全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2016, 52 (5): 653–658　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2016.0152 653
收稿 2016-04-08　　修定 2016-05-03
资助 山东省良种产业化工程项目、“十二五”农村领域国家科
技计划项目(2013BAD02B01)和青岛农业大学大学生科技
创新项目。
* 共同第一作者。
** 通讯作者(E-mail: hydai@qau.edu.cn)。
黑果枸杞的叶片分化与快速繁殖
孙晓红1,2,*, 位书磊1,*, 宋强1, 张玉刚2, 戴洪义2,**
青岛农业大学1生命科学学院, 山东省植物生物技术重点实验室, 2园艺学院, 青岛市园艺植物遗传改良与育种重点实验室,
山东青岛266109
摘要: 以黑果枸杞(Lycium ruthenicum)成熟叶片为外植体, 诱导愈伤组织及不定芽的分化, 获得再生植株, 建立了黑果枸杞
组织培养和快速繁殖技术新体系。结果表明: 诱导叶片脱分化形成愈伤组织的适宜培养基为MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2
mg·L-1, 诱导率100%; 诱导愈伤组织分化和生长的适宜培养基为MS+ZT 1.4 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1, 平均丛生芽数为23.7
株; 诱导生根的适宜培养基为MS+IBA 0.6 mg·L-1+NAA 0.4 mg·L-1, 生根率100%; 将生长良好的组培苗移栽并覆盖保湿膜一
周, 成活率达92.5%。试验成功建立了黑果枸杞快速繁殖体系。
关键词: 黑果枸杞; 叶片分化; 组织培养; 植株再生
黑果枸杞(Lycium ruthenicum)是茄科(Solanceae)
枸杞属多年生多棘刺灌木, 常以灌丛状生长在海
拔400~3 000 m的盐碱荒地、盐化沙地等各种盐渍
化土壤或荒漠环境, 具有防风固沙作用, 是我国荒
漠地区特有的野生植物(矫晓丽等2011)。其果实
富含蛋白质、枸杞多糖、氨基酸、维生素、矿物
质、微量元素等多种营养成分, 其药用和保健价
值远远高于普通红枸杞, 还富含特有的原花青素
和花青素, 是天然的抗氧化剂, 具有延缓衰老的作
用(田磊等2015)。然而近年来, 由于自然环境恶化
和人为采伐对植株的破坏, 使得其野生居群数量
和规模大面积减少(汪智军等2013), 严重影响黑果
枸杞产量(阿力同·其米克等2014), 因此对黑果枸
杞的大量繁育工作就更加迫切。目前黑果枸杞的
育苗主要是以嫩枝扦插为主(刘克彪等2014), 辅助
以无菌黑果枸杞幼苗的子叶、下胚轴和胚根为外
植体(乔永旭2015), 幼嫩茎段为外植体(陈晓丹等
2015; 浩仁塔本等2005)的再生快繁手段。本研究
以室外成熟黑果枸杞叶片为外植体, 进而对不定
芽的诱导、增殖、生根及幼苗移栽进行研究, 以
期建立野生黑果枸杞叶片的组织培养和快速繁殖
技术, 为黑果枸杞的遗传转化、大面积栽培、开
发利用及保护提供技术支持。
材料与方法
1 实验材料
以黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)成熟的
叶片为试材, 实验材料来源于青岛农业大学果树
育种实验室人工栽培的来自青海的野生黑果枸杞
种子萌发成长一年的植株。
2 方法
2.1 外植体消毒
剪取黑果枸杞成熟健康叶片, 用1%吐温(或洗
衣粉)水浸泡15 min, 自来水冲洗20 min。在超净工
作台上, 用75%的酒精浸泡消毒30 s, 无菌水冲洗1
次, 再用0.1%氯化汞(HgCl2)溶液浸泡消毒6~8 min,
期间不断晃动, 使外植体各面均接触到消毒液, 无
菌水清洗5次, 获得无菌外植体材料。
2.2 培养基
以MS为基本培养基, 根据实验目的添加不同
浓度的6-BA (苄基腺嘌呤)、ZT (玉米素)、NAA
(萘乙酸)和IBA (吲哚丁酸), 添加蔗糖30 g·L-1, 琼脂
8 g·L-1。调培养基pH值均为5.8, 121°C高压蒸汽灭
菌25 min, 分装。
2.3 培养条件
培养温度25°C±1°C, 光照强度40 μmol·m-2·s-1,
光照时间12 h·d-1。
2.4 初代培养(愈伤组织诱导培养)
将消毒好的叶片, 切成1 cm左右片段(一片叶
约分为3段), 叶面朝上, 分别接种于含不同浓度
6-BA (0.8、1.0、1.2 mg·L-1)和NAA (0.15、0.20、
0.25 mg·L-1)的愈伤组织培养基上, 每个培养皿接
种12片小叶段, 每组培养基接种3个培养皿。光照
培养, 研究不同培养基对黑果枸杞愈伤组织诱导
的影响, 计算诱导率和愈伤组织增殖倍数。
植物生理学报654
2.5 增殖培养(不定芽分化培养)
取长势旺盛的愈伤组织, 分割成生长状况和
大小(约1 cm3)基本一致的愈伤组织团块, 分别接种
于含不同浓度ZT (0.6、1.0、1.4 mg·L-1)和NAA
(0、0.02 mg·L-1)的增殖培养基上, 每瓶接种3块愈
伤组织团块, 每组重复6次。光照培养, 定期观察
记录生长情况, 统计不同培养基对黑果枸杞愈伤
组织分化不定芽的影响, 计算芽苗的高度和平均
芽数。
2.6 生根培养
剪取株高3 cm以上, 带有10片左右叶片的枸
杞增殖苗, 分别接种于含不同浓度IBA (0.6、0.8、
1.0 mg·L-1)和NAA (0.2、0.4 mg·L-1)的生根培养基
中, 每瓶接种3棵无根幼苗, 每组重复6次, 研究不
同培养基对黑果枸杞生根诱导的影响, 15 d后记录
生根率、平均根数、平均根长, 观察根系及小芽
生长情况。
2.7 生根苗移栽
生根培养30 d左右, 选择根系发育良好, 株高
8~10 cm, 根系长度约3 cm及以上的枸杞无菌苗, 把
根部沾附的培养基轻轻捏碎, 在水中清洗干净, 在
此过程中避免伤及根部或造成根部断裂、脱落,
将根系完整的幼苗移栽入灭菌的营养土中。不同
移栽方式如下: (1)直接移苗。移苗后, 室内无直射
光照培养7 d, 转入正常光照生长; (2)炼苗后移苗。
实验室自然光照, 室温通风条件下, 炼苗7 d, 移栽,
正常光照生长; (3)移苗覆膜。无需炼苗, 移苗后覆
盖保湿膜7 d, 正常光照生长。35 d后统计成活率。
3 数据处理
数据采用Excel 2007以及DPS 9.5进行统计分
析, 用平均值±标准误表示。
实验结果
1 黑果枸杞叶片愈伤组织诱导
将消毒后的外植体接种到诱导愈伤组织的培
养基上(图1-A), 培养6~9 d后, 外植体切口处逐渐
拱起, 膨大呈瘤状, 出现白色愈伤组织, 愈伤组织
呈松散颗粒状; 2周左右开始增殖, 颜色由浅变深,
逐渐变成深绿色, 3周左右, 愈伤组织增值速度达到
峰值, 同时, 愈伤组织开始分化; 4周后愈伤组织表
面可见绿色不定芽点(图1-B)。表1为培养20 d的统
计结果, 可以看出, 不同植物生长调节剂对诱导黑
果枸杞愈伤组织生长的影响较大, 差异达到显著
水平。在细胞分裂素6-BA浓度一定的情况下, 随
着NAA浓度的升高, 愈伤组织的增值倍数相应增
高; 在NAA浓度固定的情况下, 随6-BA浓度的增
高, 愈伤组织诱导率和分化率均增高, 但愈伤组织
玻璃化现象严重, 有效不定芽数减少。
图1 黑果枸杞的丛生芽诱导和植株再生
Fig.1 Buds induction and plant regeneration of L. ruthenicum
A: 接种外植体; B: 外植体诱导20 d产生的愈伤组织; C: 分化丛生芽; D: 丛生芽生长20 d; E: 生根培养; F: 植株生长良好, 粗壮; G: 根生
长情况; H: 移栽的穴盘苗; I: 移栽2个月后的壮苗。
孙晓红等: 黑果枸杞的叶片分化与快速繁殖 655
表1 不同植物生长调节剂对黑枸杞愈伤组织诱导生长的影响
Table 1 Effects of different plant growth regulator combinations on callus induction of L. ruthenicum
植物生长调节剂浓度/mg·L-1
愈伤组织诱导率/% 愈伤组织增殖倍数 愈伤组织生长情况

6-BA NAA
0.8 0.15 83 2.01±0.22d 长势慢, 淡黄色愈伤组织, 疏松
0.8 0.20 88 4.10±0.14c 淡黄色愈伤组织, 有白色小泡, 较致密
0.8 0.25 91 3.99±0.18c 淡黄色, 有白色小泡, 较致密
1.0 0.15 94 4.95±0.20c 长势稍快, 淡绿色, 致密团
1.0 0.20 100 9.01±0.57a 长势快, 绿色愈伤组织, 致密团块
1.0 0.25 100 8.03±0.65a 长势快, 绿色愈伤组织, 结构致密
1.2 0.15 100 6.20±0.43b 黄色愈伤组织, 致密团块, 个别玻璃化
1.2 0.20 97 7.92±0.41a 长势较快, 黄绿色愈伤组织, 有玻璃化
1.2 0.25 100 8.09±0.51a 长势快, 愈伤绿色组织, 玻璃化严重
　　愈伤组织诱导率为诱导愈伤组织的外植体数/总外植体数×100%; 愈伤组织增殖倍数为愈伤组织体积与接种时叶片体积比值的平均
数; 同列数字上标不同小写字母表示处理间的差异显著(P<0.05), 下表同此。
综合结果, 培养基MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA
0.2 mg·L-1愈伤组织的诱导率达100%, 愈伤组织生
长快, 增值倍数为9.01, 愈伤组织绿色, 致密团状,
无玻璃化, 为本试验诱导枸杞愈伤组织生长的最
适宜激素配比。
2 黑果枸杞不定芽分化培养
将黑果枸杞外植体诱导出的带不定芽点的愈
伤组织, 培养15 d后统计和观察不定芽的增殖情况
(表2、图1-C)。由表2可知, 培养基中单纯添加玉
米素ZT, 随着ZT浓度的升高, 丛生芽的平均高度和
数目均增加, 芽生长状态由弱到强, 但都有不同程
度的玻璃化; 培养基中添加0.02 mg·L-1的NAA后再
添加ZT, 玻璃化程度大大减弱, 且随着ZT浓度的升
高, 丛生芽的平均高度和数目都有增加, 且长势均
匀, 叶片鲜绿。
综合平均芽苗高度及平均芽数目和丛生芽形
表2 不同植物生长调节剂对黑枸杞分化培养的影响
Table 2 Effects of different plant growth regulator combinations on adventitious shoot differentiation of L. ruthenicum
植物生长调节剂浓度/mg·L-1
平均株高/cm 芽玻璃化程度/% 平均丛生芽数/个 丛生芽生长状况
ZT NAA
0.6 0 <1.0 70 6.33±0.76d 苗长势缓慢、叶片肥厚含水量大, 玻璃化严重
1.0 0 <1.0 55 10.83±2.09cd 苗长势不均、矮细, 叶片粗短, 玻璃化严重
1.4 0 <2.0 35 15.33±1.23bc 苗长势较均匀、叶片微卷曲, 部分玻璃化
0.6 0.02 1~2.5 10 13.10±1.45bc 苗长势均匀、茎细弱、叶片少量玻璃化
1.0 0.02 1~3.5 0 16.83±1.27b 苗长势较均匀、叶片细长伸展, 浅绿色
1.4 0.02 2~4.5 0 23.66±3.14a 长势均匀茂盛、高壮, 叶鲜绿色, 最高可达4.5 cm
　　平均丛生芽数为所有愈伤组织块上分化的芽数之和与总接种的愈伤组织数比值。
态, 可知培养基MS+ZT 1.4 mg·L-1+NAA 0.02
mg·L-1最适合黑果枸杞的不定芽分化, 在此培养基
下, 平均丛生芽数为23.7, 幼苗长势均匀, 最高可达
4.5 cm, 且植株粗壮, 利于生根(图1-D)。
3 黑果枸杞生根培养
剪取株高3 cm以上带有10片左右叶片的枸杞
单苗在生根培养基上培养(图1-E), 7 d开始诱导生
根, 突出根生长点, 15 d后统计生根实验结果(表
3)。培养基MS+IBA 0.6 mg·L-1+NAA 0.4 mg·L-1与其
他培养基相比差异显著, 表现为生根速率快, 根系
生长迅速, 且根长势均匀、数量多, 植株最高约5 cm,
健壮, 叶片肥厚, 深绿色。生长约30 d, 株高可达10
cm以上, 根系长满培养基(图1-F、G)。添加IBA 0.6
mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1和添加IBA 0.8 mg·L-1+NAA
0.4 mg·L-1的培养基生根慢, 根丛生, 粗短, 个别不
生根, 植株生长慢。MS+IBA 0.8 mg·L-1+NAA 0.2
植物生理学报656
表4 不同移栽方法对枸杞幼苗存活率的影响
Table 4 Effects of different planting methods on survival rate
of L. ruthenicum
移苗方式 移栽总株数/株 存活株数/株 存活率/%
直接移苗 40 18 45
炼苗后移苗 40 34 85
移苗覆膜 40 37 92.5
表3 不同植物生长调节剂对黑枸杞生根的影响
Table 3 Effects of different plant growth regulator combinations on rooting of L. ruthenicum
植物生长调节剂浓度/mg·L-1
生根率/% 平均根数/条 根长/cm 根生长情况

IBA NAA
0.6 0.2 100 3.2±1.28bc 0.5~1 生根慢, 根丛生, 整齐度稍差
0.8 0.2 100 4.3±1.86b 0.5~1 生根较快, 粗壮, 部分基部有愈伤组织
1.0 0.2 83 2.3±1.14c ≤0.5 生根慢, 几乎无侧根, 个别不生根, 植株低矮
0.6 0.4 100 6.1±1.44a 0.5~1.5 生根快, 根系旺盛, 植株健壮
0.8 0.4 88 3.1±0.49c ≤0.5 生根慢, 根短, 个别不生根
1.0 0.4 94 2.6±0.62c ≤0.5 生根慢, 根细, 侧根少, 植株细弱
mg·L-1培养基生根较快, 但部分基部有愈伤组织,
植株长势旺盛。IBA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1以
及IBA 1.0 mg·L-1+NAA 0.4 mg·L-1的培养基生根缓
慢, 侧根少或几乎无侧根, 个别不生根, 植株矮小,
生长缓慢。
综合根的数目、长度及苗的生长状况, 筛选
出MS+IBA 0.6 mg·L-1+NAA 0.4 mg·L-1为适合黑果
枸杞再生苗生根的培养基。
4 黑果枸杞无菌苗移栽
不同的移栽方式, 枸杞幼苗的成活率不同, 移
栽35 d后统计的成活率见表4。幼苗移栽(图1-H)
时, 不进行炼苗处理, 直接移苗, 且用保湿膜覆盖,
保持幼苗的湿度和温度, 可大大增加枸杞幼苗存
活率, 达到92.5%。不经炼苗且不进行任何保湿措
施, 成活率只有45%; 炼苗后移苗, 成活率85%。枸
杞幼苗生长2个月可高达20 cm (图1-I)。
讨　　论
黑果枸杞的外植体(叶片), 利用75%乙醇处理
30 s, 0.1%氯化汞溶液处理7 min, 消毒效果良好,
基本无染菌现象。
黑果枸杞叶片愈伤组织诱导最适宜培养基是
MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1, 在此培养基
中, 叶片易被诱导, 短时间内(7 d左右)开始生成愈
伤组织, 在切口处膨大成浅绿色瘤, 呈松散粒状,
随着培养时间的延长, 愈伤组织大量增值, 同时颜
色转变为深绿色 , 并开始分化出现绿色不定芽
点。叶片的愈伤组织较茎尖基部有更强的分化能
力(王芳等2004), 且随着细胞分裂素6-BA浓度升高
愈伤组织诱导率升高(浩仁塔本等2005), 分化率升
高。洪震等(2015)在研究秀丽野海棠叶片不定芽
再生时也得出同样的结论。继续升高6-BA浓度,
玻璃化现象加重, 这与紫叶狼尾草(Pennisetum seta-
ceum ‘Rubrum’)的研究结果一致(魏进莉等2015)。
玻璃化的发生也与培养皿内湿度密切相关, 皿内
湿度大, 在培养皿上盖凝结成小水滴, 也可能提高
玻璃化的发生率(曹有龙等2008)。适量减少细胞
分裂素, 降低培养基湿度, 可以减少愈伤组织玻璃
化(杜国利等2006)。
在黑果枸杞不定芽分化培养中, 培养基MS+
ZT 1.4 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1分化效果最好, 幼
苗长势均匀, 最高可达4.5 cm, 且植株粗壮, 利于生
根, 该培养基为本试验枸杞分化最佳配方。单纯
的ZT, 不利于芽的分化, 芽生长缓慢, 叶片浅绿色,
易出现玻璃化现象。但随着ZT浓度增加, 小芽生
长情况变好, 颜色变深, 茎粗壮, 有效芽增多, 高浓
度ZT处理的小芽高度高于低浓度的, 具有显著性
差异。朱春艳等(2006)研究云锦杜鹃(Rhododen-
dron fortunei)对ZT的反应也出现类似现象。培养
基中添加NAA明显提高了不定芽的分化率, 且叶
片颜色深绿, 长势旺盛; 适当降低琼脂浓度至6.5
g·L-1, 可以提高丛生芽的分化, 降低玻璃化程度(曹
有龙等2008)。后续的试验可以继续提高ZT和
NAA的浓度, 研究二者更合适的配比, 在提高分化
率的基础上, 有效提高分化速度, 为黑果枸杞的遗
传转化提供参考。
孙晓红等: 黑果枸杞的叶片分化与快速繁殖 657
黑果枸杞分化芽在MS+IBA 0.6 mg·L-1+NAA
0.4 mg·L-1培养基上, 生根率100%, 生根速率快, 根
长势均匀, 侧根多, 为本试验枸杞生根培养最佳激
素配比, 这与郑国琴和柳金凤(2012)对宁夏枸杞叶
片的研究和马彦军等(2015)对黑果枸杞茎段的研
究稍有不同。IBA和NAA被广泛应用于组培苗的
生根培养, 尤其添加NAA能有效诱导生根(刘芳等
2016), 组培苗根数越多, 根对养分的吸收面积越
大, 生根苗的长势越好, 可提高移栽成活几率。
在移苗过程中, 未经炼苗直接移栽, 在室内无
直射阳光处, 生长良好, 挪到阳光下, 叶片大部分
萎蔫, 成活率只有45%; 第二种移苗方式需要炼苗,
在炼苗过程中, 培养基容易受到外界环境污染, 培
养基中水分蒸发, 根部培养基干燥, 难以清洗干净,
易引起移栽苗烂根死亡, 影响苗子的成活率; 第三
种移苗方式, 无需炼苗, 直接移栽, 用地膜覆盖保
湿, 随着时间的延长, 逐步打开地膜, 7 d后完全解
膜, 正常光照生长, 成活率可达92.5%。基质的灭
菌是十分必要的程序, 试管苗从无菌环境转入有
菌环境生长, 如果没有灭菌的保护性措施就很难
抵御外界杂菌的侵染, 在移栽前必须做好基质的
消毒工作。
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Leaf differentiation and rapid propagation of Lycium ruthenicum
SUN Xiao-Hong1,2,*, WEI Shu-Lei1,*, SONG Qiang1, ZHANG Yu-Gang2, DAI Hong-Yi2,**
1Key Laboratory of Plant Biotechnology of Shandong Province, College of Life Sciences, 2Qingdao Key Laboratory of Genetic
development and breeding in Horticultural Plants, College of Horticulture, Qingdao Agricultural University, Qingdao, Shandong
266109, China
Abstract: In the paper, we studied in vitro culture of Lycium ruthenicum by using leaf explants, including cal-
lus induction, adventitious shoot differentiation and plantlet regeneration. The results indicated that MS+6-BA
1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1 was the suitable medium for callus induction, with an induction rate of 100%;
MS+ZT 1.4 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1 was the optimizing medium for multiple shoot clumps, the multiplication
coefficient could reach up to 23.7; MS+IBA 0.6 mg·L-1+NAA 0.4 mg·L-1 was the best medium for rooting, the
rooting rate could reach to 100%. The strong rooting plantlets were transplanted into nutritive soil and covered
the young plants with plastic farm film for a week, the survival rate were 92.5%. We have established a
high-frequency regeneration system for L. ruthenicum.
Key words: Lycium ruthenicum; leaf differentiation; tissue culture; plantlet regeneration
Received 2016-04-08 Accepted 2016-05-03
This work was supported by the Seed Industrialization Project in Shandong Province, the “Twelfth Five-Year” Plan Project by National Science
and Technology in Rural Areas (Grant No. 2013BAD02B01), and the Project of Scientific Innovation for University Students, Qingdao Agricultural
University.
*Co-first author.
**Corresponding author (E-mail: hydai@qau.edu.cn).