全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (9): 1274~1284　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.10131274
收稿 2014-07-04　　修定 2014-08-04
资助 德国自然科学基金DFG (MI1392/1-1)项目和福建省“百人
计划”科研经费。
* 共同第一作者。
** 通讯作者(E-mail: ymiao2013@hotmail.com; Tel: 0591-
86392987)。
植物Whirly蛋白调控叶片衰老的研究进展
林文芳*, 任育军*, 缪颖**
福建农林大学生命科学学院分子细胞和系统生物学中心, 福州350002
摘要: 植物衰老是植物细胞生长发育的最后一个阶段, 其启动的早晚对植物生物量和品质的形成有很大影响。叶片衰老是
植物衰老的主要形式, 受到内外环境因素的诱导, 并被多种转录因子介导的信号传导途径所调控。对叶片衰老调控机制的
研究一直是植物衰老研究中的重点。Whirly蛋白作为一类广泛存于植物中的特异转录因子小家族, 能与单链DNA分子结
合, 双定位于细胞器(线粒体或叶绿体)与细胞核中, 在植物细胞核和细胞器中发挥多种功能, 参与对植物叶片衰老的调控。
本文概述了植物Whirly蛋白的结构和定位, 重点阐述了Whirly蛋白的功能与细胞衰老关系及其对叶片衰老调节机理的研究
进展等, 并对未来的研究方向进行了展望。
关键词: 植物衰老; 叶片衰老; Whirly蛋白; 转录因子; 双定位蛋白
Research Progress of Whirly Proteins in Regulation of Leaf Senescence
LIN Wen-Fang*, REN Yu-Jun*, MIAO Ying**
The Center for Molecular Cell and Systems Biology, College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou
350002, China
Abstract: Senescence is the final step of plant growth and development. Its initiation timing has great influence
on the plant biomass and quality formation. Leaf senescence is the main kind of plant senescence, which is in-
duced by various internal and external environment factors, and regulated by many transcription factor-mediat-
ed signal transduction pathways. It is also the focus study of plant senescence. Whirly proteins are a small
plant-specific transcription factor family, which prefer to bind to single-stranded DNA and are dual-located on
both the organelle (chloroplast/mitochondria) and the nucleus. Whirlys have versatile functions in both nucleus
and organelles, and are involved in the regulation of leaf senescence. This review summarizes the research
progress of Whirlys in plants, which mainly focuses on the structure and subcellular localization characteristics
of Whirlys, the relationship of Whirly functions and cell senescence, and the mechanism of Whirly protein reg-
ulate leaf senescence. The future research trends of Whirly proteins are prospected.
Key words: plant cell senescence; leaf senescence; Whirly protein; transcription factor; dual-localization protein
植物衰老是植物细胞由基因控制并受内外环
境因素影响和诱导的一种自然衰退和死亡过程。
在生长发育的过程中细胞衰老现象无处不在无时
不有, 衰老在植物整个的生命周期中扮演着重要
角色, 具有重要的生物学意义。叶片是植物进行
光合作用产生生长所需物质和能量的重要器官,
在植物的发育过程中发挥重要功能。叶片的衰老
是植物衰老的主要形式, 是植物感受发育、季节
及周围环境的变化而表现出的一种自然响应的衰
退过程, 在这个过程中, 叶片表面的气孔缩小, 叶
绿素和其他大分子如蛋白、核酸、脂肪等发生降
解, 光合作用的活性降低, 叶色逐渐转黄(Lim等
2007; Zhang和Zhou 2013)。植物利用叶片的衰老
来实现其自身营养的循环再利用, 从而保证在发
育的不同阶段获得足够的营养来供应生长, 并在
发育的末期通过衰老机制将营养集中于种子或果
实中, 为后代的孕育、萌发和幼苗的早期生长提
供能量(Pottier等2014)。叶片的衰老受到多种内外
环境因素的诱导, 内因主要包括植物的年龄和各
种激素如乙烯(ethylene, ETH)、茉莉酸(jasmonic
acid, JA)、水杨酸(salicylic acid, SA)、脱落酸(ab-
scisic acid, ABA)和细胞分裂素(cytokinin, CK)水平
林文芳等: 植物Whirly蛋白调控叶片衰老的研究进展 1275
的变化等, 而外因则主要包括各种胁迫的刺激, 如
黑暗、干旱、营养缺乏、低温、损伤、臭氧和病
原菌侵染等(Thomas 2013; Wu等2012; Zhang和
Zhou 2013)。对于大多数农作物而言, 在其产品器
官形成的关键时期, 由于不利因素诱导的叶片过
早衰老会极大地影响作物的产量及其重要品质的
形成。因生物或非生物胁迫导致的作物叶片早衰,
可使农作物如水稻等的产量下降50% (Navabpour
等2003), 对园艺作物(如蔬菜、瓜果和花卉等)的
品质形成亦会造成严重的影响。
研究发现诱导植物叶片衰老的各种内外因素
之间既彼此独立又相互关联, 形成复杂的信号网
络(Zhang和Zhou 2013), 例如自然衰老的叶片中检
测到氧活性物质(ROS)的积累(Khanna-Chopra
2012); 而干旱诱导的拟南芥叶片衰老过程中不仅
伴随着植物激素CKs合成的降低和ABA含量的升
高(Dong等2008; Lee等2012; Rivero等2007), 而且
ABA的升高又促使大量ROS积累, 进而诱发叶片
衰老, 这一过程受到转录因子NTL4/NAC053活性
的介导(Lee等2012)。在模式植物拟南芥中, 随着
叶片的衰老有12%~16%的基因的表达水平发生变
化, 说明这一过程是由转录因子的高活性转录调
控来实现的(Breeze等2011; Buchanan-Wollaston等
2003, 2005; Chen等2002; Guo等2004; Zentgraf等
2004)。进一步的研究发现在衰老的拟南芥中至少
有96个转录因子的表达发生变化(Balazadeh等
2008), 它们分属于20个不同的转录因子家族, 包括
NAC、WRKY、MYB、C2H2锌指、bZIP和AP2-
EREBP等(Buchanan-Wollaston等2005; Chen等
2002; Guo等2004), 其中NAC与WRKY家族中的多
名成员已被证实在叶片衰老的进程中发挥关键作
用(Balazadeh等2008, 2010; Guo等2004; Miao等
2004; Zentgraf等2010; Zhou等2011, 2013)。这些研
究表明转录因子作为联系细胞核和衰老效应基因
的纽带在植物叶片衰老的调控中发挥重要作用。
Whirly (WHY)转录因子小家族是近年来发现
的一类植物特有的能与单链DNA分子结合的蛋白
家族, 已经有相关的研究报道其家族成员参与植
物叶片衰老的调控(Desveaux等2002, 2005; Krause
等2005; Maréchal等2008; Miao等2013)。首个被鉴
定出的Whirly家族成员为p24蛋白, Desveaux等
(2000)从马铃薯(Solanum tuberosum)中将其分离出
来, 并发现它是转录激活因子PBF-2 (PR-10a bind-
ing factor 2), 可以与诱导应答元件ERE (elicitor re-
sponse element)以单链形式结合从而调节马铃薯病
原相关基因pr-10a的表达, 传递抗病信号, 后被命
名为StWHY1。随后, 在拟南芥、大豆、大麦、小
麦、水稻、玉米等众多植物中发现Whirly家族的
存在(Desveaux等2005; 孔凡英等2012; Krause等
2005; Maréchal等2008), 如在拟南芥中发现了3个
成员AtWHY1、AtWHY2和AtWHY3, 在水稻中发
现了2个成员OsWHY1和OsWHY2。随着对Whirly
家族功能的深入研究, 在不同的Whirly基因突变体
中检测到多样的可视或分子衰老表型, 发现Whirly
家族在植物抗病信号转导、维持端粒长度、维护
细胞器基因组的稳定性等方面发挥重要功能(Des-
veaux等2000, 2004; Foster-Hartnett等2007;
Maréchal等2008, 2009; Miao等2013; Prikryl等2008;
Yoo等2007; Xiong等2009), 而且其家族成员的功能
与其蛋白的分子结构和在细胞器中的定位存在相
关性。本文就植物Whirly蛋白的结构、定位、分
子功能和对叶片衰老调控的可能机制等相关的研
究进展进行综述, 重点阐述Whirly蛋白的功能与细
胞衰老之间的关系, 并对这一研究领域未来的发
展方向进行了展望。
1 Whirly蛋白的分子结构及其与核酸序列结合的
特征
1.1 Whirly蛋白的分子结构
Desveaux等(2002)和Cappadocia等(2008,
2010, 2012)先后分析了马铃薯StWHY1、StWHY2
和拟南芥AtWHY1~3蛋白晶体的结构, 包括自由形
式和结合单链DNA分子(single stranded DNA, ssD-
NA)的复合体形式。对马铃薯p24 (StWHY1)蛋白
的分析发现其蛋白由8个β-折叠和3个α-螺旋组成,
其中4个反向平行的β-折叠组成1个β-片层, 2个β-
片层之间相互垂直, 中间由α1螺旋连接, 形成类似
于刀刃的突起, α2和α3螺旋则位于蛋白的C端(Des-
veaux等2002)。进一步的分析发现Whirly蛋白一
般由3个功能结构域组成: Whirly结构域、N端结
构域和C端多变区。Whirly结构域是与ssDNA相结
合的区域, 也是Whirly蛋白细胞核定位信号所在的
区域, 在所有Whirly家族蛋白中最为保守, 尤其是
植物生理学报1276
氨基酸残基KGKAAL、YDW和K (Desveaux等
2005)。N末端结构域主要包含决定Whirly蛋白亚
细胞定位的信号肽序列(叶绿体或线粒体信号肽)
以及转录激活区; C末端多变区则具有自我调节功
能 , 可以调控Whirly蛋白与ssDNA结合的活性
(Desveaux等2002)。Whirly蛋白在植物中是高度保
守的, 孔凡英等(2012)将番茄LeWHY1的蛋白序列
与GenBank中已经公布的其他植物Whirly蛋白的
序列进行比对, 发现无论是双子叶还是单子叶植
物的Whirly蛋白都高度同源。根据Whirly蛋白的N
末端结构域是否含有转录激活区可以将植物
Whirly蛋白分为两种类型, 第一类Whirly蛋白其N
末端结构域不仅含有细胞器定位的信号肽而且还
含有转录激活区, 这一类型的Whirly蛋白在拟南芥
中为AtWHY1和AtWHY3, 在水稻中则为Os-
WHY1; 另一类型的Whirly蛋白则在N末端结构域
只含有细胞器定位的信号肽而没有转录激活区,
如拟南芥AtWHY2和水稻OsWHY2等。这种蛋白
单体结构上的差别表明两种不同类型的Whirly蛋
白在同一植物中可能发挥不同的功能, 如拟南芥
的AtWHY1和AtWHY2, 它们对叶片衰老表型的调
节在基因超表达突变体的表型上正好相反(Maréchal
等2008; Miao等2013), 但是目前对引起这种表型差
异的具体机制还不清楚。
Desveaux等(2000)通过比较p24和溶解状态下
的PBF-2的分子量, 探明PBF-2是由p24形成的同源
四聚体。四聚体的直径为90 Å, 中心厚度为50 Å,
由4个p24蛋白通过中心的螺旋-环-螺旋连接在一
起, 呈C4对称结构, 形态呈螺旋状, Whirly蛋白的名
称由此而来(Desveaux等2002)。Whirly蛋白四聚体
中每个单体的β-片层结构辐射向外, 3个α-螺旋(α1,
α2, α3)向四聚体中心聚集, 从而在四聚体的中心形
成一个疏水的带电中心孔洞。许多植物的蛋白也
可以形成这样的结构, 它们的中心可以用来存储
物质(Grant等1998; Krojer等2008; Sutter等2008;
Theil 1987; Urich等2006)。但Whirly蛋白形成的四
聚体是否也具有这样的功能目前还没有相关的实
验进行论证。Cappadocia等(2012)发现马铃薯St-
WHY2蛋白的四聚体在体外如果有长链ssDNA存
在的情况下还可以进一步聚集形成四聚体的六聚
体, 即二十四聚体。二十四聚体是一个内空的呈
432空间分布的蛋白球壳结构, 其外部直径达到12
nm, 内腔直径为5 nm。Whirly结构域中KGKAAL
基序的第2个赖氨酸(K67)对二十四聚体的形成极
为重要, 实验显示K67突变不影响马铃薯StWHY2
形成四聚体及与ssDNA结合的能力, 但不能形成
二十四聚体。此外, 在高浓度Whirly蛋白和长片段
ssDNA存在的情况下, 两个相邻的二十四聚体还可
以继续通过β-折叠和外表面的ssDNA相互作用形
成四十八聚体。以此类推, 四十八聚体可以进一
步聚集形成更大的蛋白质聚合体, 这些多聚体结
构是与大分子ssDNA结合的基础(Cappadocia等
2012)。
1.2 Whirly蛋白与核酸序列结合的特征
Whirly蛋白可以和ssDNA、dsDNA的溶链部
分以及RNA相结合(Desveaux等2000; Prikryl等
2008; Melonek等2010), 但与ssDNA的结合能力最
强。Cappadocia等(2010)发现Whirly更倾向于与
s sDNA结合可能是因为Whir ly蛋白可以促进
dsDNA向单链DNA状态转换。Melonek等(2010)通
过RNA免疫共沉淀和芯片杂交(RIP-chip)实验表明
与玉米同源的大麦Whirly1能够与包含质体RNA的
内含子相联系, 认为定位于质体的Whirly1首先作
用于RNA代谢而并非作为DNA结合的蛋白。
Whirly蛋白曾被报道与3种序列特异的核酸元件结
合: ERE元件(Desveaux等2000, 2004)、富含AT的
端粒重复序列(Yoo等2007)、拟南芥AtKP1基因的
上游元件(Xiong等2009), 这3种序列之间没有明显
的相似性。而在叶绿体或线粒体内, Whirly蛋白也
可以和叶绿体或线粒体基因组的许多区域结合,
但这些区域之间也没有序列相似性(Cappadocia等
2008; Maréchal等2009; Prikryl等2008)。由此推测
Whirly蛋白与ssDNA的结合可能没有序列特异
性。但是, 最近我们实验室应用染色质免疫共沉
淀测序技术, 发现Whirly1可以特异地结合在GTN-
NNT (类ERE元件)和AAAT的复合元件上, 参与
WRKY53表达的调控(Miao等2013), 这一复合元件
包含了以上三种序列, 而且启动子区域的AT富集
区往往与染色质的构象直接相关(Lim等2007), 这
似乎表明Whirly蛋白与ssDNA结合时受到序列周
围染色质空间构象的影响; 另一方面从Whirly蛋白
的构象上看, 虽然Whirly蛋白结构域高度保守的
林文芳等: 植物Whirly蛋白调控叶片衰老的研究进展 1277
KGKAAL基序是与ssDNA结合所必需的, 但由于
它只参与Whirly蛋白特定的空间结构的维持而不
参与和碱基的结合, 所以并不意味着Whirly蛋白与
ssDNA的结合不是序列特异性的。Desveaux等
(2002)用分子筛凝胶层析和EMSA实验发现马铃薯
p24蛋白以四聚体的形式与ssDNA结合, 每个四聚
体结合一分子的ssDNA, 并推测ssDNA和四聚体的
β-片层面结合, 并围绕p24四聚体折叠。Whirly蛋
白与ssDNA结合主要依赖临近碱基及碱基与疏水
氨基酸残基的堆叠和疏水键作用, 还依赖Whirly四
聚体对称的结构。ssDNA以伸展的构像与Whirly
蛋白结合, 由于dsDNA在结合的过程中存在原子
位阻, 所以Whirly蛋白优先与ssDNA结合。另外
dsDNA骨架存在突然的扭曲也是其不能很好的与
Whirly蛋白结合的一个原因。
2 Whirly蛋白在细胞中的定位
Whirly蛋白被预测可以定位于细胞核、质体
或线粒体中, 其中第一类Whirly蛋白如拟南芥At-
WHY1和AtWHY3被预测定位于质体和细胞核中,
而第二类Whirly蛋白如拟南芥AtWHY2则被预测
定位于线粒体和细胞核中, 并且相关实验也证实
了它们在细胞器中的存在(Krause等2005; Maréchal
等2008, 2009), 但在细胞核中的存在检测到的还不
多。目前唯一被证实存在双定位的Whirly蛋白为
大麦的HvWHY1和拟南芥的AtWHY1, 通过免疫
金标记实验证实其不仅在叶绿体中大量存在, 在
细胞核中也有分布(Grabowski等2008)。而且当将
完整的拟南芥AtWHY1或大麦HvWHY1蛋白的质
体信号肽(PTP)去除后, 通过瞬间表达系统在洋葱
表皮细胞中检测到两种截短的Whirly1蛋白都能以
同源聚合体的形式存在于细胞核中(Grabowski等
2008)。Isemer等(2012b)进一步将拟南芥去掉质体
信号肽(PTP)的AtWHY1连上HA标签后转入烟草
叶肉细胞的叶绿体中, 结果在同一细胞的细胞核
中也检测到AtWHY1-HA蛋白的存在, 说明在细胞
内存在Whirly1蛋白从叶绿体向细胞核中转运的机
制。Whirly蛋白在细胞器和细胞核中都有特定的
功能(Lepage等2013; Maréchal等2008; Miao等
2013), 这可能与Whirly蛋白从细胞器到核的转运
有关, 它们在细胞器中贮存, 而后在某些外界信号
的刺激下(如病菌侵染或衰老等信号)又从细胞器
中释放并运送到细胞核中调节某些靶向基因的表
达, 从而实现细胞器向核的逆向信号的传导。
3 Whirly蛋白的功能和细胞衰老的关系
对拟南芥、马铃薯和大麦等中的Whirly蛋白
的功能研究表明, Whirly家族在细胞核和细胞器中
都具有重要作用, 主要集中在抗病信号传递、维
持端粒内稳态、维持质体或线粒体DNA的稳定
性、调节基因表达等方面, 这些对降低植物细胞
的伤害以及减缓植物细胞衰老等方面具有重要作
用(Desveaux等2000, 2004; Foster-Hartnett等2007;
Lepage等2013; Maréchal等2008, 2009; Miao等
2013; Prikryl等2008; Yoo等2007; Xiong等2009)。
此外, Whirly蛋白与种子萌发(Isemer等2012a)和胚
胎建成(Zhang等2013)等也有一定的相关性。
3.1 抗病信号转导
病原菌感染会加速植物衰老的进程, 影响作
物产量。及时对微生物病原体的侵害做出响应对
于植物抗病性乃至叶片衰老的调节都至关重要。
衰老过程中许多防御基因, 特别是疾病相关蛋白基
因(PRs)的表达量上调(Quirino等2000)。植物对入
侵病原体的感知引起信号转导途径的激活, 以至完
全改变宿主基因组的表达模式(Dangl和Jones
2001)。大量的具有各种生化功能的防御基因, 包
括病程相关基因(PRs), 在病原菌入侵时被激活或
者被抑制(Ryals等1996)。水杨酸(SA)能够诱导植
物抗病基因的表达并使植物产生一种称为系统获
得性抗性(systemic acquired resistance, SAR)的长效
抗病机制。Desveaux等(2000, 2004)发现马铃薯的
StWHY1作为转录因子参与pr-10a基因的激活及水
杨酸(SA)诱导的防御应答反应。Desveaux等(2004)
通过拟南芥AtWHY1基因的TILLING突变体(Mc-
Callum等2000; Colbert等2001)来检测拟南芥中
Whirly1蛋白的抗病功能。两种Atwhy1的突变体与
对照植株相比都表现出对SA诱导的敏感性, 表明
AtWHY1是SA诱导的损伤信号途径中重要的下游
调控元件, 既参与了SA依赖的疾病抗性反应, 又调
节了SA诱导的获得性抗性(SAR)反应下游基因的
表达。进一步的实验表明AtWHY1既参与基础的
病原抗性反应, 也在特殊因素诱导的病原抗性反应
中发挥作用。但是由SA诱导激活的AtWHY1即使
其参与调节获得性抗性(SAR)下游基因的表达, 其
植物生理学报1278
并不依赖于SAR途径中的转录因子相关蛋白NPR1,
表明AtWHY1与NPR1在转换SA诱导的下游信号过
程中是协同作用的(Desveaux等2004)。此外, 与野
生型相比, 拟南芥Atwhy1突变体还表现出对分离的
有毒或无毒的卵菌亚纲类真菌P. parasitica增强的
易感性, 这种易感性与AtWHY1突变后结合活性的
降低直接相关(Desveaux等2004)。这些结果为拟南
芥Whirly1蛋白与抗病反应之间建立了一种直接的
因果关系。另外, Foster-Hartnett等(2007)利用基因
芯片技术分析了豆类作物经白粉病侵染后诱导的
早期防御应答反应和超敏反应, 找到55个与基础防
御相关的基因, 包括与病菌发生相关的基因以及其
他与防御、信号转导、衰老、细胞壁代谢以及非
生物胁迫相关的基因等; 与超敏反应相关的基因则
主要集中于类黄酮通路、其他与转运、转录调控
以及信号转导等相关的基因。在这些诱导表达的
基因中共有34个未知的新基因既与基础防御相关
同时也与超敏反应引起的防御反应相关。在这些
被诱导表达的基因的启动子上可以找到与防御相
关的Whirly蛋白的结合位点, 表明Whirly在豆类作
物中可能同时介导了病原体侵染引起的基础和超
敏抗性反应。
3.2 维持端粒内稳态
染色体完整性是植株能够进行正常生长和发
育的前提, 任何染色体组分不完整都可能引起植
株的衰老和死亡。端粒是真核生物染色体末端特
异的核蛋白复合物, 端粒内稳态对于保持染色体
的完整性至关重要, 它能够保护染色体不受核酸
外切酶降解及染色体间末端的粘合以保证染色体
的完整性(Greider 1996)。大多数分裂细胞显示在
一轮轮的复制后端粒DNA逐步丧失 , 这是由于
DNA的不完整复制引起的(Lingner等1995)。端粒
缩短已被建议作为一种细胞死亡前调控细胞复制
能力的调节机制(Harley 1991)。可以通过激活端
粒酶避免端粒序列的损失而让细胞永生(Counter
等1992)。端粒的稳定与端粒酶和特异蛋白的结合
有关(Kim等2002), 如果能保持端粒酶的活性, 保证
端粒的长度可以避免细胞死亡。Yoo等(2007)通过
质谱分析发现拟南芥AtWHY1是新的端粒结合蛋
白家族的成员。为了确定AtWHY1在端粒生成中
的功能, Yoo等(2007)鉴定了两组Atwhy1的T-DNA
插入突变体, 发现它们在表型上表现出生长或发
育上的缺陷, 但是这些突变体在经历多代的种植
后它们端粒的长度却表现出稳定的增长, 这与检
测到的突变体中端粒酶活性的显著增强存在相关
性。相反, 在AtWHY1超表达转基因植株中端粒酶
的活性明显下降, 端粒的长度也变短。这些结果
表明拟南芥AtWHY1是端粒末端结合蛋白家族的
新成员, 在拟南芥中它能够调节端粒长度的动态
平衡从而参与细胞衰老的调控。
3.3 维持细胞器基因组的稳定
叶绿体和线粒体是植物进行光合作用和呼吸
作用的中心, 二者的组分缺失都能够引起细胞器功
能性损伤并最终导致细胞衰老和死亡。Whirly家
族对维持植物叶绿体和线粒体基因组的稳定性起
着关键作用。Prikryl等(2008)通过免疫共沉淀技术
在玉米中发现了能与CRS1蛋白互作的Whirly家族
蛋白ZmWHY1, 它可以促进玉米叶绿体atpF第二
组内含子的剪接。ZmWHY1定位于叶绿体基质和
类囊体膜上, 并与分布于这些部位的叶绿体基因组
DNA连在一起。通过叶绿体基因组免疫共沉淀实
验, 显示在叶绿体抽提物中ZmWHY1是与质体
DNA连在一起的, 同时也和一部分包括atpF转录本
在内的质体RNA相联系。另外, 在体外实验中Zm-
WHY1可以同时与RNA和DNA结合。ZmWHY1的
等位基因突变显示幼苗白化且缺失质体核糖体, 表
明核糖体缺失的质体改变了质体中RNA转录的特
性。ZmWHY1亚等位基因突变降低了atpF内含子
的剪接效率和质体核糖体的含量。这些突变体中
异常的23S rRNA代谢表明质体核糖体缺陷导致了
核糖体大亚基的合成出现问题。但是这些突变体
中包含的叶绿体DNA和RNA近乎正常水平, 显示
ZmWHY1对于DNA复制或者整个质体的转录都不
是直接必要的。Maréchal等(2009)同样证明在拟南
芥中质体定位的Whirly蛋白WHY1和WHY3也是
维护质体基因组稳定所需要的。在why1why3双突
变体植株中叶片呈现变化的绿/白/黄相间的颜色,
显示叶片中有功能缺损的叶绿体存在。这种叶色
的变化是经母体效应遗传的, 表明why1why3双突
变引起了质体基因组的缺陷。Lepage等(2013)解
析了叶绿体基因组不稳定导致的直接后果, 发现
在why1why3和一种专门的I型DNA聚合酶POLIB
林文芳等: 植物Whirly蛋白调控叶片衰老的研究进展 1279
的突变体(polIb-1)组成的三突变体中质体基因组
的不稳定性与增加的氧活性物质的含量相关, 而
且氧活性物质含量的升高直接体现在三突变体叶
片呈现黄化的趋势上。这种氧化还原的不平衡也
与核基因组出现的表达模式的重编程存在关联,
从而反过来使突变体能够适应高强光照的生长环
境。Maréchal等(2008)则考察了拟南芥线粒体中定
位的Whirly2的功能, 发现在线粒体中Whirly2结合
到线粒体基因组的DNA上。过表达Whirly2扰乱了
线粒体的正常功能, 使线粒体中RNA的转录水平
降低, 线粒体基因组DNA的含量减少, 从而使包含
线粒体基因组DNA编码的蛋白亚单位组成的线粒
体呼吸链复合物的活性降低。线粒体活性的降低
使植株的体型变小, 叶子扭曲并且出现加速衰老
的表型。
3.4 精确调节细胞器基因组的损伤修复
DNA双链断裂对于所有生物都具有很大的危
害, 需要快速而精确的修复。物种进化出高效的策
略来阻止DNA的损伤和重组。在细菌中出现“同
源依赖的非常规重组”的微同源重组调节机制来修
复损伤的DNA (Ehrlich等1993), 这种机制在人类和
酵母中也被发现(Hastings等2009; Lee等2007;
Payen等2008; Redon等2006), 但是因为这种机制不
严格依赖于DNA分子之间的相似性, 因此不是一
种忠实的重组反应过程, 容易导致基因组的不稳定
性。在细菌中, DNA-RRR蛋白可以抑制微同源重
组调节(Hanada等1997, 2000; Mukaihara和Enomoto
1997; Reddy和Gowrishankar 1997; Shanado等2001),
但在细胞器基因组中如何避免断裂和重组还知之
甚少。植物细胞器基因组编码大量的在氧化磷酸
化和光合作用中具有重要功能的蛋白(Green 2011;
Knoop 2004), 这些蛋白对应的编码DNA一旦出现
损伤在植物生长和发育中都会引起致死性的后果
(Gabay-Laughnan和Newton 2012)。在拟南芥和小
立碗藓中已经鉴定出与维持植物质体和线粒体基
因组稳定性相关的蛋白, 其中包括拟南芥中质体定
位的Whirlys蛋白(Maréchal等2009)。Maréchal等
(2009)用环丙沙星作为叶绿体DNA专一的破坏试
剂处理why1why3的双敲除突变体, 结果显示叶绿
体DNA断裂引起的微同源重组调节产生了无功能
的叶绿体, 质体基因组存在放大的环状结构, 这些
环状结构存在由10~18 bp核苷酸组成的短直接重
复序列, 说明这些区域是在重复序列中进行了非常
规重组的修复。Maréchal等(2009)推测Whirlys可
以和质体单链DNA结合并使其稳定, 以避免非常
规重组的出现从而维护拟南芥质体基因组的稳
定。玉米Zmwhy1突变体的质体中也表现出非常规
重组的提高的现象(Prikry等2008)。为了弄清这一
过程中Whirly蛋白的作用机理, Cappadocia等(2010)
分析了几种Whirly-DNA复合体的晶体结构, 揭示
了Whirly蛋白与非特异的不连续ssDNA结合的机
制并提供了一个模型, 显示结合于ssDNA的Whirly
蛋白倾向于精确修复断裂的双链DNA而不是采用
微同源重组调节这一易出错的修复途径。在这个
精确修复的途径中, 四聚体Whirly蛋白与发生双链
断裂的DNA末端的ssDNA粘性末端结合以防止其
与基因组上其他切除的DNA分子的虚假退火。
Cappadocia等(2012)通过原子力显微镜观察到马铃
薯StWHY2蛋白聚合成四聚体的六聚体(二十四聚
体)结合在长链的ssDNA上。这个步骤需要依赖
K67调节下的四聚体与四聚体之间的相互作用。
这一氨基酸发生突变StWHY2就无法形成二十四
聚体或者只能结合在短的ssDNA上。Cappadocia等
(2012)展示了敲除这个赖氨酸的拟南芥whirly突变
体就无法敏感地对双链DNA断裂进行修复, 所以
Whirly蛋白保守的赖氨酸序列对于高阶蛋白的组
装及DNA损伤修复是非常重要的。
3.5 调节发育及衰老相关基因的表达
AtKP1是拟南芥激酶-14B亚家族的一个成
员。前人的研究表明AtKP1主要在幼嫩器官的维
管系统和幼叶表皮毛中表达(Li等2007)。AtKP1基
因启动子上的一个43 bp的AtKP1相关元件KPRE被
认为在拟南芥中负调控AtKP1基因的表达, 从而在
幼苗的子叶和根中完全或部分抑制AtKP1激酶的
活性(Lai等2009)。为了鉴定能与KPRE元件结合的
因子KBF1 (KPRE-binding factor 1), Xiong等(2009)
利用离子交换色谱、G1-过滤色谱和DNA亲和色
谱从拟南芥幼苗的提取物中来纯化KBF1。质谱鉴
定显示KBF1包含转录因子Whirly家族的两个成员
AtWHY1和AtWHY3。KBF1是一个单链和双链
DNA结合因子。CHIP实验显示在体内AtWHY1和
AtWHY3结合于AtKP1基因启动子的上游区域。
植物生理学报1280
通过实时定量PCR分析表明AtWHY1和AtWHY3的
过表达导致AtKP1转录的显著下降。有趣的是水
杨酸处理能够引起AtWHY1和AtWHY3转录的增加
以及AtKP1转录的减少。因此AtWHY1和AtWHY3
作为KBF1的两个成分能够加在KPRE位点上以调
节AtKP1的转录抑制。Whirly参与调节AtKP1在幼
嫩器官维管系统和幼叶表皮毛中的表达, 影响叶
片衰老。
植物衰老是受能量-消耗过程高度调节的(Guo
等2004), 在植物叶片衰老中大部分特定的转录因
子的表达发生上调或下调的改变(Balazadeh等2008;
Breeze等2011; Buchanan-Wollaston等2003, 2005;
Chen等2002; Guo等2004; Zentgraf等2004), 其中
WRKY家族(Miao等2004; Ülker等2007; Zentgraf等
2010; Zhou等2011)和NAC家族(Balazadeh等2010,
2011)在植物叶片衰老的调节中发挥核心作用。
WRKY53是植物叶片早期衰老的一个标志性调控
因子(Miao等2004), 我们发现在拟南芥中Whirly1作
为抑制WRKY53表达的上游抑制调控因子在植株发
育的不同阶段通过调节WRKY53基因的表达水平从
而调控叶片的衰老进程(Miao等2013)。why1突变
体显示出早期衰老的表型, 并伴随WRKY53和衰老
相关蛋白酶基因S A G 1 2表达的上调。在体内
Whirly1结合于WRKY53基因启动子上包含一个诱
导反应元件类似序列GNNNAAATT和一个富含AT
的端粒末端重复序列类似的序列组成的复合序列
区, 结合与否受到植株发育时期的调控。在wrky53
突变体中过表达Whirly1对突变体的持绿表型没有
影响, 而在WRKY53突变的背景下继续敲除Whirly1
则会引起叶片微妙的黄/绿衰老表型, 表明在拟南
芥叶片衰老过程中Whirly1是WRKY53的上调抑制
因子, 具有延缓叶片衰老的作用。
3.6 与胚胎发育和种子萌发相关
胚胎发育和种子萌发是植物生长发育的前提,
Whirly蛋白除了在植株生长和叶片衰老中有作用,
在某些植物中还与胚胎的发育和种子萌发也有关
系。Zhang等(2013)发现在某些遗传背景的玉米中,
胚胎缺陷16突变体(emb16)的植株其胚胎发育停滞
在转化阶段, 而其胚乳继续发育形成大的胚乳。分
子克隆实验揭示Emb16编码质体中与单链DNA/
RNA结合的Whirly1蛋白, 参与维持质体基因组的
稳定和质体核糖体大亚基的形成, emb16突变体的
表型是由于WHY1基因的一个等位基因发生无效突
变造成的。有趣的是, 以前从其他玉米品系中得到
的why1突变体等位基因(why1-1和why1-2)并未影响
胚胎的发育, 只是形成白化苗(Prikryl等2008)。
emb16等位基因的why1突变体是在玉米品系W22的
遗传背景下获得的(McCarty等2005)。emb16和
why1-1杂合形成的F1代小苗同时具有胚胎缺陷和
白化苗性状。将W22遗传背景下的emb16突变转入
遗传背景为A188、B73、Mo17、Oh51a和why1-1
的玉米品系中都能产生胚胎缺陷和白化苗现象。
以上结果表明Whirly1介导的质体基因组稳定性以
及核糖体大亚基的形成在控制玉米质体中蛋白的
翻译对胚胎形成的必要性是依赖于玉米的遗传背
景的, 但在这些不同的遗传背景下Whirly1突变如何
调控玉米胚胎的死亡机制还不清楚。
在拟南芥早期的幼苗发育中可以检测到水杨
酸(SA)含量的升高(Preston等2009), 这有可能是因
为在萌发过程中SA建立的防御机制引起的(Rajjou
等2006)。Rajjou等(2006)报道了拟南芥why1突变体
表现出在萌发时对SA和ABA刺激的敏感性降低。
在含有ABA合成抑制剂abamine的萌发实验中, 野生
型拟南芥的萌发率降低在于它可以抑制黄氧素的
生成, 它是质体定位的ABA的前体, 而SA在萌发中
的作用是伴随着ABA的合成的(Isemer等2012a)。为
了区分是质体还是细胞核定位的Whirly1调节种子
萌发对ABA的响应, Isemer等(2012a)在why1突变体
的背景下过表达完整的Whirly蛋白及去除了质体转
运肽(PTP)的Whirly1。在过表达全长Whirly1的植株
中, Whirly1在质体和细胞核中同时积累, 而去除转
运肽的Whirly1过表达植株, Whirly1只在核中积累。
在核质中都还有外源Whirly1的植株表现出对ABA
的敏感性。而只在核中定位和表达的Whirly1植株
则如同why1突变体一样对ABA不敏感。这一结果
表明质体定位的Whirly1增强了种子萌发和幼苗对
ABA的响应能力。
4 Whirly家族调控叶片衰老的可能机制
如上所述Whirly是一类双定位于细胞器和细
胞核的ssDNA结合蛋白家族。离体蛋白质晶体结
构分析推测定位于质体或线粒体的Whirly蛋白参
与环境胁迫下DNA双链断裂(DSB)过程中DNA单
林文芳等: 植物Whirly蛋白调控叶片衰老的研究进展 1281
链的修复和保护, 这一推测间接地通过Whirly的突
变体分析和抗生素环丙沙星的处理得到部分证据,
由此说明Whirly蛋白参与细胞器基因组的稳定性
和能量代谢及细胞死亡的调控(Maréchal等2008,
2009); 定位于细胞核的Whirly1蛋白主要是作为转
录因子参与病原菌侵染的信号传导途径中的细胞
死亡事件的调控(Desveaux等2000, 2004; Xiong等
2009), 但并未将两者有机联系起来。我们实验室
利用定位于质体的Whirly1和定位于细胞核的
Whirly1的拟南芥突变体进行下游基因的染色质免
疫共沉淀(ChIP)和深度RNA测序分析以及核型
Whirly和细胞器型Whirly的酵母双杂交筛选及其
验证实验, 提出Whirly1蛋白调控叶片衰老的可能
机制, 即在植物生长发育初期质体Whirly1和光合
系统I的蛋白相互作用, 保持植物体正常的光合作
用和能量代谢(未发表的数据), 核型的Whirly1形成
四聚体结合在WRKY53的启动子的单链DNA序列
上, 抑制WRKY53的表达; 当植物生长到一定时期
Whirly1结合WRKY53启动子的能力消失 , 促进
WRKY53高表达, 使其调控植物衰老的相关机制启
动(Miao等2013); 当植物受到环境胁迫或病原菌侵
染时, 质体Whirly1和Whirly3蛋白启动对DNA双链
断裂过程DNA单链的修复和保护功能(Maréchal等
2009), 核型Whirly1蛋白结合到WRKY33的启动子
上激发WRKY33表达(Miao等2013), 从而参与细胞
死亡信号途径的调控。基因芯片(microarray)表达
谱结果分析表明, 诱导质体型Whirly1的表达引起
大量核基因表达的变化, 并与诱导核型Whirly1表
达引起的核基因表达变化有很大程度的重叠(未发
表的数据), 可以推断双定位Whirly蛋白在细胞器
到细胞核逆向信号(retrograde signaling)传导途径
中起着重要作用。
5 展望
细胞核、线粒体和叶绿体在植物中都含有遗
传信息DNA。细胞核是几乎所有遗传信息存储的
中心, 调控植物生长发育过程中极大多数基因的
表达和转录; 叶绿体是植物进行光合作用制造机
体生长所需养分的合成中心, 同时也是感知外界
环境信号刺激的感应器; 线粒体是植物进行呼吸
作用产能作用的中心。三者在植物的生长发育过
程中协同作用, 缺一不可, 任何一个环节出现问题
都会引起植物体叶片衰老, 细胞病变, 细胞死亡,
最终使植物提前进入死亡程序。保护DNA的完整
性, 维持遗传信息的有序表达对于植物体的生长
发育至关重要。Whirly蛋白作为同时定位于细胞
核与细胞器(叶绿体/线粒体)中的ssDNA结合蛋白
小家族, 参与细胞器对外界信号的感知和传递, 调
节核基因的表达以及维护细胞器基因组的稳定
(Desveaux等2000, 2004; Foster-Hartnett等2007;
Maréchal等2008, 2009; Miao等2013; Prikryl等2008;
Yoo等2007; Xiong等2009)。虽然前人的研究已经
取得了一定的进展, 但是对植物Whirly家族调控核
基因表达的具体作用机制目前还不太明确, 我们
推测表观遗传调控机制可能在其中发挥一定的作
用。另外, 以往对Whirly蛋白的研究多集中定位于
质体和细胞核中的第一种类型 ( W h i r l y 1和
Whirly3), 对第二种类型的Whirly2的研究还不够
深入, 是否存在Whirly2蛋白从线粒体向细胞核中
转运的机制目前还不太明确。此外, 作为细胞核
和细胞器之间信号传递连接的信使, Whirly蛋白是
如何将叶绿体/线粒体接收的外界信号传递到细胞
核并调控核基因的表达以应对胁迫刺激对衰老进
程影响的逆向信号传递途径的机制目前知道的也
还很少, 这些方面都需要我们进行深入的研究。
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