全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (5): 445~451 445
收稿 2013-01-18　　修定 2013-03-23
资助 国家自然科学基金(30973875、81072983和81274022)。
* 通讯作者(E-mail: xinjian@371.net; Tel: 0371-63558722)。
地黄内质网型(ER) Ca2+-ATPase基因的克隆及表达分析
刘驰1, 李明杰1, 王鹏飞1, 杨艳会3, 王丰青1, 张重义1,2, 李春奇1, 陈新建1,*
1河南农业大学生命科学学院, 郑州450002; 2福建农林大学中药GAP研究所, 福州350002; 3河南工业大学生物工程学院, 郑
州450001
摘要: 在分析和筛选我们前期建立的地黄转录组文库、抑制消减杂交文库及地黄相关EST文库基础上, 利用拼接、延伸及
PCR方法, 成功克隆到一个全长2 681 bp的Ca2+-ATPase基因, 含有2 007 bp完整的开放阅读框, 编码568个氨基酸。分析表明,
地黄Ca2+-ATPase属于内质网型ATPase, 与大豆和葡萄有较近亲缘关系, Ca2+-ATPase含有Ca2+离子转运区、ATP结合区等保
守区。随着生长, 正茬地黄Ca2+-ATPase表达量逐渐升高, 而连作地黄中的Ca2+-ATPase基因在块根伸长期表达突然升高, 之
后降低。
关键词: 地黄; 连作障碍; 钙信号; Ca2+-ATPase
Cloning and Expression Analysis of Endoplasmic Reticulum Type (ER) Ca2+-
ATPase in Rehmannia glutinosa Libosch.
LIU Chi1, LI Ming-Jie1, WANG Peng-Fei1, YANG Yan-Hui3, WANG Feng-Qing1, ZHANG Zhong-Yi1,2, LI Chun-Qi1, CHEN Xin-
Jian1,*
1School of Life Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2GAP Institute of Chinese Herbal Medicine,
Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 3School of Biological Engineering, Henan University of Tech-
nology, Zhengzhou 450001, China
Abstract: Based on our previous constructed Rehmannia glutinosa transcriptome, suppression subtractive
hybridization (SSH) libraries and EST, by using splicing, extension and PCR methods, we successfully cloned a
2 681 bp full length cDNA sequence of Ca2+-ATPase gene containing an open-reading frame (ORF) with 2 007
bp encoding 568 amino acids. The results indicated that Rehmannia glutinosa Ca2+-ATPase belonged to the
endoplasmic reticulum type, had a closer genetic relationship with soybean and grape, and contained a Ca2+ ion
transport area and a conservative ATP-binding domain. The expression level of Ca2+-ATPase gradually
increased with the grow in first-planting of R. glutionosa, but in continuous cropping of R. glutionosa appeared
a higher peak during the root extend period and then decreased.
Key words: Rehmannia glutinosa; continuous cropping obstacle; calicium signal; Ca2+-ATPase
地黄为玄参科多年生草本植物, 是我国著名
的“四大怀药”之一, 是我国常用大宗药材, 目前在
河南省焦作地区(道地产区)种植面积已近1.5万公
顷, 产值在数十亿元。但在地黄生产中, 却存在着
严重的连作障碍问题。连作障碍(continuous crop-
ping obstacles)是指在正常的管理措施下, 同一块
地连续多年种植相同作物(连作)造成作物产量降
低、品质变劣、生长状况变差、病虫害发生加剧
的现象。连作地黄表现为产量和品质明显下降,
每茬收获后须隔8~10年后方可再种(温学森等
2002)。据统计, 约占70%的根类药材都存在不同
程度的连作障碍(赵杨景2000; 张重义和林文雄
2009)。
钙信号是现代植物学研究的热点之一, 被形
象的称为“钙语言”, 是细胞响应外界信号刺激, 调
节各种生理过程的始作俑者。Ca2+-ATPase是存在
于细胞膜上的最重要“钙泵”之一, 对于撤回细胞内
钙信号响应钙离子, 使细胞恢复“平息”状态具有重
要作用(Kudla等2010)。在地黄连作障碍的深入研
究中, 已经追踪到Ca2+-ATPase响应异常和特殊的
表达模式, 初步判断其在连作障碍的过程作起着
研究报告 Original Papers
植物生理学报446
重要作用(范华敏等2012; Yan等2012), 因此克隆其
全长, 进一步详细阐明其功能及作用方式显得尤
为重要。
材料与方法
1 植物材料及处理
选取生产上广泛种植的‘温85-5’地黄品种(Re-
hmannia glutinosa Libosch.)为供试材料, 在河南农
业大学中药材研究所(温县基地)选择试验田, 搭建
2个隔离池(5 m×10 m), 分别种植正茬和连作地
黄。在苗期(5月22日)、块根伸长前期(6月22日)、
块根膨大前期(7月22日)、块根膨大中期(8月22
日)、块根膨大后期(9月22日)和成熟期(10月22日)
采集根、茎和叶片的植物鲜样, 放入液氮罐中带
回实验室, –80 ℃保存备用。
2 地黄各组织总RNA的提取
用TRIzol试剂盒(Invitrogen公司, 美国)提取总
RNA, 并用1%的琼脂糖凝胶电泳(180 V, 0.5 h)检测
总RNA的28S和18S的比例; 在260 nm/280 nm波长
下测定总RNA的吸光值, 并计算其浓度和纯度。
根据RT-PCR (反转录)试剂盒RevertAidTM First
Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas公司, 美国)
进行cDNA合成。
3 地黄内质网型Ca2+-ATPase基因扩增引物
将课题组前期构建的地黄根转录组文库、叶
转录组文库和连作地黄消减文库(张重义等2011;
杨艳会 2011; 范华敏等 2012; Yan等 2012)及NCBI
地黄相关序列全部构建成地黄转录组序列集。在
转录组序列集中共筛选到30个注释为内质网型(re-
ticulum-type, ER) Ca2+-ATPase相关的EST序列, 进
行Blastcluster后, 用CAP3进行序列拼接得到一
个2 681 bp的较长序列, 其中ORF长2 007 bp。在
ORF侧翼设计了2对特异引物进行扩增。预测扩增
长度为2 681 bp。
4 地黄内质网型Ca2+-ATPase基因的获得及其表达
分析
利用特异引物扩增正茬根茎叶cDNA模板, 扩
增体系2 5 μ L。 其中正反引物各0 . 5 μ L ( 1 0
μmoL·L-1)、10×LA PCR buffer 2.5 μL、dNTP 4 μL
(2.5 mmoL·L-1)、cDNA样品1 μL (200 ng·μL-1)、
LA-Taq酶0.25 μL (5 U·μL-1, 宝生物大连公司)和
ddH2O 16.25 μL。PCR反应条件为95 ℃预变性5
min; 94 ℃ 1 min、60 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min进行35
个循环; 72 ℃ 10 min。然后1.5%琼脂糖切胶回收
与预期大小一致的条带 , 将回收片段连接到
pJET1.2/Blunt载体(Fermentaqs公司, 美国), 转化大
肠杆菌DH5α, 直接筛选菌落进行测序。
cDNA样品分别用对应基因和内参基因18S
(GenBank登录号DQ469606)进行定量PCR (表1),
且每个反应重复3次。反应体系为Maxima SYBR
Green qPCR Master Mix (2×), no ROX 12.5 μL、正
反引物各1 μL (5 μmoL·L-1)、Template DNA 1 μL、
无菌水9.5 μL。扩增条件: 95 ℃预变性5 min; 95 ℃
10 s、59 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s进行40个循环, 溶解曲
线检测条件是95 ℃ 1 min、60 ℃ 1 min, 然后以0.5
℃·s-1的速度提高到95 ℃, 连续检测荧光信号。基
因的表达量以参照基因18S (DQ469606)作为标准
进行相对定量分析, 相对定量方法采样普遍使用
的是2-DDCT方法(Livak和Sehmittgen 2001)。做目的
基因表达模式分析时, 以对照正茬根成熟期(2012
年10月22日取样)样品的Ct值的平均数设为l, 进行
基因表达分析。
5 地黄内质网型Ca2+-ATPase基因生物信息学分析
用Molquest软件的子模块Bestorf预测所获得
序列的ORF并进行翻译; 采用在线工具Protparam
分析编码蛋白相对分子量、等电点等理化性质;
用ScanProsite软件和SOPMA分析蛋白结构和功能
域; 利用PSORT服务器对蛋白进行亚细胞定位分
析; TopPred 2进行蛋白跨膜区预测; 用ClustalX完
成核苷酸和氨基酸序列的同源性比对; 用MEGA
4.0构建进化树; 用PredtopII预测蛋白的跨膜螺旋;
用CPHmodles在线服务器进行蛋白同源建模。
实验结果
1 地黄内质网型Ca2+-ATPase基因的克隆
在对地黄叶和根高通量转录组文库、抑制
消减文库、NCBI地黄EST序列的合并注释的过
程中, 获得了30条注释为内质网型Ca2+-ATPase
的EST序列, 将序列进一步拼接延伸后, 获得一
条全长2 681 bp的基因序列。对该序列进行ORF
预测(图1)发现一个2 007 bp的完整ORF, 起始密
码子位于207 bp处, 并且启始密码子ATG周围–3
刘驰等: 地黄内质网型(ER) Ca2+-ATPase基因的克隆及表达分析 447
图1 Ca2+-ATPase cDNA的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列
Fig.1 The cDNA and deduced amino acid sequences of Ca2+-ATPase
终止子用*标记, 左右两侧的数字分别标注核苷酸及氨基酸的位置, 下划线部分显示跨膜区域, 小写斜体为克隆引物片段, 大写
ATTTA为非稳定信号, 大写斜体TAA为起始密码子同框终止子, AATAAA为加尾信号。
植物生理学报448
位为A, +4为G, 符合典型的KOAZK结构(AXX-
ATGG), 此外, 在5端发现一个同读码框终止密
码子 , 3 端下游非编码区有一个典型加尾信号
(AATAAA), 还存在一个非稳定信号(ATTTA) (图
1)。因此认为本文所电子克隆的内质网型Ca2+-
ATPase应该是完整的。在预测的ORF上下游设
计特异引物(表1), 用正茬地黄的根茎叶进行PCR
扩增后, 均获得了和预测大小一致的序列(图2),
两者完全匹配。
2 地黄内质网型Ca2+-ATPase编码的蛋白结构及同
源性分析
地黄内质网型Ca2+-ATPase基因的ORF编码
596个氨基酸, 分子量为64 906.9, 等电点5.65, 属于
酸性蛋白。用SOPMA软件预测Ca2+-ATPase蛋白
的二级结构 , 表明该蛋白含48.66%的α螺旋、
30.20%的随机卷曲、15.60%的延伸串和5.54%的β
转角。对地黄Ca 2+-ATPase进行蛋白跨膜区预
测 , 发现其含有4个跨膜螺旋区(图3-A和B)。用
PROST服务器对Ca2+-ATPase蛋白进行亚细胞定位
分析, 初步定位在内质网膜上, 这与其功能是一
致的。
目前在植物中, 有两种Ca2+-ATPase, 一种质膜
型(PM) Ca2+-ATPase, 一种是内质网型(ER) Ca2+-
ATPase, 筛选植物中含有完整序列的质膜型和内
质网型Ca2+-ATPase基础上, 加入地黄电子克隆发
现的Ca2+-ATPase, 进行N-J建树分析, 发现地黄处
于内质网型Ca2+-ATPase组(图4), 与大豆(Glycine
max)、葡萄(Vitis vinifera)和毛果杨(Populus
trichocarpa)有较近的亲缘关系。内质网型Ca2+-
ATPase多重比对发现, 彼此之间具有较高的保守
性, 含有ATP结合区、离子结合区等较高保守性基
元(motif) (图5)。
通过Predtop对Ca2+-ATPase进行跨膜分析表
明, 地黄Ca2+-ATPase有4个跨膜螺旋(图3-B)。利用
CHPMODEL服务器对地黄Ca2+-ATPase进行同源
搜索结果显示, 与牛肌肉(bovine muscle)的内质网
型Ca2+-ATPase (PDB编号: 3TLM.A)有50.2%的一
致性, 根据同源建模原理, 只要目标蛋白与模板蛋
白的同源性大于30%, 即可进行蛋白三级结构的同
源建模。对地黄Ca2+-ATPase进行同源建模模拟,
含有明显4个跨膜结构(图3-C)。
3 Ca2+-ATPase在正茬和连作地黄中的差异表达分析
RT-PCR定量分析显示, Ca2+-ATPase基因在正
茬和连作地黄中的根组织、茎组织和叶组织均有
表达, 但在各组织和各取样时期中的表达量都不
同(图6)。正茬地黄从苗期开始, 随着生长进程的
推进, 表达量逐渐升高, 到成熟期出现降低, 根、
茎、叶表现几乎一致, 但在叶组织中下降较早(图
6-C), 茎组织中后期下降不明显(图6-B)。而Ca2+-
ATPase在连作地黄中却表现出不同的表达模式(图
表1 实验的引物序列
Table 1 The sequences of the primers in the experiment
名称 引物序列(5→3)
Ca2+-ATPase扩增克隆引物 F: TTGTTTATTGTCCGAGTGAA
R: GGTTTAGCCTTCATAACATC
Ca2+-ATPase qRT-PCR引物 F: AGCGACACCACTGAAGAAGAA
R: TCGTAACAACAGCAGGTAGCC
18S内参(DQ469606) F: GTTCTTAGTTGGTGGAGCGATT
R: CAGACCTGTTATTGCCTCAAAC

图2 Ca2+-ATPase基因全长cDNA的RT-PCR克隆
Fig.2 RT-PCR clone full length of Ca2+-ATPase gene
M: DL5000 marker。
刘驰等: 地黄内质网型(ER) Ca2+-ATPase基因的克隆及表达分析 449
图3 Ca2+-ATPase蛋白二级和三级结构分析预测
Fig.3 Analysis and prediction of protein secondary and tertiary structure of Ca2+-ATPase
A: 蛋白疏水性分析; B: 跨膜区预测; C: 蛋白结构预测三维图。
6), 从苗期开始骤然升高, 伸长期(7月22日)达到最
大, 此后出现剧烈下降, 且根、茎、叶表达模式几
乎一致, 这表明连作地黄可能在连作危害的关键
期, 遭受胁迫影响, 钙离子大量从细胞钙库中释放,
间接促进了Ca2+-ATPase基因的表达。而正常生长
发育的地黄Ca2+-ATPase表达随着生长周期的推进,
是逐渐缓慢表达的, 没有出现过多表达变动。
讨　　论
在植物的生长发育过程中, 经常会遭受逆境
胁迫的影响, 而植物对逆境的感知必须通过细胞
膜的一系列变化, 再通过膜受体的一系列磷酸化
反应激活膜上的钙离子通道, 引起钙离子从钙库
释放到细胞质中, 进而导致细胞质内钙离子浓度
增加, 产生钙信号(Alvarez等2010; Hashimoto和
Kudla 2011)。本课题组利用抑制消减杂交技术, 构
建了正反两个抑制消减cDNA文库, 在对正反文库
的细致分析后, 发现大量钙依赖蛋白激酶(CDPK)、
钙调素(CaM)、Ca-ATPase相关基因在连作地黄中
异常表达(范华敏等2012)。由此, 我们提出, 钙信
号系统异常是地黄响应连作而产生毒害的主要原
因。由于消减杂交技术通量较小, 一次得到的差
异表达的特异基因也相对较少, 为了能更全面地
了解正茬及连作地黄体内基因表达的差异模式,
课题组利用Solexa高通量测序技术, 构建了地黄根
图4 不同植物中ER型Ca2+-ATPase进化树分析
Fig.4 Phylogenetic analysised of ER type Ca2+-ATPase
in various plant species
植物生理学报450
图5 不同植物来源Ca2+-ATPase氨基酸序列比对
Fig.5 Comparison of the Ca2+-ATPase amino acid sequences in different plants
Brachypodium: 短柄草; Oryza: 水稻; Populus: 杨树; Vitis: 葡萄; Glycine: 大豆; Arabidopsis: 拟南芥; Rehmannia: 地黄; Zea: 玉米; Nico-
tiana: 烟草; Medicago: 苜蓿。
刘驰等: 地黄内质网型(ER) Ca2+-ATPase基因的克隆及表达分析 451
和叶的转录组文库 , 同时利用数字基因表达谱
(DGE)技术详细研究了两者根和叶差异表达基因,
同样得到了连作地黄钙信号系统异常的结论(杨艳
会2011; Yan等2012)。由于内质网Ca2+-ATPase是钙
信号途径中的一个主要成员, 所以本研究克隆了
该基因全长序列。
本文研究结果也表明内质网型Ca2+-ATPase在
正茬地黄的生长周期中表达量几乎没有太大波动;
而连作地黄在连作毒害的关键时期(膨大初期)出
现显著的上调表达, 此后迅速下降。结合前期工
作可以推测, Ca2+-ATPase可能在连作伤害前期, 由
于胁迫影响导致Ca2+-ATPase表达活性迅速升高,
撤出细胞内钙离子 , 以避免钙信号的长时间响
应。但在连作土壤中的地黄植株由于不能改变周
围的土壤环境, 因此随着长时间的胁迫, 最终使
Ca2+-ATPase受到“疲惫性”伤害, 而表达下降。因
此Ca2+-ATPase在连作障碍中必然起着关键作用,
通过外力调控Ca2+-ATPase活性状况或许能间接缓
解连作危害障碍的影响。
目前, 课题组已经建立了地黄外植体再生系统,
拟利用反向遗传学的方法详细研究内质网型Ca2+-
ATPase基因在连作障碍中作用机制, 为阐明连作障
碍机理和进一步消减连作障碍提供理论依据。
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图6 正茬与连作地黄中各部位Ca2+-ATPase的表达量
Fig.6 Expression analysis of Ca2+-ATPase gene in different parts of frist-planting and continuous cropping of R. glutinosa