全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (7): 1157~1166　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0214 1157
收稿 2015-04-14　　修定 2015-06-08
资助 国家自然科学基金(31260064、31460059、31460179
和31460182)和云南省教育厅科研基金重大专项项目
(ZD2010004)。
* 通讯作者(E-mail: gongming63@163.com; Tel: 0871-
65516516)。
小桐子转录因子CBF基因的克隆及酵母表达载体的构建
王海波1,2, 王莎莎1, 邹竹荣1, 龚明1,*
1云南师范大学生命科学学院, 生物能源持续开发利用教育部工程研究中心, 云南省生物质能与环境生物技术重点实验室,
昆明650500; 2曲靖师范学院生物资源与环境科学学院, 云南曲靖655011
摘要: 高等植物不依赖ABA的低温信号转导途径中, 存在于细胞膜上的低温感受器通过ICE-CBF-COR级联响应将外界低
温信号传导至胞内, CBF转录因子是承接上游ICE类转录激活因子与下游COR类低温响应基因的关键环节。本文利用前期
获得的小桐子低温锻炼转录组数据, 克隆到了一条小桐子CBF基因的cDNA序列, 命名为JcCBF1 (GenBank登录号
KJ670147.1)。结果表明, 该cDNA序列全长1 034 bp, 完整开放阅读框729 bp, 编码242个氨基酸, 分子量为26.6 kDa, 理论等
电点为9.38, 具有CBF家族典型的AP2基序, 同时构建了其酵母表达载体, 为小桐子CBF转基因功能验证奠定基础。
关键词: 小桐子; 转录因子; CBF; 不依赖ABA的低温信号转导; 基因克隆; 表达载体构建
Molecular Cloning and Yeast Expression Vector Construction of the Transcrip-
tion Factor Encoding CBF from Jatropha curcas
WANG Hai-Bo1,2, WANG Sha-Sha1, ZOU Zhu-Rong1, GONG Ming1,*
1School of Life Sciences, Yunnan Normal University, Engineering Research Center of Sustainable Development and Utilization of
Biomass Energy of Ministry of Education, Key Laboratory of Biomass Energy and Environmental Biotechnology of Yunnan Prov-
ince, Kunming 650500, China; 2College of Biological Resource and Environmental Science, Qujing Normal University, Qujing,
Yunnan 655011, China
Abstract: Low temperature receptor present on the cell membrane can transfer environmental low temperature
signal to inner of cells through cascade response of ICE-CBF-COR in ABA-independent cold signal transduc-
tion pathway. CBF transcription factor is a key step to connect the upstream of ICE activating transcription fac-
tor and downstream of COR low temperature responsive genes. A gene, named JcCBF1 (GenBank accession
KJ670147.1) was cloned based on the chilling hardening transcriptome of Jatropha curcas. The full-length
cDNA of JcCBF1 was 1 034 bp, containing a 729 bp open reading frame. The ORF encoded a 242 amino acid
polypeptide with the molecular weight of 26.6 kDa and the pI value of 9.38. The JcCBF1 protein encompasses
conserved motif of AP2. Expression vectors of Saccharomyces cerevisiae were constructed, in order to lay the
foundation for CBF transgenic verification in J. curcas.
Key words: Jatropha curcas; transcription factor; CBF; ABA-independent cold signal transduction pathway;
gene cloning; expression vector construction
小桐子属大戟科(Euphorbiaceae)麻风树属
(Jatropha)能源植物(林娟等2004; 何璐等2010)。原
产热带美洲, 常作为优势种植物而形成纯群落, 在
我国多省份都有野生种分布(曾觉民2006; 张明生
等2005)。小桐子耐干旱贫瘠, 在干热河谷地区可
作为水土保持树种用于荒山造林 (潘志贤等
2008)。全株具有乳汁, 含多种药用成分可用作化
工、轻工原料。作为能源树种 , 其种子含油量
高、油质好, 可用作生物柴油的原料, 油饼中富含
蛋白质, 脱毒后可用于动物饲料, 综合利用前景广
阔 (王海燕等2010; 吴国江等2006)。
转录因子CBF/DREB1介导的低温信号途径
是目前研究的较为清楚的低温响应基因表达调控
网络。CBF蛋白(C-repeat binding factor)属于AP2/
EREBP家族DNA结合蛋白, 识别保守的5 bp核心
基序CCGAC。该基序也是脱水响应元件(dehydra-
植物生理学报1158
tion-responsive element, DRE)的核心基序, 常以单
拷贝或多拷贝形式广泛存在于低温调节基因
(cold-regulated, COR)的启动子区域。因此CBF又
称为DREB (DRE binding factor) 1转录因子, 在近
年来植物非生物胁迫研究中受到了广泛的关注,
成为最主要的研究热点(Zhou等2011)。从1997年
Stockinger等(1997)利用酵母单杂交法首次克隆出
拟南芥CBF1转录因子开始, 到目前为止, 已经有来
自约100种不同植物的不同CBF家族成员被克隆并
进行了功能验证及转基因研究, 如拟南芥发现4
个、番茄发现3个、桉树发现5个、甜樱桃发现3
个、杨树中发现4个等, 而在小桐子中关于CBF还
没有报道。本研究利用我们实验室测序的小桐子
低温锻炼转录组(Wang等2014)及数字基因表达谱
(Wang等2013)数据, 克隆到一条小桐子CBF基因的
cDNA序列, 并构建了其酵母表达载体, 为小桐子
CBF基因植物表达载体的构建、转基因研究及抗
冷性机制的阐明奠定了基础。
材料与方法
1 实验材料及处理
供试小桐子(Jatropha curcas L.)种子取自云南
省楚雄州元谋县。选取饱满的小桐子种子 , 用
1.5% CuSO4消毒20 min, 无菌水漂洗5次, 于26 ℃
的恒温培养箱中吸涨24 h (李忠光和龚明2010)。
将吸涨的种子在无菌水中漂洗3次, 播于垫有5层
用无菌水湿润滤纸的白磁盘(24 cm×16 cm)中, 于
相对湿度(RH) 75%、26 ℃/20 ℃、16 h/8 h光周期
的恒温培养箱中萌发5 d。将发芽的种子播于消毒
的培养土中, 并于同上的恒温培养箱中生长15 d至
第2片真叶展开。取第2片真叶材料, 液氮速冻后
置于–80 ℃冰箱中用于RNA的提取。
2 菌株与主要试剂
大肠杆菌DH5α与酵母菌INVSc1菌株(基因型
为: MATα his3D1 leu2 trp1-289 ura3-52 MATα
his3d1 leu2 trp1-289 ura3-52)由本实验室保存; 总
RNA提取试剂TransZol Up、DNase I、TransStart
Taq DNA Polymerase、2×EasyTaq PCR SuperMix
(+dye)、TransScript Two-Step RT-PCR SuperMix、
琼脂糖凝胶回收试剂盒EasyPure Quick Gel Ex-
traction Kit、质粒小量提取试剂盒EasyPure Plas-
mid MiniPrep Kit、TA克隆载体pEASY-T1 Cloning
Kit、Trans 2K Plus II DNA Marker等均购自北京全
式金生物技术有限公司; 酵母表达载体pYES2购自
Invitrogen公司(酵母表达载体pYES2.1/V5-His-TO-
PO在大肠杆菌中具有氨苄青霉素筛选标记, 在酵
母菌中为尿嘧啶缺陷型筛选标记, 插入基因前后
分别为GAL1启动子与CYC1终止子, 在酵母细胞
中培养时受到葡萄糖抑制及半乳糖激活); HindIII
和XhoI限制性内切酶购自大连宝生物公司; 引物
合成和测序由深圳华大基因有限公司完成。
3 实验方法
3.1 总RNA的提取及cDNA第一链的合成
取0.1 g小桐子叶片材料, 利用TransZol Up试
剂提取总RNA, 并利用DNase I消化RNA中的基因
组DNA, 得到纯化的总RNA。以Anchored Oli-
go(dT)18为逆转录引物, 利用TransScript Two-Step
RT-PCR SuperMix合成第一链cDNA。
3.2 小桐子JcCBF1基因全长cDNA的克隆
通过NCBI检索得到拟南芥的CBF家族基因全
长mRNA序列, 以我们高通量测序得到的小桐子低
温锻炼转录组测序的45 251条Unigenes为数据库,
进行本地Blast, 检索到与拟南芥CBF基因相似性最
高的Unigenes序列CL4632.Contig1_JC-CK_1A。
以此序列为基础设计全长扩增引物, 并送深圳华
大基因合成。引物序列为, 上游F: 5 AGAGAAG-
GTCTTGTGTTGTG 3; 下游R: 5 TAATAATCGTA-
ATCGTCATC 3。
以3.1节反转录cDNA为模板, 使用热启动双
封闭DNA聚合酶TransStart Taq DNA Polymerase进
行PCR扩增, 扩增条件为: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s,
51 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 35个循环; 72 ℃ 20 min。
扩增完成后使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产
物, 回收目的基因条带(1 034 bp)。将目的基因片
段与克隆载体pEASY-T1连接, 命名为pEASY-T1-
JcCBF1, 转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 涂LB抗
性平板(LB-Amp++IPTG+X-gal), 过夜生长, 挑取白
斑克隆, 以基因全长引物进行菌落PCR验证, 送深
圳华大基因公司以通用引物M13进行双向测序。
测序正确并确定没有点突变, 挑取阳性克隆菌落,
摇菌并提取克隆质粒pEASY-T1-JcCBF1。
3.3 小桐子JcCBF1基因的生物信息学分析
将测序正确的cDNA序列利用BioEdit软件翻
译成氨基酸序列。利用在线工具ProtParam计算蛋
王海波等: 小桐子转录因子CBF基因的克隆及酵母表达载体的构建 1159
白质的理论分子量、等电点等基本参数。利用
Spidey软件进行克隆cDNA序列与基因序列(小桐
子基因组数据库http://www.kazusa.or.jp/jatropha/)
比对以确定基因内含子与外显子的结构。利用
NCBI CDD工具进行结构域与功能元件的鉴定。
经过转录组Blast检索到的小桐子CBF序列, 利用
ClustalX进行序列相似性比对, 然后用MEGA 4.0
软件通过邻接法构建系统进化树, 并采用泊松法
进行检验。利用PlantCARE软件进行启动子顺式
作用元件的分析。利用Phyre2进行蛋白质三维结
构的同源建模, 并利用VMD软件显示其三维空间
结构。
3.4 小桐子JcCBF1基因酵母表达载体的构建
利用HindIII与XhoI双酶切质粒pEASY-T1-Jc-
CBF1与酵母表达载体pYES2, 切胶回收JcCBF1片
段与pYES2的大片段, T4 DNA连接酶22 ℃连接5
h, 命名为pYES2-JcCBF1, 转化大肠杆菌DH5α感受
态细胞, 涂LB-Amp＋平板, 过夜生长, 挑取克隆以
基因全长引物进行菌落PCR验证, 经过验证的阳性
克隆送深圳华大基因测序, 确定没有点突变, 提取
重组酵母表达质粒pYES2-JcCBF1, LiAc法转化酿酒
酵母野生型菌株INVSc1, 命名为INVSc1-pYES2-Jc-
CBF1, 并进行酵母菌落PCR验证以确定阳性克隆。
实验结果
1 小桐子JcCBF1基因全长cDNA的克隆
以3.1节反转录cDNA为模板, 利用基因全长引
物, 扩增JcCBF1基因cDNA全长序列。结果显示, 扩
增得到约1.1 kb的条带(图1-A), 与预期大小一致。
将目的条带切胶回收后与T/A克隆载体pEASY-T1
连接, 命名为pEASY-T1-JcCBF1, 并转化大肠杆菌
DH5α, 菌落PCR验证阳性克隆(图1-B)。对测序正
确没有点突变的阳性克隆, 挑取单菌落摇菌, 提取
重组质粒pEASY-T1-JcCBF1 (图1-C)。
2 小桐子JcCBF1基因的生物信息学分析
经过克隆测序的JcCBF1基因的cDNA序列全
长为1 034 bp, 包含完整的开放阅读框729 bp, 编码
242个氨基酸(图2)。经过ProtParam分析, 该基因编
码的蛋白质分子量为26.6 kDa, 理论等电点为9.38。
Spidey软件分析显示小桐子JcCBF1基因不含内含
子, 这与拟南芥的报道一致(Stockinger等1997)。
利用NCBI数据库检索得到拟南芥中目前发
现的4个C B F基因m R N A序列 , 分别为A B V-
27084.1、ABV27116.1、ABV27152.1和ABV-
27182.1。利用以上序列对我们实验室测序的小桐
子低温锻炼转录组数据进行本地Blast检索, 得到
相似性序列。排除没有开放阅读框(ORF)的序列
与推导氨基酸序列中没有AP2基序(CBF转录因子
共有的DNA结合基序)的序列, 共得到9条小桐子
CBF基因Unigenes序列, 其基本信息列于表1。由
表1可知, 所有鉴定的9条Unigenes序列都包含一个
CBF家族蛋白典型AP2基序, 且长度均为约60个氨
基酸残基, 属于AP2/ERF转录因子家族。
通过邻接法构建小桐子CBF家族蛋白进化树
图1 小桐子JcCBF1基因cDNA克隆的琼脂糖凝胶电泳图
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of cDNA amplification for JcCBF1 in J. curcas
A: PCR扩增; B: 菌落PCR验证; C: 重组质粒pEASY-T1-JcCBF1。
植物生理学报1160
图2 小桐子JcCBF1基因的cDNA与推导的氨基酸序列
Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequence of JcCBF1 cDNA in J. curcas
起始与终止密码子用下划线标注。
表1 小桐子CBF家族Unigene序列
Table 1 Unigene sequences of CBF family in J. curcas
Unigenes序列 序列长度/bp 开放阅读框起止范围/bp 氨基酸数目/个 AP2基序范围/aa
CL4632.Contig1_JC-CK_1A 1 306 98~826 (729) 242 37~97 (61)
CL4632.Contig2_JC-CK_1A 1 297 89~817 (729) 242 37~97 (61)
CL4632.Contig3_JC-CK_1A 1 291 98~811 (714) 237 37~96 (60)
CL4632.Contig4_JC-CK_1A 1 281 89~802 (714) 237 37~96 (60)
Unigene9000_JC-CK_1A 747 47~688 (642) 213 42~102 (61)
Unigene1945_JC-CK_1A 1 202 41~1 117 (1 077) 358 162~221 (60)
Unigene10086_JC-CK_1A 845 94~831 (738) 245 57~117 (61)
Unigene4737_JC-CK_1A 1 592 310~1 434 (1 125) 374 76~134 (59)
Unigene7722_JC-CK_1A 1 059 115~1 056 (942) 313 111~169 (59)

并标注其AP2基序的分布。从图3中可以看出, 9条
序列分属于5个类型, CL4632.Contig1_JC-CK_1A
与CL4632.Contig2_JC-CK_1A氨基酸序列长度相
同, 仅存在两个氨基酸差异, 且AP2基序位置及序
列相同, 推测两者应该属于同一个小桐子CBF转录
因子蛋白 , 而CL4632.Contig3_JC-CK_1A 与
CL4632.Contig4_JC-CK_1A也存在同样的情况, 属
于小桐子的另一个CBF转录因子蛋白。而其他的5
种小桐子CBF转录因子蛋白在序列上没有很高的
同源性, AP2基序分布也不一致, 但其AP2基序序列
王海波等: 小桐子转录因子CBF基因的克隆及酵母表达载体的构建 1161
同源性却很高。另外, 根据目前已经克隆和鉴定
的其他高等植物CBF家族蛋白的序列长度都分布
在200~250个氨基酸残基, 如拟南芥已经鉴定的
CBF1~4氨基酸数目分别为213、216、216和224。
结合与拟南芥CBF的序列相似性分析结果, 推测我
们鉴定到的9条小桐子CBF转录因子中, CL4632.
Cont ig1_JC-CK_1A与CL4632.Cont ig2_JC-
CK_1A、CL4632.Contig3_JC-CK_1A与CL4632.
Contig4_JC-CK_1A、Unigene9000_JC-CK_1A、
Unigene10086_JC-CK_1A应该属于小桐子CBF家
族成员。而另外的3条Unigenes序列虽然包含AP2
基序, 但可能属于其他家族的蛋白。
通过序列相似性分析表明, 鉴定的9条小桐子
CBF Unigenes序列除AP2基序区域外没有序列同
源性, 将鉴定的9条小桐子CBF Unigenes序列与拟
南芥的4条CBF序列的AP2基序区域氨基酸序列进
行多序列比对。由图4可以发现, AP2基序区域都
由3条反平行的β折叠与1条α螺旋构成, 参与调控
基因的上游启动子区结合, 3条β折叠氨基酸残基
数目分别为4、8、8, 而1条α螺旋氨基酸残基数目
为16, 且该数目在不同物种中相对保守。在β折叠
1中, 第Val1、Arg2及Arg4位氨基酸残基相对保守;
在β折叠2中, 第Glu5与Arg7位氨基酸残基相对保守;
β折叠3中, 第Arg2、Trp4、Leu5、Gly6、Thr7位氨基
酸残基相对保守; 而在α螺旋中, 第Ala4、Ala5、
Ala7、Asp9、Ala11、Ala12位氨基酸残基相对保
守。Stockinger等(1997)报道, CBF AP2基序的第2
条β折叠的Val3、Glu5及Glu8起着识别特异DNA顺
式作用元件的作用, 且Glu8的保守性较差, 所起作
用小于Val3。但多序列比对发现, 在我们鉴定的
CL4632.Contig1_JC-CK_1A、CL4632.Contig2_JC-
CK_1A、CL4632.Contig3_JC-CK_1A及CL4632.
Contig4_JC-CK_1A中Val3位置被Ala3替换, 两者同
样属于非极性氨基酸, 但Glu5的保守性最强, 在识
图3 小桐子CBF家族进化分析及AP2基序分布
Fig.3 AP2 motif distribution and phylogenetic anslysis of CBF family in J. curcas
黑色长方形表示AP2基序的位置与长度。
图4 小桐子CBF AP2基序氨基酸序列与拟南芥的多重序列比对
Fig.4 Sequence alignment comparison of CBF AP2 motif in J. curcas with Arabidopsis
植物生理学报1162
别顺式作用元件中起更重要的作用。
利用克隆的小桐子JcCBF1基因cDNA序列,
对小桐子基因组数据库进行序列相似性检索, 得
到该基因编码框上游2 000 bp的启动子序列, 并结
合下游729 bp的编码框序列进行该基因的启动子
序列分析。结果(图5)显示, 该序列具有真核生物
典型启动子结构特征, 在翻译起始密码子上游不
同位置上分别存在着多达19个TATA-box、10个
CAAT-box、基因核心启动子序列CACATG (用A4
表示)以及启动子重复序列ACAATT (分别用B1和
B2表示)。此外, 还含有众多应答胁迫与激素信号
元件(图5-A), 如响应MYC的调控元件CATGTG
(用A1表示)、响应MYB的调控元件PyAACT/GC
(分别用C1、C2、C3、C4和C5表示)、响应CBF上
图5 小桐子JcCBF1基因启动子序列分析
Fig.5 Promoter analysis of JcCBF1 gene in J. curcas
A: 小桐子JcCBF1基因上游启动子调控元件序列; B: 小桐子JcCBF1基因上游启动子调控元件结构分布。
王海波等: 小桐子转录因子CBF基因的克隆及酵母表达载体的构建 1163
游转录激活因子ICE的结合位点CAATTG与CA-
CATG (用A2和A3表示), 说明小桐子JcCBF1基因
可能参与多种逆境胁迫与激素的应答(图5-B)。
利用Phyre 2.0服务器构建了小桐子CBF1蛋白
AP2基序三维空间结构。由图6-A可以看出, 其包
含典型的AP2基序结构模型, 经过β折叠-β折叠-β
折叠-α螺旋二级结构顺序排列, 3条反向平行的β折
叠构成主要的DNA结合区域, α螺旋在外侧维持其
空间结构, 其中第2条β折叠的52位Glu残基起主要
的DNA结合作用。AP2基序主要结合在DNA的大
沟中, 并且该基序的3条反向平行β折叠的走向基
本与DNA分子的中轴平行(图6-B)。CBF转录因子
主要通过AP2基序与低温、干旱诱导基因启动子
中的CRT (TGGCCGAC)/DRE (TACCGACAT)顺式
作用元件结合, 从而激活基因的转录, 其核心碱基
序列为CCGAC。推测位于AP2基序第2条β折叠2
中部的Glu52残基侧链酸性羧基–COO-基团与该
DNA序列的中心碱基G的–NH4
+通过盐键结合, 从
而启动COR基因的转录。
3 小桐子JcCBF1基因酵母表达载体的构建
将pEASY-T1-JcCBF1重组克隆质粒与酵母表
达空质粒pYES2利用HindIII与XhoI双酶切, 切胶回
收目的基因片段与pYES2载体片段 , 并通过T4
DNA连接酶连接 , 得到重组酵母表达质粒pY-
ES2-JcCBF1 (图7-A和B), 转化DH5α感受态细胞,
用基因全长引物进行菌落PCR验证, 得到了预期的
分子量条带(图7-C), 送深圳华大基因测序确定没
有点突变, 说明重组酵母表达质粒pYES2-JcCBF1
已经构建成功。提取重组酵母表达质粒pYES2-Jc-
CBF1 (图7-D), 转化酿酒酵母INVSc1, 利用基因全
长引物进行酵母菌落PCR检测显示该重组质粒已
经成功转化酵母(图8), 为后续植物表达载体的构
建与抗逆性功能研究奠定了基础。
讨　　论
植物不依赖ABA的低温信号转导途径主要集
中在CBF基因调控的抗冷机制, 以拟南芥为研究对
象, 其分子调控模式已经大致阐明。CBF类转录因
子是感受上游传递的低温信号, 并将信号向下游
传递的重要调控分子。拟南芥CBF转录因子家族
包括4个成员 , 即CBF1 (Stockinger等1997)、
CBF2、CBF3 (Gilmour等1998)和CBF4 (Haake等
2002), 属于DNA结合蛋白AP2/ERF家族, 都含有
AP2 DNA基序 (Stockinger等1997)。CBF1与CBF2
同源性81%、CBF1与CBF3同源性84%、CBF1与
图6 小桐子JcCBF1基因AP2基序空间结构及与DNA结合模式
Fig.6 3D structure of AP2 motif and DNA binding model of JcCBF1 in J. cucas
A: AP2基序结构图; B: AP2基序与DNA序列结合模式, 其中CCGAC表示CBF转录因子与低温、干旱诱导基因启动子结合的核心碱基
序列。
植物生理学报1164
图8 转pYES2-JcCBF1重组酵母INVSc1的PCR验证
Fig.8 PCR identification of the pYES2-JcCBF1
recombinant INVSc1
CBF4同源性64%, 但4种CBF氨基酸序列中组成
AP2基序的氨基酸的序列相似性达到了91%~94%
(Haake等2002)。来自拟南芥、油菜、小麦、黑麦
和番茄的CBF蛋白还含有两段保守多肽序列, 即
PKK/RPAGRxKFxETRHP序列, 位于AP2基序上
游, 可能与CBF的运输有关; DSAWR序列位于AP2
基序下游, 其功能未知(Jaglo-Ottosen等2001)。经
DNA序列分析表明, CBF1、CBF2及CBF3基因的
读码框中均不含内含子, 启动子中都有核心序列
CANNTG (被bHLH蛋白基序结合)与一个重复序
列ACAATTANNNACAATTT, 且位置基本相同, 这
意味着极有可能是核心启动子序列(Gilmour等
1998)。另外, 启动子中还含有其他核心转录激活
因子结合位点, 如ICE盒(ICEr1, 核心序列: TTCA-
CACGTGACTC; ICEr2, 核心序列: TCTAGA;
ICEr3, 核心序列: HACACGT; ICEr4, 核心序列:
HCCACGT) (H指A/C/T) (Induction of CBF expres-
sion region1 and 2)、MYBRS及MYCRS等。
CBF基因本身是低温诱导的, 即CBF的表达受
到上游调控。其中ICE是主要的CBF转录激活因
子。作为CBF正调控因子, ICE属于MYBR/MYCR
类家族, 都含有bHLH (basic helix-loop-helix) DNA
结合基序, 是直接结合CBF启动子中ICE盒并调控
CBF表达的上游信号(Ruelland等2009)。另外CBF
的表达还受到ZAT12 (锌指结构蛋白, 负调控因子)
(Vogel等2005)、STRS (负调控) (Kant等2007)、
FVE (负调控) (Kim等2004)、FIERY2 (负调控)
(Xiong等2002)、LOS4 (正调控) (Gong等2002)以
及同家族蛋白如拟南芥CBF2 (负调控) (Novillo等
2004)等因子的调控。Yamaguchi-Shinozaki等
(1992)采用示差筛选法, 鉴定出CBF转录因子作用
的下游COR (cold responsion)基因的启动子中存在
的9 bp (TACCGACAT)干旱应答DRE元件。同时,
Baker等(1994)从拟南芥低温应答基因COR15A的
启动子中鉴定到与DRE极为相似的CRT元件(TG-
GCCGAC), CRT/DRE元件位于COR基因启动子中,
植物低温诱导后, CBF基因表达产物的AP2基序与
CRT/DRE元件结合, 激活COR基因表达, 从而激活
一系列抗冷相关代谢途径蛋白的表达。
图7 pYES2-JcCBF1重组质粒的构建
Fig.7 Recombinant plasmid construction of pYES2-JcCBF1
A: HindIII与XhoI双酶切目的基因片段; B: HindIII与XhoI双酶切pYES2; C: 重组质粒转化DH5α后菌落PCR验证; D: 提取的重组质粒
pYES2-JcCBF1。
王海波等: 小桐子转录因子CBF基因的克隆及酵母表达载体的构建 1165
CBF的表达受到多种外界信号与细胞内的转
录激活因子调节, 且不同的CBF其表达动力学也完
全不同。在拟南芥中, 低温锻炼15 min即可诱导
CBF1~3的大量表达, 2 h达到表达的高峰, 之后开
始下降, 但表达量始终大于常温对照植株(Gilmou
等1998)。另外, CBF基因的表达还因所在器官或
生长阶段的不同而有所差异。Zhao等(2009)对番
茄的不同器官进行CBF表达峰值的研究发现, 番茄
CBF1在幼苗期受到低温胁迫后 , 在2 h时出现
CBF1的表达高峰期, 而绿熟期的果实在受到低温
胁迫后, 在2与16 h各出现一个表达高峰。葡萄的
CBF1~3在低温条件下, 新生组织中较老组织中表
达量高(Xiao等2006)。部分研究还报道, CBF基因
的表达还受到植物生物钟(Fowler等2005)、光照
条件(Kim等2002)以及水杨酸(张俊环等2014)等的
影响。本研究中, 我们克隆的小桐子CBF家族Jc-
CBF1基因, 根据DEG分析结果显示, 在12 ℃低温
锻炼条件下, 其表达量随着低温时间的延长表现
出先升高后降低的变化趋势, 且低温锻炼12 h时就
达到了表达高峰, 之后逐渐下降(Wang等2014), 这
也与许多文献报道的CBF基因表达高峰出现在12
h内的结论相一致(Gilmour等1998)。
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