全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (2): 183~188　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0474 183
收稿 2014-10-30　　修定 2014-12-29
资助 中国烟草总公司贵州省公司重点科技攻关项目(GY2012-06)。
* 通讯作者(E-mail: zcxu@sohu.com; Tel: 0371-63555916)。
不同海拔下烤烟碳氮代谢相关酶基因的表达差异分析
刘炳清1, 许嘉阳1,2, 黄化刚3, 杨永霞1, 杨双剑3, 连培康1, 许自成1,*
1河南农业大学烟草学院, 郑州450002; 2华中农业大学资源与环境学院, 武汉430070; 3贵州省烟草公司毕节市公司, 贵州毕
节551700
摘要: 为探讨贵州乌蒙烟区不同海拔的烤烟特色形成的分子机理, 本文利用实时荧光定量PCR技术对的烤烟碳氮代谢相关
酶基因的表达进行检测。结果表明, 液泡转化酶(VIN)基因在烤烟移栽后50 d的中海拔表达较强, 移栽后60 d高海拔表达比
较活跃, 烤烟成熟期低海拔表达略强。蔗糖合成酶(SS)和蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因在烤烟旺长期高海拔表达较强, 烤烟成
熟期低海拔表达较强, 中海拔表达较弱。在4个取样时期, 海拔越高, 蔗糖磷酸化酶(SPP)基因表达越强, 高海拔地区烟叶的
颗粒结合型淀粉合成酶(GBSSI)基因表达均最强。淀粉分支酶(SBE)基因在烤烟移栽后50、60和70 d高海拔下表达较强, 在
移栽后80 d低海拔下表达相对较强。从同一时期不同海拔的结果分析, 烤烟硝酸还原酶(NR)基因表达强度随海拔降低而逐
渐增强。谷氨酰胺合成酶(GS1-3和GS1-5)基因表达在4个取样时期表现为低海拔强于中、高海拔的。
关键词: 烤烟; 海拔; 碳氮代谢; 基因表达
Analysis of Differential Gene Expression of the Related Enzymes in Carbon and
Nitrogen Metabolism of Flue-Cured Tobacco at Different Altitudes
LIU Bing-Qing1, XU Jia-Yang1,2, HUANG Hua-Gang3, YANG Yong-Xia1, YANG Shuang-Jian3, LIAN Pei-Kang1, XU Zi-Cheng1,*
1College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2College of Resources and Environment,
Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 3Bijie Branch of Guizhou Provincial Tobacco Company, Bijie, Guizhou
551700, China
Abstract: In order to study the molecular mechanism of characteristics of flue-cured tobacco at different alti-
tudes in Wumeng tobacco-growing areas of Guizhou province, the real time quantitative PCR was used to de-
tect gene expression of the related enzymes in carbon and nitrogen metabolism of flue-cured tobacco. The re-
sults indicated that during vigorous growth stage vacuolar invertase (VIN) gene of flue-cured tobaccos in
middle and high altitude areas was expressed more actively, and during maturing period VIN gene in low alti-
tude areas was expressed slightly strongly. And Sucrose synthase (SS) and sucrose phosphate synthase (SPS)
genes in high altitude areas were expressed more strongly during vigorous growth stage, but were expressed
relatively strongly in low altitude areas and more weakly in middle altitude areas during maturing period.
During the four sampling periods the higher the altitudes, the more strongly sucrose-6-phosphate phosphatase
(SPP) gene was expressed, granule-bound starch synthase I (GBSSI) gene in high altitude areas was expressed
most strongly. SBE gene in high altitude areas was expressed more strongly during vigorous growth stage, but
relatively strongly in low altitude areas after transplanting 80 days. Based on the analysis of the different alti-
tudes during the same period, with the altitudes lowering gradually, nitrate reductase (NR) gene was expressed
more strongly. During the four sampling periods glutamine synthase (GS1-3 and GS1-5) genes in low altitude
areas were expressed more strongly than those in middle and high altitude areas.
Key words: flue-cured tobacco (Nicotiana tabacum); altitudes; carbon and nitrogen metabolism; gene expression
碳氮代谢是烤烟生长和产质形成过程中最基
本的物质代谢过程(伍贤进和白宝璋1997)。在烟
叶生长发育过程中, 碳氮代谢强度和协调程度及
其动态变化, 直接或间接影响烟叶化学成分的含
量和组成比例, 对烟叶品质的形成产生重要影响
(韩锦峰等1994, 1996; 史宏志和韩锦峰1998)。目
前, 关于烤烟碳氮代谢的研究(刘国顺等2009; 李雪
利等2011; 王树会等2012; 许自成等2007)指出转化
酶和蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶、硝酸还原
植物生理学报184
酶、谷氨酰胺合成酶等酶类在烤烟碳氮代谢过程
中起重要作用, 但这些研究多集中在酶活性及碳
氮代谢产物方面, 而有关烤烟碳氮代谢相关酶基
因的表达规律和特性的研究鲜见报道。
实时荧光定量PCR技术具有高度的灵敏性、
特异性和精确性(袁亚男和刘文忠2008), 近年来被
广泛应用于植物基因的表达分析中(孙长坡等2013;
郝志愚等2014), 运用分子生物学相关技术研究烟
草的生长、成熟、衰老过程中主要代谢途径的基
因表达情况, 可从根本上揭示烟草品质形成的机
理。本研究以贵州乌蒙烟区的烤烟为材料, 利用实
时荧光定量PCR技术检测不同海拔下烤烟的糖、
淀粉和氮代谢相关酶基因的表达情况, 对其差异进
行比较分析, 旨在为研究乌蒙特色烟叶质量与风格
成因提供分子生物学方面的参考依据。
材料与方法
1 试验设计
试验于2013年分别在贵州乌蒙烟区纳雍县维
新镇(海拔1 600 m)、赫章县铁匠乡(海拔1 900 m)
和威宁县岔河乡(海拔2 200 m)进行。供试地点在
贵州乌蒙烟区具有较好的代表性。供试烟草(Ni-
cotiana tabacum L.)为当地主栽品种‘云烟97’。该
烟区烤烟多于4月下旬至5月上旬移栽, 移栽后30 d
进入旺长期, 移栽后60 d进入成熟期, 大田期为120
d左右。田间管理按当地最优栽培措施进行。以
中部叶为基础, 分别于烤烟移栽后50、60、70和80
d在每一试验地选取长势均匀一致的3株烤烟的同
一部位(10~12叶位)叶片进行取样, 并迅速置于液
氮中低温保存备用, 每个海拔设置3个重复。采用
实时荧光定量PCR技术检测碳氮代谢相关基因的
表达情况, 包括液泡转化酶(vacuolar invertase, VIN)、
蔗糖合成酶(sucrose synthase, SS)、蔗糖磷酸合成
酶(sucrose phosphate synthase, SPS)、蔗糖磷酸化
酶(sucrose-6-phosphate phosphatase, SPP)、颗粒结
合型淀粉合成酶(granule-bound starch synthase I,
GBSSI)、淀粉分支酶(starch branching enzyme,
SBE)、硝酸还原酶(nitrate reductase, NR)和谷氨酰
胺合成酶(glutamine synthase, GS)。
2 试验方法
2.1 RNA提取
提取鲜烟叶样品的总RNA, 具体方法参考文
献(丁福章等2007)。利用NanoDrop 2000分光光度
计(Thermo Scientific, USA)测定浓度及OD260/
OD280, 琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。
2.2 逆转录
利用Primer Script RT reagent Kit (TaKaRa, Japan)
将待测RNA逆转录成cDNA。配制逆转录体系: 总
RNA 0.5 μg; 50 μmol·L-1 oligo dT 0.5 μL; 100 μmol·L-1
random 6mers 0.5 μL; 5×PrimerScript Buffer 2 μL;
PrimerScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL; Nuclease-free
H2O, 加至10 μL。在ABI 9700型PCR仪上37 ℃保
温15 min使逆转录反应完全后, 85 ℃ 5 s终止反
应。加入90 μL Nuclease-free H2O稀释至100 μL储
存在–20 ℃冰箱备用。
2.3 引物设计
引物采用Roche LCPDS2软件设计并由上海捷
瑞生物工程有限公司合成。具体引物序列见表1。
其中L25是烟草核糖体蛋白基因(Gregor等2010), 作
为内参基因。
2.4 实时荧光定量PCR
利用LightCycler® 480 SYBR Green I Master试
剂盒(Roche, Swiss)在LightCycler® 480 II型荧光定
量PCR仪(Roche, Swiss)上进行反应。PCR体系:
2×LightCycler® 480 SYBR Green I Master 5 μL; 10
μmol·L-1 Forward primer 0.2 μL; 10 μmol·L-1 Re-
verse primer 0.2 μL; cDNA 1 μL; Nuclease-free H2O
3.6 μL。PCR程序: 95 ℃ 10 min; 95 ℃ 10 s, 60 ℃
30 s, 40个循环。循环结束后利用熔解曲线检测产
物特异性: 从60 ℃缓慢升温至97 ℃, 每1 ℃采集5
次荧光信号。
3 数据处理
试验数据采用2-ΔΔCt算法进行计算, 假设目的
基因在不同处理下的表达量是第一个处理的N倍,
目的基因的相对表达量N=2-ΔΔCt, 其中ΔΔCt=处理
(Ct样品–CtL25)–对照(Ct样品–CtL25)。
试验数据处理、图形分析采用SPSS 19.0和
Excel 2003统计软件完成。
实验结果
1 不同海拔下烤烟的糖代谢相关酶基因的表达分析
1.1 液泡转化酶基因的表达差异比较
液泡转化酶(VIN)参与植物的渗透调节和细胞
膨大 , 调控果实等贮藏器官中的糖成分及比例
刘炳清等: 不同海拔下烤烟碳氮代谢相关酶基因的表达差异分析 185
(Ohyama等1995; Woodson和Wang 1987)。不同海拔
下烤烟VIN基因的表达如图1所示, 移栽后50 d, 中海
拔地区VIN基因表达略强; 移栽后60 d, 高海拔的表
达最强, 低海拔的表达最弱; 移栽后70和80 d低海拔
的表达略强, 中海拔的表达最弱。
1.2 蔗糖合成酶基因的表达差异比较
蔗糖合成酶(SS)参与调控输入蔗糖的多少和代谢
蔗糖的能力, 参与细胞的构建, 调节淀粉的合成(张明
方和李志凌2002)。图2显示, 移栽后50 d, 海拔越高,
SS基因表达越强; 移栽后60 d, 中海拔地区的表达最
强; 而在移栽后70和80 d, 低海拔地区的表达略强。
1.3 蔗糖磷酸合成酶基因的表达差异比较
蔗糖磷酸合成酶(SPS)的催化反应是蔗糖合
成途径中的关键一步, 与糖的积累有密切关系。
SPS和SS是控制碳素分配和流向的关键酶, 能够
调控烟叶中蔗糖的合成和总糖的积累(张明方和
李志凌2002)。如图3所示, 移栽后50 d, 海拔越高,
表1 引物序列
Table 1 Primer sequences
名称 登录号 F引物序列(5→3) R引物序列(5→3)
VIN AF376773.1 TAAAGGAATCACAGCGTCG TGCATAAAGATCAGCCCAACTA
SS AB055497.1 GACACTGTTGGACAGTACG TTCATATCAGCTCCTGGTGAC
SPS DQ213015.1 AGGGAGTCTTCATAAATCCAG GGACCACCATTCTTAGTAGC
SPP AAW32903 TTGTTCCCGCCTATGAAG CAGATGGTCTACACACTGC
GBSSI DQ069270.1 AACAGCTCGAAGTGTTGTA ATCTGCTTGGAACCAACATAA
SBE AB028067.1 CCGAAGATGTTTCGGGTAT TATCCACTTATCTGGGACTGC
NR X14058.1 CTTAGCTTCTAGTCTCTGGTGA CGTCTGCATAATGATATTCGT
GS1-3 X95933.1 GTGATGAAGTGTGGGTAGC GTTCCAATCGCCCGGAATA
GS1-5 X95932.1 GCTGACATCAACACATTCAAA GCCTCCTATCCTCGAAGTA
L25 L18908 AGTTACATTCCACCGACC TCCTCAATCTTCTTCATTGCAG
图2 不同海拔下SS基因的表达
Fig.2 Expression of SS gene at different altitudes
SPS基因表达越强; 移栽后60 d, 中海拔的表达较
强; 移栽后70 d, 海拔越高, 表达越弱; 移栽后80
d, 中海拔地区的表达最弱 , 低海拔地区的表达
最强。
图1 不同海拔下VIN基因的表达
Fig.1 Expression of VIN gene at different altitudes
图3 不同海拔下SPS基因的表达差异
Fig.3 Expression of SPS gene at different altitudes
植物生理学报186
SBE基因表达最强。移栽后80 d, 低海拔SBE基因
表达最强, 而中海拔约为最弱。
3 不同海拔下烤烟的氮代谢相关酶基因的表达分析
3.1 硝酸还原酶基因的表达差异比较
烟草中的硝酸还原酶(NR)是氮代谢的第一个
关键酶和限速酶, 主要作用是把NO3
-离子还原成
NO2
-离子(Kyaing等2011)。 如图7所示, 同一时期不
同海拔间比较, NR基因均表现为随着海拔降低, 表
达强度逐渐增强。
1.4 磷酸蔗糖磷酸化酶基因的表达差异比较
磷酸蔗糖磷酸化酶(SPP)是蔗糖合成最后步骤
的关键酶(唐朝荣等2013)。图4显示了, 在4个取样时
期, SPP基因表达大体表现为随海拔升高逐渐增强。
图4 不同海拔下SPP基因的表达差异
Fig.4 Expression of SPP gene at different altitudes
图5 不同海拔下GBSSI基因的表达差异
Fig.5 Expression of GBSSI gene at different altitudes
图7 不同海拔下NR基因的表达
Fig.7 Expression of NR gene at different altitudes
图6 不同海拔下SBE基因的表达差异
Fig.6 Expression of SBE gene at different altitudes
2 不同海拔下烤烟的淀粉代谢相关酶基因的表达分析
2.1 颗粒结合型淀粉合成酶基因的表达差异比较
颗粒结合型淀粉合成酶(GBSSI)是控制直链
淀粉合成的关键酶(时岩玲和田纪春2003)。如图5
所示, 相同时期, GBSSI基因的表达均为高海拔最
强, 低海拔次之, 中海拔最弱。
2.2 淀粉分支酶基因的表达差异比较
淀粉分支酶(SBE)是支链淀粉生物合成的关
键酶, 参与淀粉生物合成, 形成支链淀粉(姚新灵等
2005)。如图6所示, 在烤烟移栽后50 d, 海拔越高,
SBE基因表达越强。移栽后60和70 d, 高海拔地区
3.2 谷氨酰胺合成酶基因的表达差异比较
谷氨酰胺合成酶(GS)催化根吸收的NH4+产生
谷氨酰胺, GS常与谷氨酸合酶(glutamate synthase,
GOGAT)协同作用, 组成GS/GOGAT循环, 这是高等
植物NH4+同化的主要途径(黄冰艳等2010)。如图8
所示, 在相同取样时期中, GS1-3基因表达均表现出
刘炳清等: 不同海拔下烤烟碳氮代谢相关酶基因的表达差异分析 187
地的气候因素有关。有研究指出, 海拔与气温关
系密切, 同时对降水和日照时数的分布均会产生
重要影响, 对生态环境起到了一定的先决作用(陈
传孟等1997)。高海拔地区气温相对偏低, 但日照
充足, 降水较为充沛。赵爽等(2013)研究指出日照
时数多, 太阳辐射强度大, 在光温补偿效应的作用
下, 有利于地温和气温的升高, 从而可提高温度的
有效性。在烤烟发育中期, 高海拔地区充足的光
照弥补了相对偏低的温度, 气候条件比较适宜烤
烟生长发育, 碳代谢强度相对较大, 有利于糖类物
质的合成。
淀粉是烟草叶片大田期积累的重要碳水化合
物, 淀粉的分解、转化、消耗和积累决定着烟草
烤后叶片内部各种化学成分之间的协调程度及外
观商品等级的优劣(王瑞新2003)。就淀粉代谢中
的重要酶类而言, GBSSI和SBE可促进叶绿体中淀
粉的合成, 直接关系到烟叶中淀粉的积累量, 进而
影响到整个光合碳固定的强度。GBSSI控制直链
淀粉的合成(时岩玲和田纪春2003)。本研究分析
发现, 烤烟发育中期高海拔地区烟叶的GBSSI和
SBE基因表达较强, 说明控制淀粉合成的酶活性
强, 高海拔有利于淀粉的合成。这可能与高海拔
区的光照强度有关。高海拔地区, 光照强度大, 紫
外线强度相对也较大, 光合作用产物从对生殖生
长的供应转为在营养器官中积累的量也较多, 致
使烤烟叶片中淀粉含量多。
氮代谢是烤烟植株生长的最基本、最重要的
代谢之一, 含氮化合物在决定烟草品质方面起着
重要作用。硝酸还原酶是一种光诱导酶, 也是硝
态氮吸收同化过程中的限速酶, 决定了烟株的氮
代谢强度(许自成等2007)。随着海拔降低, NR基因
表达强度逐渐增强, 高海拔NR基因表达强度最弱,
这可能跟高海拔紫外线强度有关, 过强的紫外线
影响了NR的活性。而催化根吸收的NH4
+产生谷氨
酰胺的谷氨酰胺合成酶GS1-3和GS1-5基因表达均
表现为低海拔的基本高于高海拔。氮代谢的关键
酶基因检测结果表明低海拔地区氮代谢强度相对
较大。
总的来看, 高海拔地区烤烟在旺长期碳代谢
强度相对较大, 有利于糖类物质的合成, 烟叶糖分
积累较多, 这与李洪勋(2008)关于贵州烟叶含糖量
图8 不同海拔下GS1-3基因的表达
Fig.8 Expression of GS1-3 gene at different altitudes
图9 不同海拔下GS1-5基因的表达
Fig.9 Expression of GS1-5 gene at different altitudes
低海拔地区最强, 中、高海拔下差异不大。图9显示
了不同海拔烟叶GS1-5基因的表达差异, 可见低海拔
地区的GS1-5基因表达量高于高海拔和中海拔。
讨　　论
碳代谢和氮代谢是烟株生长发育、产量与品
质形成过程中最基本的代谢过程(许自成等2007)。
烟叶的碳代谢包括无机碳的光合固定过程和碳水
化合物的运输、转化、积累与分解过程(史宏志等
1999), 而这些过程与相关酶的基因表达关系密
切。从不同海拔烤烟的糖代谢相关酶等基因表达
量的差异对比可以看出, 在烤烟发育中期, 与糖类
物质合成相关的SS、SPS和SPP基因均在高、中海
拔区表达较强, 说明在烤烟发育中期高海拔地区
烤烟的糖代谢强度大于低海拔地区。这可能与当
植物生理学报188
随海拔升高而增加的结论相一致。同时, 低海拔
地区氮代谢强度大, 高海拔地区氮代谢强度相对
较小, 可能导致高海拔地区烤烟蛋白质和烟碱等
含氮化合物含量相对较低, 进而使高海拔地区烟
叶清甜香特色更突出。本研究从分子生物学角度
分析了不同海拔烤烟碳氮代谢的差异, 所得结论
尚需多年试验的重复验证。
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