全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (3): 244~248244
收稿 2010-09-28　　修定 2010-12-06
资助 “948”项目[2006-G34(A)]、农业部行业计划资助项目
(nyhyzx07-030)和中央级公益性科研院所基本科研业务费
专项(200701)。
* 通讯作者(E-mail: xiejhww@163.com; Tel: 020-39332974)。
菠萝果实发育相关RFD1基因的克隆及表达
王尉1, 2, 3, 张秀梅3, 谢江辉3,*
1安徽农业大学生命科学学院, 合肥230036; 2中山大学生命科学学院植物与微生物互作实验室, 广州510006; 3中国热带农业
科学院南亚热带作物研究所, 广东湛江524091
摘要: Blast菠萝果实不同发育时期的cDNA文库测序结果, 并用信息生物学软件和相关网站进行拼接和分析, 设计特异
引物RT-PCR, 得到一个2 750 bp、编码761个氨基酸的全长基因序列, 命名为RFD1。预测该蛋白是一个亲水性、且具有
多个磷酸化位点的分泌性蛋白, 可能位于叶绿体中。半定量PCR分析发现RFD1基因表达量在果实发育期不断增加, 70 d
达到最高; 而在70 d果实的不同部位并没有显著差异性, 仅果实外部略有增高。
关键词: 菠萝; “电子”克隆; 果实发育; 表达
Cloning and Expression of RFD1 Gene Related to Development from Pineapple
[Ananas comosusr (L.) Merr.] Fruit
WANG Wei1,2,3, ZHANG Xiu-Mei3, XIE Jiang-Hui3,*
1Anhui Agricultural University, School of Life Science, Hefei 230036, China; 2Sun Yat-Sen University, School of Life Sciences,
Laboratory of Plant and Microbial Interaction, Guangzhou 510006, China; 3China Southern Subtropical Crop Research Institute
of CATAS, Zhanjiang, Guangdong 524091, China
Abstract: In this study, cDNA library of pineapple fruit sequences of different development stages were
screened by Blast. And then, sequences were spliced and analyzed by some informatics softwares and related
webs. According to the spliced result, specific primers of RT-PCR were designed and performed. We got
a 2 750 bp of the full length gene encoding 761 amino acids which was named as RFD1 (related to fruit
development). The results indicated that RFD1 protein was a hydrophilic, multiple phosphorylation sites of the
secreted protein, and may be located in chloroplasts. Semi-quantitative PCR analysis showed that RFD1 gene
expression was gradually increased during fruit development periods, and reached the peak in the 70 d. Though
the expression of RFD1 gene in different fruit parts had no significant differences, that in the outer was slightly
increased in the 70 d after flowering.
Key words: pineapple (Ananas comosusr); in silico cloning; fruit development; expression
根据果实在成熟期间有无呼吸高峰区, 可将
其分为跃变型和非跃变型两类。在呼吸跃迁型水
果中, 人们以西红柿作为模式系统做了大量研究,
特别是与果实成熟速率相关的乙烯合成通路和
MADS盒转录因子(Vrebalov等2002; Hadfield等
2000); 并详细研究了编码乙烯合成通路中的信号
分子1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)、ACC合成酶
(ACS)及其氧化酶(ACO)的作用机理(Giovannoni
2001)。然而, 在部分非呼吸跃迁型水果中, 尽管对
其发育和成熟相关基因做了大量研究 , 如葡萄
(Davies等2000)、草莓(Aharoni等2002)、柑橘
(Moriguchi等1998)、西瓜(Levi等2006)等, 但如何
调控果实成熟的文献甚少(Giovannoni 2004), 故克隆
和研究非呼吸跃迁型果实成熟基因显的较为重要。
菠萝是继香蕉和芒果之后的第三大重要的经
济作物, 但对其分子遗传特征了解甚少, 特别是果
实发育和成熟的相关基因(Botella等2008)。截止
2004年, 基因文库中仅登陆51个来自菠萝叶片和
营养组织的基因(Moyle等2005a), 其中24个是
研究报告 Original Papers
王尉等: 菠萝果实发育相关RFD1基因的克隆及表达 245
Neuteboom等(2002)通过差异显示在根部高量表达
的基因, 部分基因在果实中也有表达。Moyle等
(2005b)首次构建了菠萝果实不同发育时期的
cDNA文库并登陆了1 548个EST序列, 包括408个
绿色果实和1 140个完全成熟的果实, 发现2个金属
硫蛋白基因(Ac180和Ac181)、一个含有MADS盒
的基因(Ac146)、一个蛋白转录因子SUI1 (Ac75)和
一个60S 核糖体蛋白L10 (Ac8)基因在果实成熟时
表达量上调。而Ac180在未成熟和成熟的果实中
均有表达, 具体作用还有待进一步研究(Moyle等
2005a)。
本文利用生物信息学分析已构建的菠萝果
实不同发育时期的cDNA文库, 对未知基因序列
重复同源性检索、拼装, 用RT-PCR验证目的基因
的正确性, 并对该基因和蛋白序列进行分析, 预测
其不同的理化性质, 研究该基因在果实发育过程
中的时空表达特征, 对提高果实品质和储存周期
具有一定理论和实践意义。
材料与方法
供试材料为菠萝品种‘巴厘’ [Ananas comosusr
(L.) Merr. cv. ‘Yellow Mauritius’]不同发育时期的
果实, 取自中国热带科学院南亚热带作物研究所
菠萝资源圃。选择盛花时有代表性的、花期一致
的果实挂牌, 从谢花后20 d开始, 每隔10 d取样1次,
每次随机取果5个, 直至成熟(2007年4月~6月), 共
取7次。采后将果实分为4个部分, 分别为中部、
内部、上部和下部, 并用液氮处理放于-80 ℃保存
备用。
菠萝果实总RNA提取参照王尉等(2007)的方法
进行。根据已预测的菠萝未知基因序列, 设计特
异性引物, 上游引物: 5 ATCGGTATTGTGGC-
ACTTCTTTGT 3, 下游引物: 5 TGGTTCTCCG-
CGTGTACTATGTCC 3, 产物大小约为1 994 bp。
用Takara公司生产的mRNA Selective PCR Kit Ver
1.1一步法进行RT-PCR, 反应体系为: 2×mRNA
Selective PCR Buffer I 25 μL、MgCl2 10 μL、
dNTP/analog Mixture 5 μL、Rnase inhibitor 1 μL、
AMV RTase XL 1 μL、Oligo dT primer 1 μL、混合
模板(包括果实不同部位和不同个体的总RNA, 约1
μg总RNA) 1 μL、最后加入RNase Free H2O至总体
积50 μL, 扩增程序为50 ℃ 15 min (反转录); 85 ℃
1 min, 58 ℃ 1 min, 72 ℃ 2 min, 共38个循环; 后72
℃总延伸10 min, -20 ℃保存备用。反应结束后,
取上述扩增产物于含EB的1.2%琼脂糖凝胶上进行
电泳, 在凝胶成像系统下观察电泳结果。
回收PCR产物与pGEM-T Vector (Promega公
司)连接, 转入DH5α中, 后酶切鉴定呈送上海生物
工程有限公司测序。
在线软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/
gorf.html)寻找最大开放阅读框(ORF); NCBI网站
对核苷酸序列进行BLAST分析。理化性质用
http://www.expasy.ch/tools/protparam.html在线软件
分析; 蛋白二级结构用http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-
bin/npsa_automat.pl?page=/npsa/npsa_ hnn.html进
行预测; Scratch Protein Predictor 预测二硫键位置;
NetPhos 2.0 Server程序预测蛋白磷酸化位点; 而蛋
白质中的信号肽和亚细胞定位分别用http://www.
cbs.dtu.dk/services/signalp/ 和http://wolfpsort.seq.
cbrc.jp/ 进行在线预测。DNAstar、Primer 5.0和
DNAman等软件用于序列分析和引物设计。
以菠萝果实18S rRNA看家基因为内参, 对
RFD1基因在果实不同成熟时期和不同部位的时空
表达进行研究。依据Chaw等已登录(GenBank登录
号D29786)的18S rRNA基因核苷酸序列(约400 bp)
设计特异引物, 上游引物: 5 TCCGCTGGCAC-
CTTATGAGA 3, 下游引物: 5 CGCGTGCGG-
CCCAGAACA 3。RFD1半定量表达引物和PCR反
应体系均如上所述, 采用同管异时扩增目的基因
和内参基因。
结果与讨论
1 菠萝果实发育相关基因的“电子”克隆
Blast分析菠萝果实cDNA文库测序结果, 得出
49个未知功能的的EST序列 , 设定搜索标准为:
Highly similar sequences (megablast)选取长度≥
100 bp, 相似性85%以上, 将所得序列在国际生物
技术信息中心的G e n B a n k数据库n u c l e o t i d e
collection-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
BLAST/)中进行重叠序列的重复性检索, 共搜索出
33条相互重叠的EST序列与G04测序结果具有较
高同源性, 将33个序列利用SEQMAN软件进行“电
植物生理学报246
子”克隆。重叠区均达到100 bp以上, 拼接总长度
为2 750 bp, 且序列中无间隔碱基。
2 RT-PCR电泳结果
根据拼接结果, 设计特异引物, 以菠萝果实混
合总RNA为模板, 一步法RT-PCR。结果如图1所
示, cDNA片段约为2 000 bp, 与“电子”克隆预测相
吻合, 然后连接载体, 根据测序结果, 矫正错误核
苷酸, 得到全长cDNA。
白。氨基酸组成中 , 亮氨酸 ( 9 . 6 % )、丝氨酸
(9.5%)、甘氨酸(7.7%)与脯氨酸(7.0%)含量最为丰
富, 而色氨酸(1.1%)和半胱氨酸(1.6%)含量最少。
RFD1蛋白质二级结构预测结果表明该基因
所编码的蛋白主要以α螺旋、不规则卷曲和延伸
链为主要结构元件, 散布在整个蛋白质中, 无β折
叠结构。蛋白质的疏水性分析显示, 多肽链氨基
酸最低分值为-2.800, 最高为2.456, 同时脂肪族氨
基酸指数为81.65, 总平均亲水性为-0.184, 可推测
RFD1蛋白属于亲水性蛋白。
该蛋白质含有13个Cys, 共形成5个二硫键, 分
别在第487位和第502位、第291位和第302位、第
59位和第73位、第43位和第54位、第202位和第
220位处的Cys形成二硫键。RFD1蛋白有31个
Ser、11个Thr、8个Tyr可能成为蛋白激酶C磷酸化
位点、酪蛋白激酶II磷酸化位点。软件预测35~36
位点是最有可能的酶切位点, 故推断1~35个氨基
酸为信号肽序列。亚细胞定位该蛋白有8%的可能
性转运到叶绿体中, 3%的可能性存在于细胞核内,
1%的可能性存在于细胞质和线粒体中, 预测RFD1
蛋白可能在协助物质运输或信号转导过程中起到
重要的作用。
5 半定量PCR分析RFD1基因时空表达
半定量分析RFD1基因在菠萝果实不同发育
时期的转录水平, 发现该基因在果实发育的整个
时期均有表达(图3)。花后20 d果实中的RFD1表达
量较低; 而30~50 d表达量几乎不变; 随着果实成
熟, 表达量逐渐增加, 花后70 d达到最大值, 之后略
有降低, 说明该基因的表达与果实成熟具有一定
的相关性。
菠萝果实的发育过程受大量特异基因的调控
(Itai等2000)。糖、酚类物质及有机酸等含量均发
生了较大的变化(张秀梅等2006a, 2007b), 信号分
子相互作用, 调节成熟相关基因选择性表达(Giov-
annoni 2001)。Moyle等(2005)发现在菠萝绿果期,
羟基酸氧化酶、过氧化物酶和谷胱甘肽转移酶含
量较高, 同时, 果实蛋白酶及蛋白酶抑制剂随着果
实成熟, 具有下降趋势。本文研究了RFD1基因在
果实不同发育时期的表达模式, 推测该基因有可
能参与果实代谢调控, 具体功能还有待进一步研
究。
3 拼接结果及开放阅读框(ORF)预测
NCBI在线ORF Finder预测G04蛋白质序列,
得到该基因编码761个氨基酸, 氨基酸同源性比较,
最高仅为21% (菠萝浸染病菌后的一个未知功能基
因 ) , 由此确定该基因为未知新基因 , 命名为
RFD1。序列(图2)分析发现, 在起始密码子上游和
终止密码子下游均具有全长基因的特点, 5′端起始
密码子ATG上游非编码区的-35~-25含有TATA序
列(TATA box), -80~-70区具有CCAAT序列(CAAT
box) , 而在-110~-80区含有GCCAGACCC或
GGGCGGG序列(GC box), 3′端终止密码子TGA下
游15~30 bp处有保守序列AATAAA、polyA合成酶
结合序列CA-GU、结尾信号TATAAAAT和polyA
尾巴。因此判定, 拼接所得基因为菠萝的全长基
因。密码子偏爱性分析中发现该基因对A和T核苷
酸较为喜好, 占序列中总核苷酸的64%。
4 RFD1基因蛋白质结构与功能预测
RFD1蛋白的相对分子量为89.71 kDa, 理论等
电点pI 7.29, 不稳定系数是45.69, 预测为不稳定蛋
图1 RT-PCR电泳结果
Fig.1 The electrophoresis results of RT-PCR
M: DL2000 marker; 1、2: 重复扩增。
王尉等: 菠萝果实发育相关RFD1基因的克隆及表达 247
图2 菠萝RFD1基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列
Fig.2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of RFD1 gene from pineapple fruit
植物生理学报248
图3 RFD1基因在菠萝果实发育不同时期的表达
Fig.3 Expressions of RFD1 gene during different
development of pineapple fruit
M: DL2000 marker。
图4 RFD1基因在菠萝果实发育不同部位的表达
Fig.4 Expressions of RFD1 gene in different
parts of pinapple fruit
上、下、内、外: 菠萝果实的不同部位; M: DL2000 marker。
选择第70天RFD1基因活性最强时期, 研究果
实4个不同部位的表达。RFD1在果实的不同部位
均有较强表达量, 仅在果实的外部略高。推测其
表达量有可能受到果实内部成分, 特别是糖分和
有机酸的影响。张秀梅等(2006, 2007)研究菠萝果
实含糖量及其代谢酶活性变化发现, 随着果实的
发育, 蔗糖磷酸成酶、蔗糖合成酶和柠檬酸含量
的动态变化类似于RFD1基因表达。而果实成熟
时, 由于代谢酶的变化, 可能抑制了RFD1基因的表
达。
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