全 文 ：植物生理学通讯 第 46 卷 第 3 期, 2010 年 3 月210
收稿 2009-12-07 修定 　2010-01-08
资助 科技部国家基础条件平台建设基金(2004DKA30430)和
湖南农业大学人才引进基金(2 003Y J007 )。
* 通讯作者(E-mail: xiongxingyao@yahoo.cn; Tel: 0731-
8 4 6 3 5 2 9 5 )。
SRAP分子标记技术分析鱼腥草居群的遗传多样性
钟军 1,3, 王坤 2, 仇萍 3, 曾维军 3, 熊兴耀 4,*
1 湖南农业大学农学院, 长沙 410128; 2 湖南农业大学生命科学与技术学院, 长沙 410128; 3 湖南正清制药集团股份有限公司,
湖南怀化 418000; 4 湖南农业大学园林园艺学院, 长沙 410128
提要: 在正交设计对鱼腥草SRAP-PCR反应体系进行优化的基础上, 分析鱼腥草居群的遗传多样性的结果表明: 最佳的SRAP-
PCR反应体系为每 10 μL溶液中含有 0.2 mmol·L-1 dNTPs、20 ng模板DNA、30 ng·μL-1 引物、0.5 U Taq聚合酶和 2 mmol·L-1
MgCl2; 最佳的复性温度和循环次数为 53 ℃和 35次; 从 340个引物组合中筛选出条带清晰、多态性好的 118个引物组合,
并扩增出7 582个谱带, 多态性谱带有6 590个, 多态率为86.92%; 在这些谱带中发现19条特异性的谱带, 其中居群ZY42占
31.58%; 聚类分析结果显示鱼腥草居群存在非常丰富的遗传变异。
关键词: 鱼腥草; 居群; SRAP; 遗传多样性
An Analysis of Genetic Diversity of Houttuynia cordata Thunb. Population by
SRAP Molecular Markers
ZHONG Jun1,3, WANG Kun2, QIU Ping3, ZENG Wei-Jun3, XIONG Xing-Yao4,*
1College of Agriculture, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2College of Bioscience and Technology, Hunan
Agricultural University, Changsha 410128, China; 3Hunan Zhengqing Pharmaceutical Co., Ltd., Huaihua, Hunan 418000, China;
4College of Horticulture and Gardening, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China
Abstract: On the basis of optimized orthogonally SRAP-PCR amplification system, genetic diversity of Houttuynia
cordata population was studied. The results showed that the optimum SRAP-PCR reaction system contained
0.2 mmol·L-1 dNTPs, 20 ng template DNA, 30 ng·μL-1 primers, 0.5 U Taq DNA polymerase and 2 mmol·L-1
MgCl2 in a total volume of 10 μL and the optimal annealing temperature and cycling times was 53 ℃ and 35
times. 118 effective primer-combinations were screened from 340 primer-combinations. A total of 7 582 bands
were detected with those primers and 6 590 of them were polymorphic. The percentage of polymorphy was 86.92%.
Among those bands, 19 bands had specificity and ZY42 population was 31.58%. The cluster results showed
that the genetic differentiation was very abundant, and the SRAP molecular marker was used to identify the
genetic differences of H. cordata population.
Key words: Houttuynia cordata; population; SRAP; genetic diversity
遗传多样性分析可在表型、染色体、等位酶
和DNA序列等层次上进行, 它们可以揭示群体的变
异大小和遗传规律, 进而为群体的保护提供理论支
持。相关序列扩增多态性(sequence-related ampli-
fied polymorphism, SRAP)分子标记最早是在芸薹
属作物中开发出来的(Li 和 Quiros 2001)。此标记
通过独特的双引物设计对基因开放阅读框(open
reading frames, ORFs)的特定区域进行扩增, 其中上
游引物长 17 bp, 对富含 CCGG 的外显子区域进行
特异扩增; 下游引物长 18 bp, 对富含AATT的内含
子区域、启动子区域进行特异扩增。而且该标记
具有简便、高效、产率高、高共显性、重复性
好等特点。因此, 自诞生以来, 它已成功地用于遗
传多样性分析(Ferriol 等 2003)、遗传图谱的构建
(林忠旭等 2003)、重要性状的标记以及相关基因
的克隆和定位(Li 和 Quiros 2002)。
鱼腥草属三白草科蕺菜属是宿根性多年生草
本植物。主要分布于我国中部、东南及西南部各
省区, 东起台湾, 西南至云南、西藏, 北达陕西、
甘肃, 尤以四川、湖北、湖南、江苏等省居多。
常生于海拔 300~2 600 m的山坡潮湿林下、路旁、
植物生理学通讯 第 46 卷 第 3 期, 2010 年 3 月 211
田埂及沟边。鱼腥草长期以来一直依靠采挖野生
资源, 而且随着人们对资源的掠夺和对生境的破坏,
生境也逐渐片断化, 物种基因库迅速萎缩, 造成遗
传多样性下降(钟军等 2009)。本文用 SRAP 标记
分析了我国鱼腥草分布区的16个居群的遗传多样
性以及各居群之间的亲缘关系, 以揭示其变异规律
和检测鱼腥草种质资源的多样性, 供合理利用鱼腥
草时参考。
材料与方法
居群材料来自湖南怀化正清药业股份有限公
司鱼腥草资源圃收集的材料(表 1)。于2009年8月
6 日取鱼腥草(Houttuynia cordata Thunb.), 共 16 个
样品, 样品放在冰盒中带回实验室, 存放在-80 ℃
冰箱中备用。
和 0.4 mmol·L-1; (2)模板 DNA 的水平分别为 10、
20、30 和 40 ng; (3)引物的水平分别为 15、22.5、
27.5和 30 ng·μL-1; (4) Taq聚合酶的水平分别为 0.5、
1.0、1.5、和 2.0 U; (5) Mg2+ 浓度的水平分别为
0.5、1.0、1.5 和 2.0 mmol·L-1。而对 2 个扩增条
件的影响因素分别设置3个水平: 复性温度的水平
分别为 47、50 和 53 ℃; 循环次数的水平分别为
30、3 5 和 4 0 次。
PCR产物采用Sequi-Gen GT电泳仪, 8%聚丙
烯酰胺凝胶电泳分离。电泳缓冲液为 1×TBE, 电
泳时先在200 V电压下预电泳30 min, 上样后用150
V的电压电泳 1.5 h至溴酚兰到胶板的底部停止电
泳, 凝胶用 10% 的醋酸固定、水洗、银染、显影、
停影后, 相机拍照。
分析鱼腥草居群遗传多样性图谱时, 用 16 个
鱼腥草居群的 DNA为模板, 选用 17个 SRAP正向
引物和 20 个 SRAP 反向引物组合成 340 个引物对
(表 2), 筛选出扩增多态性好、条带清晰的引物并
以优化后的反应体系条件, 对鱼腥草居群进行遗传
多样性分析。
处理和分析数据时, 对SRAP扩增电泳图谱进
行统计, 记录的标准是在同一迁移率上, 有带记为
“1”, 无带记为 “0”, 计算鱼腥草居群间的遗传距离,
并将鱼腥草居群进行算术平均数的未加权对群法
(unweighted pair group method with arithmetic mean,
UPGMA)聚类。数据统计采用 DPS 软件进行。
实验结果
1 SRAP-PCR反应的正交优化
鱼腥草正交设计 SRAP-PCR 反应的扩增结果
(图 1)表明, 由于 dNTPs、Taq 聚合酶、引物、模
板DNA和Mg2+五个影响因素浓度组合的不同, 扩
增结果有明显差异。组合 1~4中扩增条带较弱, 效
果较差; 组合 5~8 条带都相对增强, 条带较为清晰,
但在这些组合中 Taq 聚合酶用量、引物、模板
DNA和变性剂用量各不相同, 其中组合8尽管Mg2+
的用量最高, 但 Taq 聚合酶的用量最低, 引物和模
板 DNA 的用量中等, 扩增的条带多、清晰, 重复
性较好; 组合 9~12扩增的条带较少; 组合 13~16没
有扩增出任何条带。据此, 我们认为最佳的SRAP-
PCR 反应体系为每 10 μL溶液中含有 0.2 mmol·L-1
表 1 试验中采用的鱼腥草来源
Table 1 Materials of H. cordata used in the experiment
编号 居群 采集地
1 ZY16 湖南攸县北平村
2 ZY02 湖南芷江野生白秆
3 ZY34 湖南攸县酒埠江
4 ZY12 湖南攸县菜花坪
5 ZY21 湖南攸县桐辛村
6 ZY05 湖南芷江红粗秆
7 ZY36 湖南茶陵
8 ZY42 湖南花亘县道三乡
9 ZY01 湖南杨村红秆
1 0 ZY28 湖南攸县桃水
1 1 ZY24 湖南礼陵泗汾
1 2 ZY43 湖南株洲五里牌镇
1 3 ZY18 湖南攸县李田村
1 4 ZY32 四川娥眉蕺菜
1 5 WYC 湖南怀化市杨村乡
1 6 SCY 四川雅安
SRAP引物、Taq酶、DNA分子量标准(marker)
和 dNTPs 等试剂购于湖南鹏程有限责任公司。
鱼腥草基因组DNA提取参照CTAB法(钟军和
李栒 2003)。
SRAP-PCR 反应体系的优化根据统计学原理,
分别采用 L16(45)和 L9(34)正交表设计实验(杨水云
2005), 其中对 5个扩增体系的影响因素分别设置4
个水平: (1) dNTPs 的水平分别为 0.1、0.2、0.3
植物生理学通讯 第 46 卷 第 3 期, 2010 年 3 月212
dNTPs、20 ng模板DNA、30 ng·μL-1 引物、0.5 U
Taq 聚合酶和 2 mmol·L-1 MgCl2。
此外, 依扩增条带的敏感性与特异性即条带强
弱及杂带的多少作 1~16 分计分, 条带数量丰富、
背景低、清晰度高的记为 16 分, 最差记为 1 分。
分数越高, 表示敏感性、特异性越好。将评分结
表 2 试验中采用的 SRAP 引物
Table 2 SRAP primers used in the experiment
正向引物序列(5 → 3) 反向引物序列(5 → 3)
F1: TGAGTCCAA ACCGGATA R1: GACTGCGTACGAATTAAT
F2: TGAGTCCAAACCGGAGC R2: GACTGCGTACGAATTTGC
F3: TGAGTCCAA ACCGGAAT R3: GACTGCGTACGAATTGAC
F4: TGAGTCCAAACCGGACC R4: GACTGCGTACGAATTTGA
F5: TGAGTCCAAACCGGAAG R5: GACTGCGTACGAATTAAC
F6: TGAGTCCAAACCGGACA R6: GACTGCGTACGAATTGCA
F7: TGAGTCCAAACCGGACG R7: GACTGCGTACGAATTCAA
F8: TGAGTCCAAACCGGACT R8: GACTGCGTACGAATTCAC
F9: TGAGTCCAAACCGGAGG R9: GACTGCGTACGAATTCAG
F10: TGAGTCCAAACCGGAAA R10: GACTGCGTACGAATTCAT
F11: TGAGTCCAAACCGGAAC R11: GACTGCGTACGAATTCTA
F12: TGAGTCCAAACCGGAGA R12: GACTGCGTACGAATTCTC
F13: TGAGTCCAAACCGGAAG R13: GACTGCGTACGAATTCTG
F14: TGAGTCCTTTCCGGTAA R14: GACTGCGTACGAATTCTT
F15: TGAGTCCTTTCCGGTCC R15: GACTGCGTACGAATTGAT
F16: TGAGTCCTTTCCGGTGC R16: GACTGCGTACGAATTGTC
F17: TAAACAATGGCTACTCAAG R17: CCAAAACCTAAAACCAGGA
R18: CACAAGTCGCTGAGAAGG
R19: GGCTTGAACGAGTGACTGA
R20: TTCTTCTTCCTGGACACAAA
图 1 鱼腥草正交设计 SRAP 反应条件的扩增
Fig.1 The amplification of SRAP reaction system from orthogonal design of H. cordata
M: DL2000 marker; 1~16: 试验组合编号(重复 2 次)。
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果进行极差分析和方差分析的结果表明: 各因素的
影响程度由强到弱依次为引物、dN TP s、模板
DNA、Taq 聚合酶、Mg2+, 且引物和 dNTPs 这两
个因素水平间差异达到了极显著水平, 模板DNA达
到了显著水平(表 3)。
复性温度决定PCR的特异性, 低温复性将增加
表 3 鱼腥草 SRAP-PCR 反应中各因素间的极差和方差分析
Table 3 The range and variance analysis of SRAP-PCR reaction system on factors of H. cordata
变异系数 引物 dNTPs 模板 DNA Taq 聚合酶 Mg2+ 误差 总和
最小值 4.612 5.333 4.854 6.789 5.918
最大值 9.845 8.482 7.605 8.114 7.024
极差 5.233 3.149 2.751 1.325 1.106
自由度 2 2 2 2 2 1 5 2 5
方差 216.295 125.547 91.831 13.081 51.415 19.721 517.890
F 值 82.259** 47.747** 34.925* 4.975 19.554
　　* 和 ** 分别表示 5 % 和 1% 的显著水平。
非特异性扩增, 高温复性则提高扩增的特异性。本
文采用优化后的扩增体系对复性温度进行 47、50
和53 ℃的水平试验, 结果表明, 当复性温度为53 ℃
(图 2 中的组合 3、6 和 9), 扩增的效果较好; 同时
结合循环次数的水平试验, 组合 9 (循环次数为 35
次)扩增的条带不仅多, 而且清晰。
图 2 鱼腥草正交设计 SRAP-PCR 扩增体系的扩增
Fig.2 The amplification of SRAP-PCR amplification system from orthogonal design of H. cordata
M: DL2000 marker; 1~9: 试验组合编号(重复 3 次)。
2 遗传多样性分析
采用优化后的体系, 从340个引物组合中筛选
出 118个扩增条带清晰、重复性好的引物组合, 共
扩增出 7 582 个条带, 其中多态性条带 6 590 个, 多
态率为 86.92%; 正向引物平均得到 387.65 条多态
性条带, 多态性比率 86.61%; 反向引物平均得到
329.5 条多态性条带, 多态性比率 87.10% (表 4)。
这说明SRAP分子标记能检测到很丰富的多态性。
3 鱼腥草 SRAP特异性谱带
在16个鱼腥草居群和340个引物组合中, 共发
现 19 条特异性的谱带(表 5)。如 F8-R10 引物组合
分别在居群 8 (ZY42)的 300 bp 处和居群 9 (ZY01)
的 450 bp 处出现了两个特异性谱带(图 3-a); 又如
F16-R8 引物组合在居群 10 (ZY28)的 300 bp 处出
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现一个特异性谱带(图 3-b)。
此外, 在19条特异性谱带中, 居群8 (ZY42)共
出现 6 条, 占 31.58%; 居群 1 (ZY16)、3 (ZY34)和
9 (ZY01)共出现 3 条, 占 15.79%; 居群 4 (ZY12)、
10 (ZY28)、12 (ZY43)和 14 (ZY32)共出现 1条, 占
5.26%。这些特异性谱带可作为鱼腥草材料鉴定
的依据。
4 鱼腥草居群的亲缘关系
遗传距离可反映居群亲缘关系的远近。从表
6 中可以看出, 遗传距离的变化幅度在 0.0959~
0.5040 之间。其中居群 5 (ZY21)和居群 6 (ZY05)
的遗传距离最小为0.0959, 居群1 (ZY16)和居群11
(ZY24)的遗传距离最远为 0.5040。
鱼腥草居群的UPGMA聚类分析结果(图 4)表
明, 在遗传距离 0.31处, 将 16个鱼腥草居群分为三
大类: 鱼腥草居群 11 (ZY24)为第一类; 鱼腥草居群
9 (ZY01)为第二类; 第三类包括的14个居群又可分
为 2 个亚类, 第一亚类包含的居群有 1 (ZY16)、2
(ZY02)、5 (ZY21)、6 (ZY05)、7 (ZY36)、8 (ZY42)
和10 (ZY28), 第二亚类中包含的居群有3 (ZY34)、
12 (ZY43)、13 (ZY18)、14 (ZY32)、15(WYC)、
16 (SCY)和 4 (ZY12)。但结果中同一地区的品种,
如湖南攸县的居群4 (ZY12)、5 (ZY21)和13 (ZY18)
表 5 鱼腥草居群特异性谱带数
Table 5 The number for specificity bands of H. cordata
引物组合 材料编号 位置
F2-R7 8 和 9 100 和 300 bp
F3-R6 1 4 100 bp
F3-R12 8 100 bp
F6-R15 1 和 8 300 和 500 bp
F6-R18 3 280 bp
F7-R9 8 600 bp
F7-R18 3 150 bp
F8-R10 8 和 9 300 和 450 bp
F11-R7 3 和 4 150 和 400 bp
F11-R10 8 400 bp
F12-R5 1 150 bp
F13-R17 1 2 400 bp
F15-R8 9 300 bp
F16-R8 1 0 300 bp
F17-R4 1 120 bp
表 4 SRAP 正向和反向引物扩增的多态性带数
Table 4 Polymorphic band number for SRAP amplification of forward and reversed primers
正向引物 总谱带 多态性谱带 多态率 /% 反向引物 总谱带 多态性谱带 多态率 /%
F1 463 399 86.18 R1 351 335 95.44
F2 734 654 89.10 R2 305 273 89.51
F3 623 575 92.29 R3 428 380 88.78
F4 249 249 100.00 R4 120 104 86.66
F5 551 551 100.00 R5 693 629 90.76
F6 265 233 87.92 R6 613 512 83.52
F7 6 5 4 9 75.38 R7 418 354 84.70
F8 390 278 71.28 R8 486 438 90.12
F9 361 329 91.13 R9 521 473 90.78
F10 364 252 69.23 R10 781 691 88.47
F11 843 715 84.81 R11 262 214 81.68
F12 585 473 80.85 R12 252 236 93.65
F13 329 265 80.55 R13 5 8 5 8 100.00
F14 251 203 80.87 R14 301 253 84.05
F15 338 322 95.26 R15 281 265 94.31
F16 140 140 100.00 R16 256 187 73.05
F17 1 031 903 87.58 R17 409 333 81.41
R18 391 295 75.44
R19 389 341 87.66
R20 267 219 82.02
总和 7 582 6 590 1 472.43 总和 7 582 6 590 1 742.01
平均 446 387.65 86.61 平均 379.1 329.5 87.10
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图 3 鱼腥草居群特异性谱带
Fig.3 The specificity bands for H. cordata
a 和 b 分别为 F8-R10 和 F16-R8 引物组合对居群的扩增。M: DL2000 marker; 1~16: 居群编号。
表 6 16 个鱼腥草居群的遗传距离
Table 6 The genetic distance for 16 populations of H. cordata
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
2 0.2923
3 0.2464 0.2486
4 0.3768 0.3627 0.2596
5 0.2924 0.3076 0.3404 0.4080
6 0.2737 0.3002 0.3484 0.4003 0.0959
7 0.2849 0.2806 0.3716 0.3822 0.1577 0.1491
8 0.2945 0.3521 0.3407 0.3643 0.3033 0.2643 0.2982
9 0.4755 0.5012 0.4503 0.4035 0.3816 0.3823 0.4231 0.4093
10 0.3576 0.3915 0.4114 0.3917 0.2644 0.2598 0.2649 0.3041 0.3318
11 0.5040 0.4976 0.4799 0.4628 0.4992 0.4859 0.4885 0.4855 0.4571 0.4499
12 0.3014 0.3307 0.2611 0.3409 0.3049 0.3052 0.3513 0.3031 0.4101 0.3576 0.4086
13 0.2827 0.3069 0.2304 0.3171 0.3066 0.2611 0.3264 0.3162 0.3758 0.3663 0.4231 0.1825
14 0.3493 0.3679 0.3074 0.3648 0.3821 0.3447 0.3829 0.3642 0.4636 0.4374 0.4708 0.2232 0.2595
15 0.3262 0.3433 0.2976 0.3482 0.3799 0.3772 0.3637 0.3984 0.4475 0.4662 0.4803 0.2907 0.3305 0.3276
16 0.2985 0.3425 0.2448 0.3551 0.3469 0.3363 0.3627 0.3242 0.4344 0.3788 0.4918 0.2481 0.2756 0.2973 0.2211
并没有聚到一类, 这可能是鱼腥草各居群的遗传关
系很复杂之故。
讨　　论
以往多采用等位酶分子标记来研究物种的遗
传多样性(王可青等1999), 然而等位酶可识别的位
点较少, 这样的结果将会低估物种遗传多样性。近
年来, 一些基于 PCR的DNA分子标记已被广泛用
于无性生殖植物的多样性和种群遗传结构的研究
中; 和等位酶分析体系相比, DNA分子标记不受植
物发育阶段及组织器官差异的影响, 通过直接分析
遗传物质的多态性作为不同居群的划分依据更为可
行和客观, 可以避免由于不同发育阶段和季节性生
理生化差异而影响指标的准确性(Hangelbroek 等
2002; Ruggiero 等 2005)。本文在采用 SRAP 分子
标记分析鱼腥草居群的遗传多样性前, 首先对其反
应体系进行了正交设计的优化, 其结果是最佳反应
体系为每 10 μL 溶液中含有 0.2 mmol·L-1 dNTPs、
20 ng 模板 DNA、30 ng·μL-1 引物、0.5 U Taq 聚
合酶和 2 mmol·L-1 MgCl2; 最佳复性温度和循环次
数为 53 ℃和 35 次。此种结果有别于柿子(郭大龙
和罗正荣等 2006)、梨(张妤艳等 2007)、南瓜(瞿
桢等2008)等的SRAP反应体系, 其原因是不同物种
的基因组有很大差别, 所需的反应体系也有不同。
植物生理学通讯 第 46 卷 第 3 期, 2010 年 3 月216
用分子标记技术研究的结果显示, 同种植物不
同居群之间的遗传相似性与其地理分布直接相关,
地理位置分布较近者遗传相似度也较高, 多数能聚
类合并(汪恩华等 2002; 李钧敏和金则新 2005), 这
是因为较小地理范围内的物种遗传分化程度较小。
然而, 地理距离最近的种群不一定都能归为一类, 更
重要的是其生境的相似度(刘惠芬等 2004)。本文
的聚类结果表明, 部分同一地理区域的居群也没有
聚到一起, 是否与其生境的相似度有关, 还待进一
步研究。
参考文献
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图 4 鱼腥草居群的 SRAP 引物数据的聚类图
Fig.4 Dendrogram of cluster analysis based on SRAP primer combinations of H. cordata