全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (10): 1749~1756　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0317 1749
收稿 2015-06-16　　修定 2015-09-08
资助 国家自然科学基金(31272494)和浙江省自然科学基金
(LY16C170003)。。
* 通讯作者(E-mail: majinzjl@163.com; Tel: 13071844269)。
抗坏血酸-谷胱甘肽循环在紫花苜蓿突变体耐盐性中的作用
马进*, 郑钢, 裴翠明, 张振亚
浙江农林大学风景园林与建筑学院, 浙江临安311300
摘要: 在不同抗氧化途径中AsA-GSH是最重要的循环系统, 为明确抗坏血酸-谷胱甘肽循环(AsA-GSH)在紫花苜蓿耐盐性
中的作用。以紫花苜蓿品种‘Millennium’及其耐盐突变体为材料, 研究其在200 mmol·L-1胁迫下的活性氧代谢及AsA-GSH
循环的变化。结果表明, NaCl胁迫下突变体叶片中的过氧化氢(H2O2)含量、超氧阴离子(O2¯· )产生速率和丙二醛(MDA)含
量、氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量、脱氢抗坏血酸(DHA)含量显著低于野生型。突变体叶片中GSH/GSSG和AsA/DHA的比
值高于野生型。NaCl盐胁迫下突变体叶片中H2O2与DHA含量呈显著正相关, 与AsA/DHA和GSH/GSSG比值呈负相关。同
野生型相比, 突变体叶片中在胁迫期间能够保持较高且相对协调平衡的抗坏血酸过氧化物酶(APX)、脱氢抗坏血酸还原酶
(DHAR)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性。说明突变体体内AsA-GSH循环能够快速有效地
运转, 维持较强抗氧化物质的再生能力, 从而提高抗氧化胁迫能力。该研究结果表明AsA-GSH循环效率是紫花苜蓿耐盐机
制的重要生理基础。
关键词: 抗坏血酸-谷胱甘肽循环; 紫花苜蓿; 盐胁迫; 突变体
The Function of Ascorbate-Glutathione Cycle in Salt Tolerance of Alfalfa Mutant
MA Jin*, ZHENG Gang, PEI Cui-Ming, ZHANG Zhen-Ya
Faculty of Landscape Architecture, Zhejiang Agriculture and Forestry University, Lin’an, Zhejiang 311300, China
Abstract: Among the different antioxidant pathways, the ascorbate-glutathione (AsA-GSH) cycle has been re-
garded as the most important one in order to the function of AsA-GSH cycle in salt tolerance of alfalfa. In the
study, millennium (WT) and a salt tolerant alfalfa mutant (MT) were exposed to 200 mmol·L-1 NaCl to reactive
oxygen species (ROS) metabolism and dynamic change of AsA-GSH cycle. The results indicated that H2O2
content, O2¯·
evolution rate, MDA content, GSSG and DHA contents of the leaves were higher in the wild type
than in the mutant; both the ratio of GSH to GSSG and the ratio of AsA to DHA were higher in the mutant than
in the wild type. The content of H2O2 was significantly positively correlated to H2O2 and DHA content in the
leaves of mutant alfalfa plants under NaCl stress, but negatively correlated to the rate of ASA/DHA and GSH/
GSSG ratio. Compared with wild type, mutant could maintain higher activity of APX, DHAR, MDHAR and
GR. These concluded that mutant alfalfa had efficient metabolism of ASA-GSH cycle, which scavenged the
H2O2 rapidly to alleviate the oxidative damage of NaCl stress. The results showed the efficiency of ASA-GSH
cycle are the physiological foundation for alfalfa to withstand salt stress tolerance.
Key words: ascorbate-glutathione cycle; alfalfa; salinity stress; mutant
在中国各种盐渍化土地面积约0.1亿hm2, 占
总耕地面积的1/10。并且, 由于灌溉不当造成的耕
地次生盐渍化仍在不断增加。因此, 研究盐胁迫
对作物的影响及适应机制是利用我国盐渍化土地
的一项紧迫任务。盐胁迫一般包括渗透胁迫和离
子毒害(Munns 2002), 盐胁迫能够产生活性氧
(ROS)如H2O2、O2¯·、·OH等, 过量的活性氧(reactive
oxygen species, ROS)会阻碍叶绿体和线粒体电子
传递过程及光呼吸等途径等(Wang和Han 2009), 从
而造成植物体内的活性氧代谢平衡被打破。植物
在盐胁迫下能产生大量活性氧, 当体内的ROS累积
到一定水平时就会对植株造成伤害。植物在长期
进化过程中也相应形成了酶促和非酶促两大类保
护系统, 以减轻或避免活性氧对细胞造成伤害。
H2O2作为活性氧中的一种在植物体内扮演着双重
角色, 一是植物正常代谢中的有毒副产物, 导致植
物的氧化胁迫; 二是在各种胁迫条件下作为一种
信号分子发挥信号转导作用。还原型抗坏血酸
植物生理学报1750
(reduced ascorbic acid, ASA)在抗坏血酸过氧化物
酶(ascorbate peroxidase, APX)的作用下与H2O2反
应, H2O2接受还原型辅酶II (triphosphopyridine nu-
cleotide, NADPH)的电子还原成水, 从而清除受到
逆境伤害产生过氧化氢的毒性(Smirnoff和Wheeler
2000)。AsA在清除H2O2的同时被氧化形成单脱氢
抗坏血酸(monodehydroascorbate, MDHA)和脱氢
抗坏血酸(dehydroascorbate, DHA), MDHA和DHA
在脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate redu-
etase, DHAR)和单脱氢抗坏血酸还原酶(monode-
hydroascorbate reductase, MDHAR)作用下重新还
原成AsA, 这种途径也参与AsA水平的调节, 并和
其他AsA合成途径一起, 在植物对逆境的响应和适
应中发挥重要作用(Yin等2010)。此外, 还原型谷
胱甘肽(reduced glutathione, GSH)除参与AsA-GSH
循环外还可直接与自由基反应, 并由还原态GSH
转变成氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione, GSSG);
谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase, GR)是维持
抗坏血酸-谷胱甘肽循环(ascorbate-glutathione, AsA-
GSH)循环有效运行的关键酶之一, 其作用是利用
NADPH的电子将GSSG还原为GSH, 从而使细胞
内谷胱甘肽库保持在还原状态(Jin等2003; Smirn-
off和Wheeler 2000)。
紫花苜蓿主要分布在温带地区, 是世界上最重
要的豆科牧草之一, 因其高营养价值和高产等特性
明显优于其他草类, 故有“牧草黄金”之称。紫花苜
蓿是对高浓度盐分敏感的甜土植物, 耐盐能力有限,
限制了在盐碱地上种植。前人关于紫花苜蓿耐盐
生理主要集中在有机渗透调节(Ehsanpour和Fatahian
2003)、拒Na+能力(Boughanmi等2005)、抗氧化能
力(Wang和Han 2009)和光合方面(范方等2013), 但
AsA-GSH循环与紫花苜蓿耐盐性的关系还未见报
道。GSH和AsA库的大小以及它们在植物胁迫忍
耐性中功能性和调节性的相互关系, 己经成为植
物抗性研究中的一个值得关注的热点领域(Taluk-
dar 2011; Grillet等2014)。研究表明, 不同种类的植
物以及同种植物的不同品种对盐胁迫的抗性机制
不完全相同, 因此选用相同遗传背景的突变体开
展研究更有意义。本试验以耐盐突变体和野生型
的紫花苜蓿为材料, 探讨盐胁迫下突变体和野生
型的耐性差异与AsA-GSH循环应答机制的相互关
系, 以揭示AsA-GSH循环在紫花苜蓿抵御盐胁迫
过程中的生理作用。
材料与方法
1 试验材料与处理
试验以南方型紫花苜蓿(Medicago sativa L.)
品种‘Millennium’野生型(wild type, WT)通过以
NaCl为选择因子, 对长期继代培养的紫花苜蓿愈
伤组织进行选择, 筛选出耐1.2% NaCl的耐盐细胞
系, 经过生理检测为体细胞无性系突变体(mutant,
MT) (马进等2011), 经过3代自交, 进行抗盐性鉴定
筛选, 发现该突变体耐盐性可以稳定遗传, 以该突
变体的T4代为材料进行研究。将突变体和野生型
种子置于培养皿中, 于20 ℃生长箱内发芽。5 d后,
将种子出苗小苗转移至塑料盆装满细沙和珍珠岩
(3:1), 每天浇l/2Hogland营养液。35 d后, 每天浇
灌100 mL 200 mmol·L-1 NaCl盐溶液, 处理0、2、
4、6和8 d后, 取紫花苜蓿的完全展开叶测定相关
指标。
2 测定方法
MDA含量测定参照Draper和Hadley (1990)方
法; H2O2含量测定参照Patterson等(1984)方法;
O2¯·产生速率测定参照Verma和Mishra (2005)方法;
GSH、GSSG和GSH/GSSG测定参照Griffi ths
(1980)方法; AsA和DHA测定参照Law等(1983)方
法; APX、MDHR和DHAR活性测定参照Nakano和
Asada (1981)方法; GR活性测定参照Foster和Hess
(1980)方法。
3 数据处理
各处理进行3次生物学重复, 采用DPS 10.0统
计软件进行方差分析。
实验结果
1 盐胁迫对紫花苜蓿野生型和突变体叶片中
H2O2、MDA含量及O2¯·产生速率的影响
H2O2和O2¯·是两类重要的活性氧。由图1以看
出, 突变体和野生型叶片O2¯·产生速率和H2O2含量
均随NaCl胁迫时间的延长而明显上升 , 突变体
O2¯·产生速率和H2O2含量较小。200 mmol·L
-1 NaCl
胁迫2、4、6和8 d后, 突变体叶片内O2¯·产生速率分
别比野生型低11.31%、12.37%、8.77%和14.98%,
马进等: 抗坏血酸-谷胱甘肽循环在紫花苜蓿突变体耐盐性中的作用 1751
2 盐胁迫对紫花苜蓿野生型和突变体叶片中
GSH、GSSG含量及GSH/GSSG比值的影响
GSH和AsA是植物体内存在的抗氧化剂, 是
非酶促抗氧化系统的重要组成部分。由图2可以
看出, 200 mmol·L-1 NaCl胁迫后, 突变体和野生型
叶片中GSH含量均呈先上升后下降的趋势。NaCl
胁迫4 d后, 野生型和突变体叶片中GSH的含量均
明显上升并达到最大值, 分别比处理0 d的升高
26.67%和39.38%; 但随着胁迫时间的延长, 野生型
和突变体体内GSH含量急剧下降。在NaCl胁迫8 d
后, 野生型和突变体的GSH含量分别比处理0 d的
下降60.53%和26.75%, 野生型下降程度明显高于
在NaCl胁迫4和6 d后 , 差异达极显著水平(P<
0.01)。NaCl胁迫2、4、6和8 d后, 突变体叶片内
H2O2含量分别比野生型低30.44%、50.87%、
64.08%和58.07%, 差异均达极显著水平(P<0.01)。
MDA是膜脂过氧化的产物, 反映了细胞膜的损伤
程度。在NaCl胁迫2 d后, 突变体和野生型叶片中
的MDA含量没有显著差异, 但胁迫4、6和8 d后, 野
生型叶片中的MDA含量分别比突变体高56.42%、
65.37%和72.06%, 两者差异达到极显著水平(P<
0.01)。说明随着NaCl胁迫时间的延长, 突变体膜
系统受到的过氧化伤害较小。
图1 盐胁迫对紫花苜蓿野生型和突变体叶片中H2O2、
MDA含量及O2¯·产生速率的影响
Fig.1 Effects of NaCl stress on the H2O2 and MDA content
and O2¯· generation rate in the leaves of wild type (WT) and
mutant (MT) alfalfa
图2 盐胁迫对紫花苜蓿野生型和突变体叶片中GSH、
GSSG含量及GSH/GSSG比值的影响
Fig.2 Effects of NaCl stress on the activities of GSH and
GSSG content and GSH/GSSG in the leaves of
wild type (WT) and mutant (MT) alfalfa
植物生理学报1752
突变体。整个胁迫过程中, 突变体叶片中的GSH
含量均显著高于野生型。NaCl胁迫后, 野生型和
突变体中GSSG含量均呈持续上升趋势。NaCl胁
迫2、4、6和8 d后, 野生型叶片中的GSSG含量分
别比处理0 d的增加28.52%、96.04%、132.19%和
159.49%; 突变体叶片中GSSG则分别增加2.98%、
12.02%、33.65%和40.42%; 野生型的增幅显著高
于突变体(图2)。野生型的GSH/GSSG比值随时间
的延长而逐渐下降, 突变体则先上升后下降, 在相
同胁迫时间下突变体的GSH/GSSG比值均极显著
高于野生型(P<0.01) (图2)。
3 盐胁迫对紫花苜蓿野生型和突变体叶片中的
AsA、DHA含量和AsA/DHA比值的影响
AsA是植物中最丰富的抗氧化物之一, 它可
以直接清除活性氧, 在植物抗氧化胁迫中起重要
作用。由图3可以看出, NaCl胁迫下野生型叶片中
AsA含量随处理时间的延长呈下降趋势, 突变体叶
片中AsA含量在胁迫初期迅速上升, 在处理4 d后
达到最大值, 随后下降。突变体和野生型叶片中的
DHA含量均呈显著升高的趋势。NaCl胁迫2、4、
6和8 d后, 野生型的DHA含量分别比处理0 d的增
加8.83%、52.37%、64.98%和80.13%; 突变体比处
理0 d的增加7.06%、27.56%、45.23%和58.66%, 增
幅明显小于野生型(图3)。与GSH/GSSG的变化趋
势相同, 野生型和突变体叶片中AsA/DHA比值呈
现逐渐下降的趋势, 并且在相同胁迫时间下两者差
异极显著(P<0.01), 且突变体的AsA/DHA比值明显
高于野生型(图3)。结果表明, 突变体体内较高的
GSH/GSSG比值和AsA/DHA比值有助于维持适当
的氧化还原环境, 减轻NaCl胁迫引起的氧化胁迫。
4 盐胁迫对紫花苜蓿野生型和突变体叶片中的
APX、GR、DHAR和MDHAR酶活性的影响
APX是植物体内清除H2O2的重要抗氧化酶之
一。由图4可以看出, 200 mmol·L-1 NaCl胁迫下, 突
变体和野生型叶片中APX酶活性含量均呈先下降
后上升的趋势, 并且在相同胁迫时间下两者差异
极显著(P<0.01), 突变体APX酶活性明显高于野生
型。NaCl胁迫后2 d后, 突变体和野生型APX酶活
性的含量比处理0 d下降17.75%和34.34%, 野生型
下降程度明显高于突变体。NaCl胁迫后2 d后, 突
变体和野生型APX酶活性含量均呈急剧上升的趋
势。NaCl胁迫后8 d后, 突变体和野生型APX酶活
性含量均明显上升并达到最大值, 分别比处理0 d
的升高71.67%和46.18%。NaCl胁迫后突变体GR
酶活性含量呈现先下降后上升的趋势, 而野生型
呈现下降趋势(图4)。NaCl胁迫4、6和8 d后, 突变
体GR酶活性含量分别比处理0 d的增加20.73%、
41.71%和45.27%, 而野生型则分别降低13.98%、
30.70%和443.40%。NaCl胁迫4、6和8 d后, 突变
体GR酶活性含量极显著高于野生型(P<0.01)。
NaCl胁迫下, 突变体和野生型DHAR酶活性含量在
图3 盐胁迫对紫花苜蓿野生型和突变体叶片中ASA、
DHA含量活性和ASA/DHA的影响
Fig.3 Effects of NaCl stress on the activities of ASA and
DHA content and ASA/DHA ratio in the leaves of
wild type (WT) and mutant (MT) alfalfa
马进等: 抗坏血酸-谷胱甘肽循环在紫花苜蓿突变体耐盐性中的作用 1753
胁迫初期迅速上升, 在处理4 d后达到最大值, 随后
下降(图4)。NaCl胁迫下4 d后, 突变体和野生型
DHAR酶活性含量分别比处理0 d的升高201.14%
和145.41%。但随着胁迫时间的延长, 突变体和野
生型DHAR酶活性含量急剧下降, 但NaCl胁迫下6
d和8 d后, 突变体DHAR酶活性含量极显著高于野
生型(P<0.01)。与DHAR的变化相似, 突变体和野
生型MHAR酶活性含量均呈先上升后下降的趋势,
NaCl胁迫6 d后, 突变体和野生型MDHAR酶活性
含量上升并达到最大值, 分别比处理0 d的升高
112.06%和49.40%。NaCl胁迫8 d后 , 突变体
MDHAR酶活性含量缓慢下降, 而野生型急剧下降
(图4)。
5 NaCl胁迫后突变体生理指标的相关性分析
由表1可以看出, H2O2含量与DHA含量呈显著
正相关差异显著(P<0.05), 与AsA/DHA、GSH/
GSSG呈显负相关。O2¯·产生速率与AsA/DHA和
GSH/GSSG呈极显著负相关(P<0.01)。AsA含量与
DHA成负相关。AsA作为AsA-GSH循环的重要成
员可以减轻由NaCl胁迫引起的过氧化伤害。
讨　　论
植物在盐胁迫下, 会造成渗透胁迫、离子毒
害、营养失衡等多方面伤害, 同时体内会产生大
量的活性氧自由基, 从而引起膜质的氧化伤害。
许多研究证实, 盐胁迫可以诱导H2O2和MDA含量
增加(Fatehi等2012; Sorkheh等2012)。本研究发现,
NaCl胁迫可导致突变体和野生型叶片中大量积累
H2O2含量, 加快O2¯·产生速率。野生型H2O2含量和
O2¯·产生速率显著高于突变体(图1), 突变体叶片中
MDA含量较低, 说明突变体体内具有高效的活性
氧清除系统, 对NaCl胁迫具有较好的适应性。
GSH是植物体内普遍存在的主要抗氧化物,
可参与AsA-GSH循环清除H2O2 (Pastori和Foyer
2002)。植物细胞内GSH/GSSH比值和GSH含量是
评价AsA-GSH循环运行效率高低的重要因素。本
研究表明, 在200 mmol·L-1 NaCl胁迫后, 突变体和
野生型叶片中的GSH含量均呈现先升高后下降的
趋势, 但突变体含量始终高于野生型, 同时在胁迫
后期, 野生型叶片中GSH下降速度要快于突变体
(图2), 这表明GSH含量的升高可能是通过GSH的
图4 盐胁迫对紫花苜蓿野生型和突变体叶片中APX、
GR、DHAR和MDHAR酶活性的影响
Fig.4 Effects of NaCl stress on the activities of APX, GR,
DHAR and MDHAR in the leaves of wild type (WT) and
mutant (MT) alfalfa
植物生理学报1754
合成, 增强抗逆性, 随着胁迫时间的延长, 胁迫程
度加深 , 自身细胞内大量GSH用于各种解毒过
程。两种非酶促抗氧化物质GSH和AsA可参与植
物体内清除H2O2 (Sorkheh等2012)。Ferreira-Silva
等(2012)研究发现盐胁迫腰果(Anacardium occi-
dentale)下叶片中GSH/GSSG比值上升。本研究发
现, 在NaCl胁迫初期野生型叶片中GSH含量虽有
所上升, 但GSSG含量的上升速度超过GSH, GSH/
GSSG始终保持下降趋势, 而突变体GSSG含量的
增幅低于野生型, GSH/GSSG呈现下降的趋势(图
2), 因此, 可以推测突变体叶片中有较高的GSH/
GSSG比值, 利于维持细胞内的还原环境和提高谷
胱甘肽循环的效率。
在植物细胞内通过AsA-GSH循环清除H2O2,
AsA作为APX的电子供体清除H2O2, 并被氧化成
DHA, DHA经DHAR催化还原(Drazkiewicz等2003)。
在AsA-GSH循环中 , AsA含量、氧化还原状态
(AsA/DHA)比值与抗逆性呈正相关(Gallie 2013)。
以前研究表明 , 盐胁迫可导致ASA含量的减少
(Mittova等2003; Shalata和Neumann 2001), 这可能
由于盐胁迫下AsA再生不足或AsA-GSH合成代谢
受阻(Amor等2006)而导致。Shalata等(2001)研究
结果表明, 盐胁迫下耐盐番茄(Solanum lycopersi-
cum)根系中的AsA含量明显升高, DHA含量显著降
低, 细胞氧化还原力(AsA/DHA)比值升高, 表现出
较强的耐盐性。本研究发现, 突变体和野生型叶
片中DHA含量均随着NaCl胁迫程度加深呈升高的
趋势, 但野生型叶片中DHA含量的增幅大于突变
体(图3)。通过研究AsA/DHA的比值表明, 在相同
胁迫时间下, 突变体AsA/DHA比值均显著高于野
表1 NaCl胁迫后突变体各生理指标的相关性
Table 1 Correlation among several physiological indexes of mutant (MT) under NaCl stress
指标 MDA O2¯· GSH GSSG GSH/GSSG AsA DHA AsA/DHA
H2O2 0.63 0.73 –0.14 0.29 –0.53 –0.04 0.82
* –0.59
MDA 0.91* –0.66 0.10 –0.87* –0.61 0.95** –0.95**
O2¯· –0.72 –0.04 –0.95
** –0.69 0.95** –0.97**
GSH 0.64 0.90* 0.96** –0.52 0.75
GSSG 0.32 0.52 0.22 –0.01
GSH/GSSG 0.86* –0.83* 0.94**
AsA –0.48 0.76
DHA –0.93**
　　表中*和**分别代表差异显著(P<0.05)和差异极显著(P<0.01)。
生型(图3), 这暗示着突变体叶片内具备较高的
AsA周转和再生能力以抵抗NaCl诱导的氧化胁
迫。
为了减轻胁迫诱导的氧化伤害, 植物发育了
一系列用来清除活性氧的系统, 其中AsA-GSH
循环是植株清除活性氧主要的主要机构, 包含了
APX、GR、DHAR和MDHAR四种保护酶。APX
直接参与清除H2O2和O2¯· (Maruta等2010)。Ferreira-
Silva等(2012)研究发现盐胁迫腰果下叶片会降低
APX活性。本研究发现, 盐胁迫处理后突变体和野
生型叶片中APX活性先下降后上升的趋势, 并且在
相同胁迫时间下两者差异极显著(P<0.01), 突变体
明显高于野生型(图4), 说明突变体产生更多APX活
性, 来清除植物体内过多的活性氧。MDHAR是
AsA-GSH循环中抵御ROS的氧化损伤的一种防御
酶, 它是利用NADPH再生ASA。DHAR也是AsA-
GSH循环中抵御另一个重要酶。本研究中发现
DHAR和MDHAR的作用是参与AsA的再生, 盐胁
迫初期DHAR和MDHAR活性上升, 而随着胁迫时
间延长, DHAR和MDHAR活性减低。DHAR活性
变化可能和APX活性变化有关, 配合APX在清除
H2O2过程中所需要的AsA再生, 但突变体叶片中
DHAR和MDHAR活性比野生型要高(图4), 推测突
变体促进ASA的再生能力要强。已有证据表明,
GR是活性氧清除系统中的限速酶, 能够将GSSG转
化为GSH, GR活性提高能维持植物体内较高的
GSH含量和适合的GSH/GSSG比值(Moradi和Is-
mail 2007)。研究表明, 抗逆性强的植物往往GR活
性高(Sekmen等2007; Aghaei等2009), 本试验结果
表明: 在NaCl胁迫4、6和8 d后, 突变体叶片中GR
马进等: 抗坏血酸-谷胱甘肽循环在紫花苜蓿突变体耐盐性中的作用 1755
酶活性含量显著高于野生型(图4), 可以表明, 突
变体将GSSG转化成GSH能力强, 清除H2O2的能
力强。
总之, 同野生型紫花苜蓿相比, 盐胁迫下突变
体叶片中在胁迫期间能够保持较高的A P X、
DHAR、MDHAR和GR活性及非酶抗氧化物质
AsA和GSH含量及GSH/GSSG比值, 从而使其AsA-
GSH循环能够快速有效地运转, 促进了AsA和GSH
的再生, 进而维持了较强的氧化还原力和高水平的
抗氧化物质, 本研究结果进一步明确了AsA-GSH循
环效率是紫花苜蓿耐盐机制的重要生理基础。
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