全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 5期，2009年 5月 479
收稿 2009-03-09 修定 　2009-04-28
资助 国家自然科学基金(30671344、30800748)和中国博士
后科学基金(2 00 70 41 10 80 )。
* 通讯作者( E-ma i l : l i u s y @o i l c ro ps . cn ; T el : 0 2 7 -
8 6 8 1 2 8 9 6 )。
PDF1.2基因在转草酸氧化酶基因甘蓝型油菜中的表达
冀瑞琴 1,2, 董祥柏 2, 冯辉 1, MARTIN Barbetti3, 高荣村 2, 刘月英 2, 刘胜毅 2,*
1沈阳农业大学园艺学院, 沈阳 110161; 2中国农业科学院油料作物研究所, 武汉 430062; 3School of Plant Biology, Faculty of
Natural and Agricultural Sciences, the University of Western Australia, Crawley, WA, 60099, Australia
提要: 采用 RT-PCR方法检测茉莉酸(JA)/乙烯(ET)依赖性信号途径中关键基因 PDF1.2在转草酸氧化酶基因(OXO)油菜株
系与未转化对照中的表达差异。结果表明, 在转基因油菜不同株系中PDF1.2都有不同程度的上调表达, 预示着转OXO油
菜对菌核病的抗性增强可能与激活JA/ET依赖性信号途径有关。
关键词: 甘蓝型油菜; 菌核病; PDF1.2
Expression of PDF1.2 in Oxalate Oxidase Transgenic Oilseed Rape (Brassica
napus L.)
JI Rui-Qin1,2, DONG Xiang-Bai2, FENG Hui1, MARTIN Barbetti3, GAO Rong-Cun2, LIU Yue-Ying2, LIU Sheng-Yi2,*
1College of Horticulture, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China; 2Oil Crops Research Institute, Chinese
Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430062, China; 3School of Plant Biology, Faculty of Natural and Agricultural Sciences, the
University of Western Australia, Crawley, WA, 6009, Australia
Abstract: The expressions of PDF1.2, a key gene in the jasmonic acid (JA)/ethylene (ET)-dependent signaling
pathway, were measured in oxalate oxidase (OXO) transgenic and non-transgenic oilseed rapes (Brassica napus)
by RT-PCR. The results showed that the expression of PDF1.2 was up-regulated in different OXO transgenic
oilseed rape lines, which indicated that the mechanism of disease resistance to Sclerotinia sclerotiorum was
related to the induction of the JA/ET-dependent signaling pathway.
Key words: oilseed rape (Brassica napus); Sclerotinia sclerotiorum; PDF1.2
由核盘菌引起的菌核病(Sclerotinia sclerotiorum)
是世界范围内多种作物的严重病害(刘胜毅等1998;
黄剑华等 2001; 冀瑞琴等 2006)。培育抗病品种
是防治菌核病的主要措施, 但目前尚未见有高抗油
菜新品种的报道。菌核病的致病作用与很多因素
有关, 其分泌的毒素草酸是一个主要因素(刘胜毅等
1998)。早在 1887年, de Bary就认为草酸与菌核
病的发生密切相关。随后, 这一观点被大量的研究
者从各个方面得到证实, 如草酸通过降低寄主组织
中pH值而促进病菌水解酶降解寄主组织(Marciano
等 1983), 抑制与抗性有关的酶和光合作用酶的活
性或合成(刘胜毅等1998), 与钙结合生成草酸钙晶
体而堵塞导管或维管束(刘胜毅等1998)等机制而产
生致病作用。
已有研究表明草酸氧化酶(oxalate oxidase,
OXO)能降解草酸, 并生成H2O2 (Dong等 2008)。
转OXO基因油菜的抗草酸能力已从多方面得到证
实(Thompson等 1995; Donaldson等 2001; Hu等
2003; Livingstone等 2005)。OXO降解草酸生成的
H2O2还是活性氧类的一种, 它既具有直接的抑菌活
性, 又可作为信号分子诱发植物产生防御反应, 增
强植物的抗性。H2O2的产生是许多植物与病原物
互作中产生过敏反应的一个早期事件(Hammond-
Kosack和 Jones 1996; Lamb和Dixon 1997), 与诱
导病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins, PR)
和植保素合成等有关(Hammond-Kosack和 Jones
1996)。而过敏反应和 PR蛋白产生是植物防御反
应中水杨酸依赖性信号途径的重要特征, 但H2O2的
产生与防御反应的另一重要信号途径, 即茉莉酸
(jasmonic acid, JA)/乙烯(ethylene, ET)依赖性信号
途径的关系尚不清楚。
研究已表明PDF1.2 (plant defensin 1.2)和Thi2.1
(thionin 2.1)基因特异地受 JA或 ET诱导, 可作为
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JA/ET依赖性信号途径的标记基因(Penninckx等
1998)。探明 PDF1.2基因的表达变化则可明确转
OXO油菜产生对菌核病的抗性是否与防御反应信
号转导途径中JA/ET依赖性信号途径的激活有关。
本文以T6代转小麦OXO基因油菜与转基因受
体油菜 ‘84039M’为材料, 研究PDF1.2基因的表达
差异, 以此推测转基因油菜抗病性增强与防御反应
中 JA/ET依赖性信号途径的激活之间的关系。
材料与方法
本课题组曾以农杆菌介导方法将小麦OXO导
入甘蓝型油菜(Brassica napus L.) ‘84039M’品系中,
并通过加代扩繁获得了T6代转OXO基因油菜株系
(Dong等 2008)。本研究中, 以 T6代转OXO基因
油菜株系和未转化对照株系为试验材料进行研究。
T6代转OXO油菜种子在25 ℃催芽后, 选露白
种子播于 9 cm×9 cm的钵中, 温室中土培(土:蛭石 =
5:1), 光周期为: 16 h光照(25 ℃)/8 h黑暗(20 ℃), 相
对湿度70%。当油菜幼苗长到四叶一心期用CTAB
法提取叶片DNA, 以OXO引物进行 PCR扩增, 筛
选阳性植株。OXO 引物序列如表 1。
RT-PCR检测时, 分别以转OXO基因株系和未
转化对照株系叶片为材料, 采用TRIZOL (Carlsbad,
CA)试剂提RNA (参照TRIZOL说明书进行), 采用
SuperscriptTM II (Invitrogen)合成第一链 cDNA, 然
后以第一链 cDNA为模板, 不同基因的引物进行
PCR扩增, 同时将ACTIN基因作为内参基因进行半
定量 PCR, 相关参数见表 1。
表 1 RT-PCR中相关基因的引物、退火温度及 PCR循环数
Table 1 The primers, annealing temperature and the number of PCR cycles for RT-PCR
基因 NCBI序列号 引物 序列(5→3) 产物长度 /bp 退火温度 /℃ 循环数 /个
ACTIN AF111812 F TCTGGCATCACACTTTCTACAACGAGC 669 6 6 2 2
R CAGGGAACATGGTCGAACCACC
OXO AY884024 F GTCCTGCAGCATGGGGTACTCCAAAAC 692 5 5 2 2
R CCGTCGACTTAAAACCCAGCGGCAAAC
PDF1.2 AY884023 F TCATGGCTAAGTTTGCTTCC 475 5 5 2 2
R CAAACCAACACAAACATATCTGC
实验结果
1 T6代转OXO植株PCR检测
经过 5年连续筛选, 随机抽取T6代转OXO油
菜 3个株系(OX14、OX10和OX1)各 5棵植株的
单株幼苗, 抽提幼苗叶片的DNA, 以其作为模板进
行 PCR检测, 以含有OXO的重组载体质粒为阳性
对照, 以未转化植株为阴性对照, 筛选转基因阳性
植株。结果如图 1。以 PCR检测阳性植株进行后
续的研究。
图 1 OXO转基因植株的 PCR检测
Fig.1 PCR identification of OXO transgenic plants
M: Marker; c1: 阳性对照; c2: 阴性对照; 1~5: OX14; 6~10: OX10; 11~15: OX1。
2 小麦OXO基因在油菜植株内正常转录
通过RT-PCR的方法检测了T6代转OXO基因
PCR检测阳性植株中OXO的表达, 以未转化植株为
阴性对照, 结果表明3个转基因株系中OXO基因均
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有不同程度的表达, 在OX14中表达量最高, OX10
次之, OX1中表达量最低, 而对照中未见表达。
用, 该结论已经得到证实(Dong等 2008); 二是通过
降解草酸产生的H2O2起作用。Dong等(2008)用
DAB染色方法检测转OXO基因油菜中H2O2含量时,
发现转基因油菜接菌后H2O2产生量显著高于未转
化对照。有资料表明OXO引起的抗病性与H2O2 介
导的防御反应有关(Wei等1998; Dunwell等2000)。
但通过何种途径介导抗病性尚不清楚。
本研究发现在 3 个 T 6代转 O X O 基因株系
OX1、OX10和OX14中, PDF1.2都有明显的上调
表达, 而且PDF1.2的表达量与OXO的表达量呈正
相关, 在OXO表达量最高的OX14株系中 PDF1.2
表达量也最高, 反之, 在OXO表达量最低的OX1株
系中 PDF1.2表达量也最低(图 2、3)。在对OX1、
OX10和OX14 抗病性鉴定试验中发现, OX14的抗
病能力也高于其它两个株系, OX1的抗病能力最低
(Dong 等 2008)。基于 PDF1.2是 JA/ET依赖性信
号途径的标记基因, 我们由此推测转OXO基因油菜
对菌核病的抗性增强不仅与降解草酸、解除草酸
的毒害有关, 而且与草酸降解过程中产生的H2O2诱
发了 JA/ET依赖性信号途径的激活有关。
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3 JA/ET依赖性信号途径中防御反应相关基因
PDF1.2的表达分析
本研究以转OXO基因油菜和未转化对照为材
料, 采用RT-PCR方法检测了 JA/ET依赖性信号途
径中防御反应相关基因 PDF1.2的表达变化情况。
结果发现, 在转基因株系中, PDF1.2在所检测的 3
个转基因株系中都有明显的上调表达(图 3), 在
OX14中上调表达极显著, OX1中上调表达较弱。
图 3 RT-PCR分析 JA/ET依赖性信号途径中防御
反应相关基因 PDF1.2在转OXO基因株系
与野生植株中表达的差异
Fig.3 Expressions of defense response gene PDF1.2
in JA/ET-dependent signaling pathway was
measured by RT-PCR in OXO transgenic
plants and wild plants
1 ~ 3 分别为转基因株系 O X1 4、O X1 0 和 O X 1。
讨　　论
在先前的研究中, 我们对 PCR检测为阳性的
T6代转OXO油菜株系进行了离体叶和田间抗病鉴
定, 结果发现转OXO油菜对菌核病的抗性显著增
强。我们推测转OXO油菜抗病机理可能存在两方
面的作用: 一是通过降解草酸, 解除草酸的毒害作
图 2 RT-PCR 分析OXO基因在转基因株系
与野生植株中的表达差异
Fig.2 RT-PCR of OXO expression in OXO
transgenic plants and wild plants
1 ~ 3 分别为转基因株系 O X1 4、O X1 0 和 O X 1。
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