全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (4): 381~385 381
收稿 2011-12-20　　修定 2012-02-19
资助 吉林省科技厅项目(200705C05)。
* 通讯作者(E-mail: gudizhou@163.com; Tel: 0435-3208073)。
烈香杜鹃的离体培养和高效植株再生
顾地周*, 陆爽, 巴春影, 李媛媛
通化师范学院生物系, 吉林通化134002
摘要: 以烈香杜鹃嫩茎为外植体, 应用均匀设计法筛选其最适合的嫩茎基部直接再生芽苗和生根培养基。结果表明, 最适
合烈香杜鹃嫩茎基部直接再生芽苗的诱导培养基为DR+2.30 mg·L-1 TDZ+0.05 mg·L-1 IAA+1.80 mg·L-1 KT, 诱导率为99.6%;
生根培养基为1/2DR+0.07 mg·L-1 IAA+0.02 mg·L-1 NAA, 生根率达99.7%以上。以再生植株茎节为材料进行快速繁殖, 在35
d的培养周期内, 每段增殖倍数平均达5以上。
关键词: 烈香杜鹃; 离体培养; 植株再生; 均匀设计
In vitro Culture and Efficient Plantlet Regeneration of Rhododendron an-
thopogonoides Maxim.
GU Di-Zhou*, LU Shuang, BA Chun-Ying, LI Yuan-Yuan
Department of Biology, Tonghua Normal University, Tonghua, Jilin 134002, China
Abstract: The tender stems of Rhododendron anthopogonoides were used as explants in the experiment, the
uniform design was used to screen the most suitable media for shoots regeneration by the tender stems and root-
ing. The results showed that the best medium for shoots regeneration was DR+2.30 mg·L-1 TDZ+0.05 mg·L-1
IAA+1.80 mg·L-1 KT, the rate of induction was 99.6%; the best medium for rooting was 1/2DR+0.07 mg·L-1
IAA+0.02 mg·L-1 NAA, the rate of rooting was 99.7%. Each stems with one node were cut from regenerated
shoots and cultured for propagation, and proliferation rate achieved an average of 5 within 35 days.
Key words: Rhododendron anthopogonoides; in vitro culture; plantlet regeneration; uniform design
烈香杜鹃又名小叶枇杷、白香柴、黄花杜鹃,
为杜鹃花科杜鹃花属常绿灌木, 主要分布我国甘
肃、青海及四川等地的高山坡、山地林下和灌
丛中。烈香杜鹃具有清热解毒、止咳平喘、健胃
消肿等功效, “烈香杜鹃片”为批准的全国推广用药
(1971年), 西北高原生物研究所研制的“烈香杜鹃
油”用于临床, 显效快, 优于其他的祛痰止咳药, 通
过药理筛选及临床验证(中国药科大学1993; 兰州
医学院药理病理教研室1974)。另外, 烈香杜鹃是
优良的、有待研究开发的园艺观赏植物, 属高山
杜鹃, 是杜鹃育种的重要种质资源。烈香杜鹃利
用种子、扦插、嫁接及压条的常规繁殖存在萌发
率、生根率和移栽成活率极低等问题, 使其开发
及利用受到极大限制。目前, 关于烈香杜鹃的研
究大多集中在化学成分和生药等方面 (张继等
2003; 胡浩斌等2004; 戴胜军等2004; 戴胜军和于
德泉2005; 李维卫等2004; 张莉和袁永生2010), 而
种苗繁殖和引种栽培的研究极少(曹文侠等2004;
那林香2010), 与其同属的其他种植物的离体培养
研究已有报道(汤桂钧等2004; 顾地周等2009a, b,
d)。而本研究利用植物组织培养方法, 以烈香杜鹃
嫩茎为材料, 在嫩茎基部直接诱导芽苗并形成丛
生芽的方式建立了烈香杜鹃离体培养和高效植株
再生体系, 在国内外尚未见报道。
材料与方法
1 外植体材料的来源与处理
烈香杜鹃(Rhododendron anthopogonoides
Maxim.)枝条采自甘肃省兰州市兴隆山, 将枝条茎
尖剪除后在实验室内水培 , 促其叶腋休眠芽萌
发。待休眠芽萌发长至2.00 cm后将嫩枝剪下, 在
超净工作台上用75%酒精涮洗8 s, 再用5.0%次氯
酸钙溶液浸泡15 min, 无菌水冲洗8次, 无菌滤纸吸
干表面水分后备用。
植物生理学报382
2 烈香杜鹃嫩茎基部直接再生芽苗的诱导
以DR为培养基(曹孜义和刘国民2002), 将嫩
枝切割成一叶一段 , 接种到培养基1/4DR+0.20
mg·L-1 IAA+2.50 mg·L-1 GA3中, 在试管内进行腋芽
诱导和伸长生长培养(培养条件为温度26 ℃、光
照强度25 µmol·m-2·s-1、光照周期12 h·d-1)。待腋芽
长至1.00 cm时切下并切割成段, 转接到附加不同
浓度的噻重氮苯基脲(thidiazuron, TDZ) (由预试验
确定为1.40~2.10 mg·L-1)、吲哚乙酸(indoleacetic
acid, IAA) (由预试验确定为0.06~0.09 mg·L-1)和激
动素(kinetin, KT) (由预试验确定为1.10~1.60 mg·L-1),
加入蔗糖20 g·L-1, 琼脂6.8 g·L-1, 调节pH值为5.8, 在
温度(28±2) ℃、光照强度22 µmol·m-2·s-1、光照周
期12 h·d-1条件下培养。采用均匀设计法(顾地周等
2009c), 选用U12 (12
3)均匀表, 每个处理接种嫩茎数
为10个, 重复3次取平均值, 筛选直接再生芽苗的
TDZ、IAA和KT浓度配比。腋芽嫩茎培养40 d统
计诱导率。
3 烈香杜鹃再生芽苗的生根培养
以1/2DR为培养基, 并附加不同浓度的IAA
(由预试验确定为0.10~0.16 mg·L-1)、吲哚丁酸(in-
dolebutyric acid, IBA) (由预试验确定为0.08~0.10
mg·L-1)和萘乙酸(naphthylacetic acid, NAA) (由预
试验确定为0.04~0.06 mg·L-1), 加入5 g·L-1蔗糖和
6.8 g·L-1琼脂 , 调节pH为5.8, 再生芽苗在温度
(23±2) ℃、光照强度20 µmol·m-2·s-1、光照周期10
h·d-1条件下培养。为了提高烈香杜鹃的生根率, 选
用U12(12
3)均匀表, 每个处理接种再生芽苗数为10
个, 重复3次取平均值, 筛选最适合生根的IAA、
IBA和NAA浓度配比。再生芽苗培养30 d统计生
根率。
采取节增殖方式对烈香杜鹃进行高效快繁
(顾地周等2008a, b), 待生根的苗伸长至3.50 cm以
上时, 在超净工作台上打开培养瓶, 将生根的苗留
一或二叶剪下苗干, 并切割成一叶一段转接到附
加2.00 mg·L-1赤霉素(gibberellic acid, GA3)的生根
培养基中, 进行腋芽萌发伸长同时生根培养, 统计
并计算每瓶中每段茎节的增殖倍数和周期。
再生芽苗生根后, 从培养瓶中取出再生植株,
在含有10 mg·L-1高锰酸钾溶液中洗去根部残留的
琼脂, 然后植入经200倍液的杀毒矾消毒过的草炭
土、河砂和腐烂松针(3:1:2)的混合基质中, 用透光
好的塑料薄膜覆盖以保湿保温, 相对湿度保持在
75%, 温度控制在(24±2) ℃, 每天自然光照13 h, 每
天中午适当通风换气, 每天早晚喷洒清水各1次。
4 数据处理与分析
通过均匀设计法进行试验设计, 数据经分析
处理后摸索出各因素对再生芽苗诱导率和再生芽
苗生根率的影响。均匀设计软件采用Uniform De-
sign 3.0V。
实验结果
1 烈香杜鹃嫩茎基部直接再生芽苗诱导培养基的
筛选
由表1可得回归方程Y=42.9+22.7X1-303X2+
14.7X3, 样本容量N=12, 显著性水平α=0.05, 经计
算, 复相关系数R=0.9729, 剩余标准差s=2.36, 检验
值Ft=47.26, 临界值F(0.05,3,8)=4.066, Ft>F(0.05,3,8), 表明
回归方程显著。检验各方程项的显著性可知, TDZ、
IAA和KT均对诱导率影响显著, 其最优浓度分别
为2.10、0.06和1.60 mg·L-1, 并计算出诱导率的最
优解析解为96.0%, 需按公式Y=y±uα×s (其中uα为正
态分布的双侧分位数, s为剩余标准差)计算出优化
值估计区间为90.56%~101.44%。表1和回归分析
结果可知, TDZ、IBA和KT对回归的贡献率分别为
20.3%、9.41%和9.64%, 说明TDZ对再生芽苗的诱
表1 烈香杜鹃再生芽苗诱导培养基的U12 (123)均匀设计试验
Table 1 U12 (12
3) uniform design test of media for bud
seedling regeneration of R. anthopogonoides
编号
TDZ浓度 IAA浓度 KT浓度 诱导率
(X1)/mg·L
-1 (X2)/mg·L
-1 (X3)/mg·L
-1 (Y)/%
1 1.40 0.08 1.30 71.0
2 1.50 0.09 1.60 74.4
3 1.60 0.09 1.40 68.7
4 1.70 0.08 1.10 73.5
5 1.80 0.09 1.20 75.9
6 1.90 0.07 1.50 84.1
7 2.00 0.08 1.50 89.0
8 2.10 0.06 1.20 91.2
9 1.80 0.07 1.10 78.5
10 1.90 0.06 1.40 88.7
11 2.00 0.06 1.60 94.6
12 2.10 0.07 1.30 86.3
顾地周等: 烈香杜鹃的离体培养和高效植株再生 383
导率的贡献大于IAA和KT。因TDZ和KT均与诱导
率呈正相关, IAA与诱导率呈负相关, 推测TDZ和
KT浓度分别高于2.10 mg·L-1、1.60 mg·L-1及IAA浓
度低于0.06 mg·L-1有较高的芽苗诱导率。
进一步以TDZ (2.10~2.50 mg·L-1)+IAA (0~0.06
mg·L-1)以及TDZ (2.10~2.50 mg·L-1)+KT (1.60~2.00
mg·L-1)分别做了7个水平的2因素补充试验(由3种
激素贡献率确定因素配对), 选用U7 (7
2)均匀表, 每
个处理接种嫩茎数为10个, 重复3次取平均值。结
果表明, 当TDZ>2.30 mg·L-1和IAA<0.05 mg·L-1时,
再生芽苗诱导率均低于89.0%; 而TDZ>2.30 mg·L-1
和KT<1.80 mg·L-1时 , 再生芽苗诱导率均低于
92.0%。
将嫩枝切割成一叶一段接种到培养基1/4DR+
0.20 mg·L-1 IAA+2.50 mg·L-1 GA3中, 在试管内进行
腋芽萌发生长和伸长培养。待腋芽在培养瓶中长
至1.00 cm时切下(图1-A), 并切割成段转接到培养
基DR+2.30 mg·L-1 TDZ+0.05 mg·L-1 IAA+1.80 mg·L-1
KT上进行验证试验, 重复3次取诱导率的平均值。
嫩茎培养10 d, 发现嫩茎基部切口处产生大量颗粒
状小凸起; 22 d后颗粒状小凸起逐渐转变为锥状;
培养至35 d, 锥状体逐渐生长并伸长为不定芽形成
丛生芽团(图1-B); 继续培养至50 d, 可产生大量不
定芽且长度可达1.80 cm以上(图1-C), 诱导率达
99.6%, 均高于表1中12个处理的诱导率, 且在估计
区间范围内。可见, 烈香杜鹃嫩茎基部直接再生
芽苗诱导的最佳培养基为DR+2.30 mg·L-1 TDZ+
0.05 mg·L-1 IAA+1.80 mg·L-1 KT。
图1 烈香杜鹃离体培养和高效植株再生的各阶段
Fig.1 In vitro culture and efficient plantlet regeneration of R. anthopogonoides at various stages
A: 嫩枝段腋芽萌发生长; B、C: 嫩茎基部直接再生芽苗诱导; D、E: 再生芽苗生根和高效快繁; F: 移栽。
2 烈香杜鹃再生芽苗生根培养基的筛选
表2中实验所得数据经分析处理后, 得回归方
程可得回归方程Y=139-290X1-429X3, 样本容量
N=12, 显著性水平α=0.05, 经计算, 复相关系数
R=0.9124, 剩余标准差s=3.31, 检验值Ft=22.36, 临
界值F(0.05,2,9)=4.256, Ft>F(0.05,2,9), 回归方程显著。检
验IAA、IBA和NAA的显著性可知, IAA和NAA两
个因素对生根率影响显著, 而IBA对生根率影响不
显著, IAA和NAA的最优浓度分别为0.10 mg·L-1和
0.04 mg·L-1, 以此组合计算最优解析解为92.8%, 计
算得优化值估计区间为85.31%~100.29%。通过回
归分析可知, IAA和NAA对回归的贡献率分别为
70.0%和30.0%, 表明IAA对再生芽苗生根率的贡献
大于NAA。因IAA和NAA均与生根率呈负相关,
推测IAA和NAA浓度分别在0.10 mg·L-1和0.04
mg·L-1以下, 可获得较高的生根率。
又以0~0.10 mg·L-1 IAA以及0~0.04 mg·L-1
NAA做了11个水平的补充试验, 选用U11 (11
2)均匀
表, 每个处理接种芽苗数为10个, 重复3次取平均
值, 结果表明, 当IAA>0.07 mg·L-1和NAA<0.02
mg·L-1时, 芽苗生根率平均值均低于87.4%。
待诱导的再生芽苗长至2.00 cm左右时, 在无
植物生理学报384
菌条件下打开培养瓶, 将生长健壮的芽苗从芽团
上切下, 转接到培养基1/2DR+0.07 mg·L-1 IAA+
0.02mg·L-1 NAA的中培养生根, 重复3次取平均
值。再生芽苗培养10 d, 芽苗基部切口处产生微小
锥状颗粒; 培养18 d后锥状颗粒逐渐转变为白色的
根锥; 培养至28 d根锥伸长为不定根; 35 d后可形
成7条以上含有大量侧根的不定根(图1-D), 生根率
达99.7%。数值在估计区间范围内, 且比表2所列
12个水平的生根率均高。可见, 烈香杜鹃再生芽
苗生根的最佳培养基为1/2DR+0.07 mg·L-1 IAA+
0.02 mg·L-1 NAA。
采取节增殖方式, 将含有单叶的茎节在培养
基1/2DR+0.07 mg·L-1 IAA+0.02 mg·L-1 NAA+2.00
mg·L-1 GA3上培养38 d, 腋芽逐渐萌发伸长生长, 同
时在切口处和枝干部可长出6~8条不定根, 苗高可
达4.0 cm (图1-E)。经过35 d的培养后, 每节段平均
增殖5倍以上。
待芽苗生根后并长至3.00 cm以上时进行移栽
炼苗, 15 d可揭去薄膜, 成活率达95.0%以上(图
1-F)。
讨　　论
本实验结果表明 , 培养基DR+2.30 mg·L-1
TDZ+0.05 mg·L-1 IAA+1.80 mg·L-1 KT对烈香杜鹃
嫩茎直接再生芽苗的诱导效果最佳, TDZ浓度低于
1.40 mg·L-1和高于2.30 mg·L-1时嫩茎基部芽苗诱导
率均低于54.0%, 说明烈香杜鹃嫩茎直接再生芽苗
需要适宜浓度的TDZ。由预实验和试验结果表明,
适宜浓度的IAA有利于芽苗的迅速生长。再生芽
苗诱导培养基中添加适当浓度(1.80 mg·L-1)的KT
有利于促进嫩茎直接再生芽苗的速度和提高再生
芽苗的诱导率(李合生2002), 说明了植物器官的发
生发育对不同植物生长调节物质都具有不同程度
的选择性(高新一和王玉英2003)。这可能是由植
物自身的基因型控制的, 而不同基因型又决定了
细胞分化和器官重建所依赖的植物生长调节物质
种类及其浓度高低有所不同; 在添加0.07 mg·L-1
IAA和0.02 mg·L-1 NAA的1/2DR培养基中进行烈香
杜鹃再生芽苗的生根培养, 生根速度快, 平均生根
率高达99.7%。烈香杜鹃再生芽苗生根需要2种生
长素才能达到显著生根效果, 但2种生长素需要适
当的配比。当IAA和NAA浓度较低时, 再生芽苗生
根率较低, 不足45.0%; 当生长素浓度较高时, 再生
芽苗基部膨胀并产生愈伤组织, 继续培养从愈伤
组织上产生根, 含有这样根的苗在炼苗移栽时, 根
随愈伤组织从苗基部脱落, 成活率极低, 这可能是
根中和苗茎的疏导组织连接错位导致的。Donnelly
等(1985)的研究也发现了这一缺点。高效快繁采
取再生植株茎节增殖的方式, 在生根培养基中附
加2.00 mg·L-1的GA3有利于腋芽快速萌发和生长,
从而缩短了茎节的增殖周期, 提高了增殖倍数。
王雯雯等(2009)开展的大字杜鹃快繁研究也报道
了该方法。该方法成本低, 简捷而可操作性强, 可
用于工厂化育苗。
目前, 国外有许多野生杜鹃优良品种已引种
驯化并通过人工繁殖成为栽培种。我国野生杜鹃
品种众多, 但人工繁殖并开发利用极少。烈香杜
鹃是我国珍贵的野生药用和园艺观赏植物资源,
至今未见推广应用。本结果建立了烈香杜鹃嫩茎
基部直接再生芽苗和高效植株再生体系, 为烈香
杜鹃和其它野生杜鹃优良品种的开发利用和工厂
化育苗提供了基础和方法。
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表2 烈香杜鹃再生芽苗生根培养基的U12 (12
3)均匀设计试验
Table 2 U12 (12
3) uniform design test of media for shoots
rooting of R. anthopogonoides
编号
IAA浓度 IBA浓度 NAA浓度 生根率
(X1)/mg·L
-1 (X2)/mg·L
-1 (X3)/mg·L
-1 (Y)/%
1 0.10 0.08 0.04 91.1
2 0.11 0.10 0.04 90.5
3 0.12 0.09 0.06 80.0
4 0.13 0.09 0.06 77.6
5 0.14 0.10 0.05 78.6
6 0.15 0.08 0.05 70.0
7 0.16 0.10 0.05 73.9
8 0.12 0.10 0.05 84.0
9 0.13 0.09 0.06 77.6
10 0.14 0.09 0.06 66.2
11 0.15 0.08 0.04 75.8
12 0.16 0.08 0.04 78.3
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