株的染色体加倍和观察农艺性状时,
将再生植株移到温室中生长。如果是单倍体还需
进行染色体加倍处理, 待开花前将植株从花盆中拨
出, 用自来水洗去根周围的土壤, 然后浸在秋水仙
素溶液(3.4 g·L-1)中处理 1 h, 用自来水冲洗 3 h后,
再将植株移栽到花盆中, 开花、结实。将小孢子
培养获得的再生植株和以种子萌发的植株(对照)放
在同一温室条件下生长, 并观察和比较两者的主要
农艺性状。
实验结果
1 小孢子培养再生成植株
选择合适的花蕾, 从中分离到的小孢子多数
为圆球形, 大小比较均一。培养初期的小孢子悬
浮于含有13%蔗糖的NLN液体培养基中, 暗条件
下培养 5 d (33 ℃), 在这期间, 小孢子出现明显的
膨大(图 1-a), 5 d后转入 25 ℃暗中生长, 7 d后有
部分小孢子开始分裂。在接下来的 2周内, 小孢
子继续分裂形成多细胞团, 3周后细胞团进一步长
大形成心形胚(图 1-b), 但多数小孢子没有进一步
发育。然后将材料转移到弱光并轻微摇动, 6周
左右用肉眼可以观察到大小和形状不一的胚状体,
该实验共诱导出 75个胚状体。诱导出的胚状体
转到固体培养基上生长 3~4周后出芽并长成幼苗
(图 1-c), 继续培养独立再生出 23株植株, 植株再
生率为 30 .7%。
2 再生植株的倍性鉴定、加倍处理和主要农艺性
状的观察
再生出的23株植株经流式细胞仪进行倍性鉴
定, 其中单倍体为13株, 自发加倍的二倍体为10株,
自发加倍的概率为 43.5%。将再生苗经炼苗后移
栽到温室, 植株生长迅速, 无刺毛, 不被蜡质, 叶片
图 1 甘蓝型油菜小孢子培养获得再生植株
Fig.1 Regeneration plants derived from microspore culture of B. napus
a: 小孢子开始膨大; b: 心形胚; c: 幼苗; d: 单倍体植株; e: 自发加倍的二倍体植株。
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呈披针形, 而种子生长出来的材料(对照)叶片较
大、圆形有缺刻。通过小孢子培养获得的单倍体
植株(图1-d)比自发加倍的二倍体植株(图1-e)矮, 开
花时不育; 经秋水仙素处理后, 有的植株结实, 可以
获得少量种子。自发加倍的二倍体结实正常, 可获
得种子。与对照比较, 小孢子培养再生出的单倍体
和二倍体, 生育期缩短、株高降低、角果长度和
角果粒数均减少(表 1)。
表 1 再生的单倍体、二倍体和对照植株的农艺性状比较
Table 1 Comparison on agronomic characters among regenerated haploids, diploids and original plants
植株 生育期 /d 株高 /cm 角果长度 /cm 平均种子数 /个
对照 56~70 70~100 4~7 15~20
秋水仙素处理的单倍体 50~60 18~30 2~3 3~10
自发加倍二倍体 50~60 30~40 3~4 10~20
讨　　论
小孢子培养染色体加倍可从早期分离的小孢
子到后期植株的不同阶段进行染色体加倍处理
(Möllers等 1994; Wang等 2006)。我们采用的是在
单倍体开花前期, 通过秋水仙碱浸根法进行加倍, 以
此获得加倍的单倍体(DH)的效果是比较好的。同
时还获得10株自发加倍的二倍体植株, 其自发加倍
的频率为 43.5%, 略高于原先的有关芸薹属的报道
(Lionneton等 2001; Rudolf等 1999)。小孢子培养
是一项具有广泛应用前景的技术, 再生出的单倍体
经染色体加倍后基因型纯合只需一代, 这样就缩短
了时间, 特别适用于复杂性状的纯合。此项研究采
用小孢子培养的方法获得了快速生长的新型甘蓝型
油菜DH系, 所得到的实验材料为进一步开展油菜
功能基因组学的研究建立了基础。
参考文献
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