全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 12期，2009年 12月 1181
收稿 2009-09-23 修定 　2009-12-01
资助 国家自然科学基金(30660095)和新疆教育厅重点科研项
目(XJED U20 06 108 )。
* 通讯作者(E-mail: wji1118@yahoo.com.cn)。
亚麻胚性细胞悬浮培养体系的建立和影响因素
苗书魁 1, 姜丽 2, 计巧灵 1,*, 李文婷 1, 热西旦 ·尼格买提 1
1新疆大学生命科学与技术学院, 乌鲁木齐 830046; 2新疆轻工职业技术学院食品工程系, 乌鲁木齐 830021
提要: 亚麻品种 ‘双亚五号 ’的胚性愈伤组织诱导最佳培养基为MB (MS无机盐加B5维生素)+1.0 mg·L-1 2,4-D; 细胞初始悬
浮培养的最佳培养基为MB+0.2 mg·L-1 6-BA; 细胞继代悬浮培养的最佳培养基为改良的MB (NH4NO3减半, KNO3加倍)+
0.02 mg·L-1 2,4-D+0.2 mg·L-1 6-BA; 适宜的蔗糖量为50 g·L-1; 适宜的继代接种量为1.0~1.5 g·(25 mL)-1; 继代间隔为5~7 d。
关键词: 亚麻; 胚性愈伤组织; 悬浮细胞系
Establishment and Influence Factors of Embryogenic Cell Suspension Lines of
Linum usitatissimum L. in vitro
MIAO Shu-Kui1, JIANG Li2, JI Qiao-Ling1,*, LI Wen-Ting1, Rexidan·Nigemaiti1
1College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China; 2Food Engineering Department, Xinjiang
Institute of Light Industry Technology, Urumqi 830021, China
Abstract: The optimum induction medium for the embryogenic callus of Linum usitatissimum ‘Shuangya No.
5’ was MB (MS inorganic salts supplemented with B5 vitamins)+1.0 mg·L-1 2,4-D. The optimum medium for
initial culture of suspension cells was liquid MB supplemented with 0.2 mg·L-1 6-BA. The suspension cells were
cultured on modified MB liquid medium (NH4NO3 halved, KNO3 doubled) supplemented with 0.02 mg·L-1 2,4-
D+0.2 mg·L-1 6-BA for subculturing. The suitable sucrose concentration was 50 g·L-1. The optimal inoculative
densities were 1.0–1.5 g·(25 mL)-1, and the subculture period was 5–7 d.
Key words: Linum usitatissimum; embryogenic callus; cell suspension lines
我国纤维亚麻的种植主要集中在黑龙江省, 其
次是新疆(关凤芝等2007), 新疆北疆是亚麻生产和
种子繁殖的理想地区(康庆华等 2006)。但要得到
真正适合于新疆多种气候条件下生长的亚麻品系,
需要做大量的育种研究工作。体细胞杂交技术在
亚麻种质资源创新中可望短期内获得新品系, 而在
该技术中, 原生质体再生体系的建立是育种目的得
以实现的关键(赵大克等 2009)。本文对亚麻品种
‘双亚五号’悬浮细胞培养条件进行优化, 探索了胚
性愈伤组织的诱导以及植物生长调节剂、蔗糖浓
度、氮源以及接种量等因素对亚麻悬浮细胞生长
的影响, 以期建立起快速生长的亚麻胚性细胞悬浮
系, 从而为亚麻体细胞杂交育种和进一步广泛利用
有效遗传资源培育亚麻新品系提供基础。
材料与方法
亚麻(Linum usitatissimum L.)品种 ‘双亚五号 ’
种子由新疆农业科学院经济作物研究所提供。
亚麻种子用 0.1% HgCl2 (W/V, 加 1~2滴吐温 -
80)搅拌 5 min后, 以无菌水冲洗 5次, 每次 2 min。
灭菌后的种子接种到含3%蔗糖、pH5.8的MB (MS
无机盐加 B5维生素)培养基上, 于(25±1) ℃下暗培
养 7 d。苗长高到 5~7 cm时, 取下胚轴, 切成 5~10
mm长作为外植体, 诱导愈伤组织。试验选用含
3%蔗糖的MS为基本培养基, 附加植物生长调节剂
2,4-D、NAA和 6-BA组合(表 1), 在(25±1) ℃下暗
培养 30 d后统计愈伤组织诱导率。根据诱导率和
愈伤组织质量确定最适培养基, 用以扩增愈伤组
织。用石蜡切片法(郑国锠 1978; 李正理 1987)观
测愈伤组织内部的细胞生长状态。
取浅黄色颗粒状和表面光滑的胚性愈伤组织,
接入含不同植物生长调节剂配比的液体培养基里
(表 2), 采用 100 mL三角瓶, 每瓶 25 mL培养基, 置
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于120 r·min-1摇床上于(25±1) ℃下震荡暗培养。选
择上述最佳生长调节剂组合的培养基为基础培养
基, 以不同浓度蔗糖(表3)培养, 选出最佳的蔗糖浓
度后, 不改变最佳条件而仅改变氮源(表4), 确定适
宜的氮源量后, 再在最佳条件下仅改变接种量(表
5), 培养密度以每瓶 25 mL培养基中接种悬浮细胞
的鲜重表示。无菌条件下, 将待转瓶的培养物平均
分成 8份移入无菌离心管中, 封口, 以28×g离心10
min, 弃上清, 用无菌滤纸条从沉淀边缘吸干水分, 封
口, 称其鲜重, 并调整各份至大致相同的重量。1
份置于 60 ℃烘箱中 10~12 h烘至恒重, 称其干重;
在无菌条件下, 将其余 7份沉淀物分别转入 25 mL
新鲜液体培养液中继续培养, 每隔 1 d取 1瓶测定
鲜重和干重各 1次, 连续测定 14 d, 并绘制细胞生
长曲线, 达到最大密度时间以培养物鲜重不再增加
时为准; 生长量指达到最大密度时的每瓶培养物的
鲜重。增长率计算公式为: 增长率(%)=[(终鲜重 –
接种鲜重)/接种鲜重]×100%。
每次培养后, 观察记录悬浮细胞生长情况。
得到稳定的细胞悬浮系后, 转入最佳培养基(以
0.6%的琼脂固化)上验证其胚性。
结果与讨论
1 亚麻胚性愈伤组织的诱导
从表 1和图 1可见: (1)接种培养 30 d后, 同时
加NAA和6-BA的培养基中诱导出的愈伤组织为淡
黄色、较松散, 由大量非胚性的薄壁细胞组成(图
1-a、d), 此类愈伤组织不适合悬浮培养; (2)培养基
表 1 不同植物生长调节剂组合对亚麻愈伤组织诱导的影响
Table 1 Effect of different combinations of plant growth regulators on the induction of flax callus
生长调节剂及浓度 /mg·L-1 出愈伤组织数 诱导率 /% 愈伤组织的形态变化
2,4-D 0.1 6 3 0 浅黄色, 结构较紧密
2,4-D 0.5 1 1 5 5 浅黄色, 结构较紧密
2,4-D 1.0 1 4 7 0 浅黄色, 颗粒状, 表面光滑
2,4-D 2.0 1 3 6 5 黄绿色, 结构致密
2,4-D 3.0 7 3 5 黄绿色, 结构致密, 部分褐化
NAA 0.2+6-BA 0.3 5 2 5 黄白色, 结构较松散
NAA 0.5+6-BA 0.3 7 3 5 黄白色, 表面较湿, 结构松散
NAA 1.0+6-BA 0.3 7 3 5 浅黄色, 结构较松散
NAA 0.2+6-BA 0.5 9 4 5 浅黄色, 结构松散
NAA 0.5+6-BA 0.5 1 2 6 0 浅黄色, 表面较干, 结构松散
NAA 1.0+6-BA 0.5 1 0 5 0 黄褐色, 结构松散
外植体接种数均为 20 个。
中单独用2,4-D的愈伤组织诱导效果均优于NAA和
6-BA组合培养基, 其中MB+1.0 mg·L-1 2,4-D培养
基中下胚轴组织诱导出色泽较好、结构紧密、有
颗粒状突起的胚性愈伤组织(图1-b), 诱导率最高为
70%; (3)生长初期胚性愈伤组织的细胞形态较小,
细胞质浓厚(图 1-c), 随着分裂周期缩短, 逐渐形成
鸟巢状结构(1-e), 与外界非胚性的薄壁细胞形成明
显的界限(1-f), 而后独立形成球形胚, 这种胚性愈
伤组织最适于建立胚性细胞悬浮系。
2 影响亚麻悬浮细胞生长的因素
2.1 植物生长调节剂的影响 表2结果表明, 初始单
独用 0.2 mg·L-1 6-BA得到的球形细胞多, 较分散,
内含物丰富(图 2-a、b); 较低浓度的 2,4-D悬浮细
胞的内含物、分散度不及单独用 6-BA培养的, 而
较高浓度 2,4-D得到的悬浮细胞容易变形, 内含物
较少, 质量低。但在单独用 0.2 mg.L-1 6-BA培养
基上继代 1个月后, 悬浮细胞内含物变少。故在悬
浮系继代过程中适当调整了植物生长调节剂的配
比, 悬浮细胞的最适继代培养基为MB+0.02 mg·L-1
2,4-D+0.2 mg·L-1 6-BA。这与 Pret’ová等(2006)报
道的仅用6-BA就可促进亚麻体细胞胚形成的结果
不同。
2.2 蔗糖的影响 适宜亚麻细胞生长的渗透压差异
较大(Tejavathi等2000; Chen和Dribnenki 2004), 亚
麻细胞[接种量为 1.0 g·(25 mL)-1 (FW)]在附加不同
浓度蔗糖的悬浮细胞最适培养基上培养1周后, 测
定终鲜重和计算增长率的结果(表3)表明, 蔗糖浓度
超过 6%时, 细胞产生质壁分离现象, 高糖下细胞
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表 2 不同植物生长调节剂组合对亚麻悬浮细胞生长的影响
Table 2 Effect of different combinations of plant growth regulators on the growth of flax suspension cells
2,4-D浓度 /mg·L-1 6-BA浓度 /mg·L-1 培养体系的颜色变化 细胞形态变化
0 0.2 黄白色 圆, 内含物较丰富, 分散度较好
0 0.5 浅黄色 较圆, 内含物较丰富, 呈小细胞团
0 1.0 黄色 分散度差
0.01 0 浅黄色 圆, 内含物一般, 呈小细胞团
0.02 0 黄白色 圆, 内含物少, 分散度好
0.05 0 浅黄色 较圆, 内含物少, 分散度较好
0.10 0 黄色 轻微变形, 内含物少, 呈细胞团
0.50 0 黄色 变形, 内含物少, 细胞呈团状
1.00 0 黄色 不圆, 内含物少, 分散度差
0.01 0.2 黄白色 大小不一, 内含物少
0.02 0.2 浅黄色 圆, 内含物丰富, 分散度好
0.03 0.2 黄色 部分变形, 内含物较好
0.05 0.2 黄色 有死亡细胞
0.08 0.2 黄褐色 有死亡细胞, 残渣较多
0.10 0.2 黄褐色 有死亡细胞, 残渣较多
悬浮系的鲜重增长率下降, 分散性也受影响; 4%以
下的蔗糖培养的细胞有破碎, 部分细胞膨大, 生长
的一致性较差。据此认为, 亚麻悬浮细胞系培养的
蔗糖浓度以 5% 为宜。
2.3 氮源的影响 Cunha和Fernandes-Ferreira (1999)
研究亚麻体细胞胚发生的结果表明, NO3-与NH4+为
1:1时,体胚诱导率最大,达到 90.5%。而本文结果
显示, MS中的NH4NO3减半和KNO3加倍(改良的
MS)时对亚麻悬浮细胞系生长最佳(表 4)。
2.4 接种量的影响 在NH4NO3减半、KNO3加倍
和 5%蔗糖的悬浮细胞最适培养基上, 比较不同接
种密度对亚麻悬浮细胞生长影响的结果(表5)表明,
接种量对亚麻悬浮细胞生长影响较大, 能正常继代
增殖的起始接种量是每25 mL液体培养基中接种在
0.1 g (FW)以上。低于 0.1 g则悬浮培养物增殖缓
慢; 接种量在 0.1 g以上时, 每瓶培养物的生长量随
图 1 亚麻愈伤组织及石蜡切片
Fig.1 The callus of flax and paraffin sections
a: 非胚性愈伤组织; b: 胚性愈伤组织; c: 胚性愈伤组织初期(10×10×3); d: 非胚性愈伤组织(10×10×3); e、f: 球形胚(10×10×3)。
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图 2 亚麻细胞悬浮系
Fig.2 Suspension cell lines of flax
a: 培养瓶中的亚麻悬浮细胞; b: 亚麻悬浮细胞显微观察(10×10×3)。
表 3 蔗糖对亚麻悬浮细胞生长的影响
Table 3 Effect of sucrose on the growth of flax suspension cells
蔗糖浓度 /% 鲜重增长率 /% 细胞形态 细胞内含物 分散性
3.0 227.0 较好, 有较多残渣 + ++++
4.0 254.0 较好, 有少量残渣 ++ ++++
5.0 273.5 好, 无渣 +++ +++
6.0 185.5 轻微质壁分离 +++ ++
7.0 156.0 质壁分离 + +
“+”代表好的程度。
表 4 氮源对亚麻悬浮细胞生长的影响
Table 4 Effect of nitrogen in medium on the growth of flax suspension cells
MS中的大量元素 鲜重增长率 /% 细胞状态
MS 195.6 较圆, 内含物一般
MS (NH4NO3减半, KNO3加倍) 268.3 圆, 内含物丰富
表 5 不同接种密度对亚麻悬浮细胞生长的影响
Table 5 Effect of different inoculative densities on growth of flax suspension cells
接种量 /g·(25 mL)-1 达到最大密度的时间 /d 生长量 /g·(25 mL)-1 鲜重增长率 /%
0.05 — 0 0
0.10 — 0 0
0.30 1 4 1.35 350
0.50 1 2 2.07 313
1.00 1 0 3.68 268
1.50 7 5.12 241
2.00 5 5.66 183
2.50 4 6.18 147
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着接种量的增加而递增, 达到最大密度所需的时间
也随之缩短。适宜的接种量为 1.0~1.5 g·(25 mL)-1
培养液(表 5)。
3 亚麻悬浮细胞系的生长
图3表明, 亚麻悬浮细胞系生长的指数增长期
为接种后 4~10 d, 从细胞形态和培养液色泽来看,
适宜的继代间隔为 6~8 d。
4 亚麻悬浮细胞系再生的胚性愈伤组织
将在最佳培养条件下得到的悬浮细胞重新在
胚性愈伤组织的固体培养基(表 1, MB+1.0 mg·L-1
2,4-D)上培养, 经过 2次继代培养后产生了胚性愈
图 4 亚麻悬浮细胞系再生的胚性愈伤组织
Fig.4 Embryogenic callus from the suspension cell lines of flax
a: 成簇的胚性愈伤组织; b: 剥离下来的球形胚和鱼雷胚(10×10×3); c: 鱼雷胚(10×10×3)。
图 3 不同培养时间的亚麻悬浮细胞系的生物量变化
Fig.3 The biomass of flax suspension cell
lines at different culture days
伤组织(图4-a), 并且伴有球形胚和鱼雷胚的发生(图
4-b、c)。这与葛春辉等(2008)报道的亚麻品种
‘双亚五号 ’体胚发生培养的结果是一致的。
参考文献
葛春辉, 计巧灵, 郭景霞, 姜丽, 王雪华, 朱国丽, 贾红丽, 张丕鸿
(2008). 亚麻品种 ‘ 双亚五号 ’ 的胚性愈伤组织诱导和体细
胞胚胎发生. 植物生理学通讯, 44 (2): 235~239
关凤芝, 李江, 吴广文(2007). 浅谈中国纤维亚麻的现状与建议.
中国麻业科学, 29 (增刊): 95~103
康庆华, 关凤芝, 王玉富, 李建英, 焦洪双, 路颍, 吴广文, 宋宪友,
杨学(2006). 中国亚麻分子育种研究进展. 中国农业科学, 39
(12): 2428~2434
李正理(1987). 植物制片技术. 第 2版. 北京: 科学出版社
赵大克, 王敬乔, 陈薇, 郑丽(2009). 植物原生质体获得、培养条
件及方法对其再生体系构建的影响. 云南大学学报, 30 (S2):
403~408
郑国锠(1978). 生物显微技术. 北京: 人民教育出版社
Chen Y, Dribnenki P (2004). Effect of medium osmotic potential
on callus induction and shoot regeneration in flax anther
culture. Plant Cell Rep, 23: 272~276
Cunha A, Fernandes-Ferreira M (1999). Influence of medium
parameters on somatic embryogenesis from hypocotyl ex-
plants of flax (Linum usitatissimum L.). J Plant Physiol, 155:
591~597
Pret’ová A, Šamaj J, Obert B (2006). Cytological, physiological and
biochemical aspects of somatic embryo formation in flax. In:
Mujib A, Samaj J (eds). Somatic Embryogenesis. Plant Cell
Monographs (2). Berlin, Heidelberg: Springer, 235~245
Tejavathi DH, Sita GL, Sunita AT (2000). Somatic embryogenesis
in flax. Plant Cell Tiss Org Cult, 63: 155~159