全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (5): 778~784　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0467778
收稿 2015-03-19　　修定 2015-04-24
资助 国家自然科学基金(31171944和30771483)、国家大学生创
新训练项目(201310364005)和安徽省大学生创新训练项目
(AH201310364044)。
* 通讯作者(E-mail: ypcaiah@163.com; Tel: 0551-65786137)。
砀山酥梨果实F5H表达与石细胞发育的分析
徐超1, 方志1, 杨芳梅1, 杨君祎1, 闫冲冲1, 邹鹤伟1, 张金云2, 林毅1, 蔡永萍1,*
1安徽农业大学生命科学学院, 合肥230036; 2安徽省农业科学院园艺研究所, 合肥230031
摘要: 薄壁细胞次生壁木质化是石细胞形成的关键, 石细胞团聚合主要受木质素单体组分及官能团含量的影响。阿魏酸5-
羟化酶(F5H)是木质素合成途径中的一种关键酶, 主要调控紫丁香基木质素(S木质素)单体的生物合成。本研究以砀山酥梨
果实为材料, 利用RT-PCR和RACE技术, 得到砀山酥梨F5H全长cDNA, 命名为PbF5H (GenBank登录号为KC852907)。
PbF5H全长1 978 bp, 其开放阅读框为1 551 bp, 编码516个氨基酸, 推测蛋白分子量是58.4 kDa, 等电点为6.49。进化树分析
表明, 砀山酥梨F5H蛋白与其他物种具有很高同源性, 与苹果的相似性达到96%。相关性分析表明, 砀山酥梨木质素含量与
石细胞含量和PbF5H表达量高度正相关。且砀山酥梨PbF5H参与调控梨果实S木质素单体的合成, 影响木质素G/S比值。
关键词: 砀山酥梨; PbF5H; 生物信息学分析; 荧光定量表达; G/S比值
Analysis of F5H Expression and Stone Cell Development in Pyrus bretschneideri
cv. Dangshan Su Fruit
XU Chao1, FANG Zhi1, YANG Fang-Mei1, YANG Jun-Yi1, YAN Chong-Chong1, ZOU He-Wei1, ZHANG Jin-Yun2, LIN Yi1, CAI
Yong-Ping1,*
1School of Life Sciences, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 2Horticultural Institute, Anhui Academy of Agricul-
tural Science, Hefei 230031, China
Abstract: The development of pear stone cells is closely related to the deposition of lignin on secondary cell
walls, and the degree of stone cell polymerization is mainly determined by the lignin monomer composition and
the content of functional groups. Ferulate 5-hydroxylase (F5H) is a key enzyme in lignin biosynthesis pathway
that mainly regulates syringyl lignin. In this study, we cloned a F5H gene, named PbF5H (GenBank Accession
No. KC852907) in Pyrus bretschneideri cv. Dangshan Su fruit by RT-PCR and RACE methods. The PbF5H
cDNA comprises 1 978 bp, with an ORF of 1 551 bp, which encodes a putative protein containing 516 amino acid
residues. The protein molecular weight is 58.4 kDa and the isoelectric point is 6.49. Phylogenetic analysis indicat-
ed that PbF5H protein shared high homology with other plant F5Hs, and showed 96% homology with Malus do-
mestica. Correlation analysis showed that, lignin content had a highly positive correlation to stone cell content and
PbF5H expression level. PbF5H as the key gene of syringyl lignin biosynthesis contributed to the G/S ratio.
Key words: Pyrus bretschneideri cv. Dangshan Su; PbF5H; bioinformatics analysis; real-time quantitative
expression; G/S ratio
砀山酥梨(Pyrus bretschneideri cv. Dangshan
Su)属白梨(Pyrus bretshneider Rehd)系品种, 是我
国种植面积最广, 产量最大的梨品种, 经济价值突
出。但由于品种退化、田间粗放管理等原因, 梨
果实石细胞含量增多, 口感多渣, 严重影响了果实
的品质和经济价值(聂敬全等2009)。
梨果实石细胞的品质是由石细胞团的聚合度
和密度二者综合决定的, 石细胞团的聚合度更能
影响梨果实品质与口感(陈昭存等2000)。砀山酥
梨石细胞发育过程中, 薄壁细胞次生壁木质化是
引起石细胞形成的关键(李玲等2004), 石细胞聚合
度主要受木质素单体组成及官能团含量的影响(Yan
等2014), 石细胞含量和木质素含量呈显著正相关,
石细胞木质素由G和S单体组成, 且G木质素含量高
于S木质素(Cai等2012)。其中G木质素更易形成比
较稳定、不易降解的C=C。所以, 当G/S比值越高,
其形成的聚合体木质素越难以降解(Jin等2013)。
徐超等: 砀山酥梨果实F5H表达与石细胞发育的分析 779
迄今, 木质素合成代谢途径已基本阐明(Van-
holme等2010; Oda和Fukuda 2012; 闫丽等2013), 阿
魏酸5-羟化酶(F5H)在木质素合成途径中催化阿魏
酸、松柏醇、松柏醛生成5-羟基阿魏酸、5-羟基
松柏醇和5-羟基松柏醛(Osakabe等1999)。F5H对S
木质素合成起限速的作用, 过量表达导致S木质素
含量增加, 总木质素含量不变(Franke等2000)。在
转基因拟南芥中, 用C4H启动子调控F5H过表达, S
木质素含量高达95% (Weng等2010)。而转基因杨
树中, 在木质素总量及植物表型不变的情况下, S
木质素显著显著增加, 细胞强度降低(Huntley等
2003)。因此, 对砀山酥梨PbF5H的调控可能是改
良梨果实木质素G和S单体比例, 从而影响梨石细
胞含量和石细胞团聚合度, 改善梨果实品质的有
效手段。但到目前为止, 砀山酥梨PbF5H表达如何
调节梨木质素单体变化和石细胞团聚合度的研究
未见报道。
梨是自交不亲和的植物, 花粉直感现象明显
(陈昭存等2000), 自花授粉不结实, 异花授粉可能
在很大程度上影响果实品质。本实验以砀山酥梨
果实为材料, 克隆PbF5H的cDNA全长。以座果率
高、品质差异显著的2个品系(砂梨系圆黄, 白梨系
鸭梨)为父本对砀山酥梨异花授粉(张金云等2010),
研究该基因在砀山酥梨异花授粉的果实中表达模
式, 分析PbF5H表达与梨果实石细胞含量、木质素
含量、木质素单体G/S比值的关系, 为进一步研究
砀山酥梨PbF5H功能及调控模式奠定基础。
材料与方法
1 材料
实验材料为砀山酥梨(Pyrus bretschneideri cv.
Dangshan Su)果实, 采自安徽省砀山果园场。结合
实验室前人的研究(张金云等2010), 以座果率高、
品质差异显著的2个品系(砂梨系圆黄, 白梨系鸭梨)
为父本对砀山酥梨异花授粉, 分别于花后23、39、
47、63、79和145 d取样, 果实保存于–80 ℃备用。
2 方法
2.1 砀山酥梨总RNA提取及反转录
采用天根公司 RNA prep Pure Plant Kit试剂盒
提取砀山酥梨果实的总RNA。总RNA反转录采用
TaKaRa公司的PrimScriptTM first strand cDNA syn-
thesis kit试剂盒。合成的cDNA于–20 ℃保存备用。
2.2 PbF5H全长cDNA克隆
根据GenBank上其他植物的F5H蛋白保守区
段序列设计简并引物PbF5H-F和PbF5H-R (表1)。
反应条件为: 94 ℃预变性 5 min; 94 ℃变性45 s, 56
℃退火 45 s, 72 ℃延伸1 min, 30个循环; 最后72 ℃
延伸10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检
测, 回收纯化目的条带, 连接 pMD18-T载体, 转化
感受态 E. coli DH5α, 将PCR验证的阳性克隆送上
海生工测序。
根据测序结果, 设计3′ RACE和5′ RACE反应
所需的引物: 3′ RACE outer primer, 3′ RACE inner
primer, 5′ RACE outer primer, 5′ RACE inner primer
(表1)。本实验中所用到的全部引物如表1所示。3′
表1 本研究中使用的主要引物
Table 1 Primers used in this study
引物名称 序列(5′→3′)
PbF5H-F CAN TAYGAYMGNGCNGAYAT
PbF5H-R CCNCCRAACATNACRTCCAT
3′ RACE outer primer ACAATAGACTCGCTAAGGCTCG
3′ RACE inner primer TCGGCTGTAAACATCGGAGAGT
5′ RACE outer primer AACGACTCACGAGCCTTAGCGA
5′ RACE inner primer CTCTCCGATGTTTACAGCCGAA
cdsF CATGCCATGGATTCTCTTCTGC (划线显示NcoI识别序列)
cdsR CCCAAGCTTCATCACCATCAGAGTGG (划线显示HindIII识别序列)
Tubulin-F AGAACAAGAACTCGTCCTAC
Tubulin-R GAACTGCTCGCTCACTCTCC
QF5H-F TAGGATCCATGGGTTCGACCCCAGAG
QF5H-R GCAAGCTTGCAGAGGGAGCATGCCA
植物生理学报780
RACE和5′ RACE (Smart Race Kit, Clontch. Polo
Alto)方法步骤参照试剂盒说明书。PCR扩增并胶
回收目的条带, 连接 pMD18-T载体, 转化感受态
E. coli DH5α, 将PCR验证的阳性克隆送上海生工
测序, 根据测序结果拼接获得PbF5H的全长。
根据PbF5H的ORF, 设计带有酶切位点的引
物cdsF和cdsR (表1)。PCR扩增并胶回收目的条带,
连接 pMD18-T载体, 转化感受态 E. coli DH5α, 将
PCR验证的阳性克隆送上海生工测序。
2.3 PbF5H核苷酸序列和生物信息学分析
利用各种在线网站的生物信息学软件对PbF5H
核苷酸序列进行分析: 利用在线网站(http://isoelec-
tric.ovh.org/)预测砀山酥梨PbF5H蛋白的理论分子
量与等电点等; 利用DNAman软件进行序列分析和
进化树绘制; 利用TMHMM2.0 Server v.2对砀山酥
梨PbF5H蛋白的跨膜结构域进行预测(崔晓燕等
2013); 利用PredictProtein (http://www.predictpro-
tein.org/)在线分析工具预测蛋白的二级结构等。
2.4 PbF5H实时荧光定量表达分析
根据获得的PbF5H全长序列设计荧光定量
PCR特异性引物QF5H-F和QF5H-R, 选取β-Tubulin
(登录号为AB239680.1)作为内参基因(Imai等2014),
设计内参引物Tubulin-F和Tubulin-R (表1)。使用
ABI7500荧光定量PCR仪反应, 以梨果实的cDNA
为样本, 每个样本做三个重复, 按照2-ΔΔCT法计算基
因的相对表达量。反应体系: SYBR® Premix Ex
Taq™ II (2×) 10 μL, 模板cDNA 1 μL, 上下游引物
各0.5 μL, 加水补充至20 μL体系。PCR反应程序
为: 95 ℃预变性30 s; 95 ℃变性15 s, 60 ℃退火20 s,
72 ℃延伸20 s, 40个循环。
2.5 石细胞含量测定
参照Cai等(2012)方法测定: 采用四分法称取
梨果肉5.0 g左右, 于–20 ℃冰箱中处理24 h, 匀浆3
min, 转速为20 000 r·min-1, 向烧杯中加水并静置数
分钟。然后将烧杯上层的碎果肉倒出, 再加水重
复此步骤, 直至上层液体澄清。过滤, 烘干得到石
细胞。3次称重, 取平均值, 计算石细胞含量[石细
胞含量(%)=石细胞干重(g)/5 g×100]。
2.6 木质素含量测定
参照Cai等(2012)方法测定: 梨果实去核去皮
后果肉烘干, 研磨成粉末, 过筛, 甲醇抽提后烘干,
取0.2 g干粉样品, 15 mL 72% H2SO4 30 ℃抽提1 h,
加115 mL蒸馏水煮沸1 h, 保持总体积不变; 将反应
后混合液过滤, 用500 mL热水冲洗, 得到的木质素
烘干后称重, 重复3次, 计算木质素含量[木质素含
量(%)=木质素干重(g)/0.2 g×100]。
2.7 木质素单体测定
参照Cai等(2012)的方法, 提取砀山酥梨果实
石细胞磨木木质素。然后参照Kevin等(2006)方法:
将50 mg磨木木质素样品溶于1 mL吡啶/乙酸酐
(1:1)混合溶剂中, 氮气保护, 常温黑暗处放置72 h,
加入乙醚, 6 000 r·min-1离心分离沉淀。乙醚反复
洗涤沉淀, 即得到乙酰化的木质素。乙酰化木质
素样品溶于0.5 mL CdCl3中, 以TMS为内标, 用
Bruher DMX300NB型超导核磁共振波谱仪, 在500
mHz条件下测定。根据木质素1H-NMR的谱图, 对
不同授粉品种梨木质素的GS单体相对应的特征峰
进行范围区分和积分, 以内标作为对照, 即可得到
GS单体的相对含量(Yan等2014; Jin等2013)。
实验结果
1 砀山酥梨PbF5H全长cDNA克隆及生物信息学
分析
利用引物PbF5H-F和PbF5H-R扩增得到1条
600 bp左右的条带(图1-A)。采用3′ RACE的方法
经两轮扩增得到1条约1 000 bp的条带(图1-B); 采
用5′ RACE的方法扩增PbF5H的5′端, 得到一条约
600 bp的DNA片段(图1-C), 利用引物cdsF和cdsR扩
增获得1条约1 500 bp的条带(图1-D)。
拼接获得PbF5H的全长为1 978bp, 最大开放
阅读框为1 548 bp, 共编码516个氨基酸, 在Gen-
Bank的登录号为KC852907 (图2), 图中边框部分代
表亚铁血红素结合结构域。
用在线网站(http://isoelectric.ovh.org/)预测
PbF5H蛋白的理论分子量约为58.4 kDa, 理论等电
点为6.49。利用PredictProtein在线分析工具(http://
www.predictprotein.org/)预测PbF5H蛋白二级结构,
发现α螺旋占48.84%, β折叠5.62%, 无规则卷曲占
45.54%。
用TMHMM2.0 Server v.2对PbF5H蛋白的跨
膜结构域进行预测。软件预测结果显示, 整条肽
链有一个跨膜结构域 , 多肽链1~12位于膜内 ,
13~31横跨质膜, 32~516位于膜外, 推测该基因可
能在质膜上发挥功能, 这与拟南芥和杨树的F5H蛋
徐超等: 砀山酥梨果实F5H表达与石细胞发育的分析 781
白预测是一致的(李嘉和孟庆熊2006)。
利用NCBI BLAST检索PbF5H与其他植物的
氨基酸同源性, 并用DNAman软件绘制系统进化树
(图3)。多重比对发现发现蔷薇科植物砀山酥梨、
苹果、梅和草莓明显聚为一类, 其中砀山酥梨氨
基酸序列与苹果的同源性最高, 相似性达到96%,
与其他植物的序列相似性也都高于75%, 说明
PbF5H蛋白在不同物种中是较为保守的。
2 不同品种授粉对砀山酥梨果肉中PbF5H表达量
的影响
为了进一步探讨PbF5H的功能, 测定了砂梨
系圆黄, 白梨系鸭梨为父本对砀山酥梨异花授粉
后, PbF5H在梨果实中表达量。
由图4可知, 圆黄(♂)×砀山酥梨(♀)的梨果实
PbF5H表达量显著高于鸭梨(♂)×砀山酥梨(♀)的梨
果实, 但梨果实不同发育阶段PbF5H的表达量变化
趋势基本一致 , 呈现表达量先上升后下降的趋
势。圆黄(♂)×砀山酥梨(♀)和鸭梨(♂)×砀山酥梨
(♀)的梨果实PbF5H表达量都于花后47 d达到高峰,
花后145 d (成熟期)基本检测不到PbF5H的表达量,
这可能是由于在果实成熟之前, 石细胞团已成型,
在果实成熟过程中, 主要进行营养成分如碳水化
合物等的积累, 石细胞团可能不再继续发育, 相对
果实干物质总量, 木质素相对含量下降(聂敬全等
2009)。
3 不同品种授粉对砀山酥梨果实石细胞和木质素
含量的影响
为了进一步探讨PbF5H表达量与石细胞含量
和木质素含量的关系, 测定了砂梨系圆黄, 白梨系
鸭梨为父本对砀山酥梨异花授粉后, 梨果实中石
细胞含量和木质素含量, 并进行相关性分析。
由图5可知, 异花授粉的砀山酥梨在不同发育
时期的变化趋势基本一致, 都呈现先上升再下降
趋势, 石细胞和木质素含量都在花后63 d时达到高
峰。79 d以后, 石细胞发育基本停止, 果实持续膨
大发育, 导致石细胞与木质素的相对含量下降(聂
敬全等2009)。相关性分析表明, 圆黄(♂)×砀山酥
梨(♀)的木质素与石细胞含量相关系数r=0.70, 鸭
梨(♂)×砀山酥梨(♀)的相关系数r=0.78。PbF5H相
对表达量与木质素含量的相关系数r分别为–0.12
(圆黄♂×砀山酥梨♀)和0.14 (鸭梨♂×砀山酥梨♀)。
但是, PbF5H相对表达量与木质素含量进行错位比
较(即把PbF5H相对表达量的趋势图向后平移一个
时期), 则相关系数r分别为0.88 (圆黄♂×砀山酥梨
♀)和0.61 (鸭梨♂×砀山酥梨♀)。这说明异花授粉
砀山酥梨果实不同发育时期的木质素含量与石细
胞含量和PbF5H的相对表达量高度正相关, 且木质
素含量的变化趋势滞后于PbF5H的相对表达量变
化趋势。
4 不同品种授粉对砀山酥梨果实木质素单体含量
的影响
为了进一步探讨PbF5H表达量与S木质素单
体关系, 测定了砂梨系圆黄、白梨系鸭梨为父本
对砀山酥梨异花授粉后, 幼果(47 d)和成熟梨果实
(145 d)中木质素单体含量, 并进行分析。
表2可知, 不同授粉品种, 砀山酥梨果实木质
图1 PbF5H克隆的PCR电泳图
Fig.1 The electrophoresis results of PbF5H fragments
A: PbF5H特异性片段扩增; B: 3′ RACE扩增; C: 5′ RACE扩增; D: CDS扩增。
植物生理学报782
素G/S单体比值发生改变, 而幼果和成熟期的圆黄
(♂)×砀山酥梨(♀)果实的S木质素单体含量均高于
鸭梨(♂)×砀山酥梨(♀), 这可能是由于PbF5H在圆
黄(♂)×砀山酥梨(♀)中表达量高导致的。而G木质
素单体含量和G/S比值与PbF5H的相对表达量没
有明显对应关系, 这表明PbF5H可能是特异性地参
与S木质素单体的合成。
图2 PbF5H核苷酸序列及其推导的氨基酸序列
Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequence of PbF5H gene
图3 PbF5H蛋白与其他植物F5H的氨基酸序列关系分析
Fig.3 Phylogenetic relationship of amimo acid sequences
between PbF5H and other F5H proteins
图4 不同品种授粉的砀山酥梨果实PbF5H表达量
Fig.4 Relative expression of PbF5H in different cultivars
pollinated Pyrus bretschneideri cv. Dangshan Su
徐超等: 砀山酥梨果实F5H表达与石细胞发育的分析 783
图5 不同品种授粉的砀山酥梨果实石细胞和木质素含量
Fig.5 Content of strone cells and lignins in different pollina-
tion varieties of Pyrus bretschneideri cv. Dangshan Su
表2 不同品种授粉的砀山酥梨果实木质素单体含量
Table 2 Gontent of lignins in different pollination varieties of
Pyrus bretschneideri cv. Dangshan Su

授粉品种
S木质素相 G木质素相
G/S 对含量 对含量
圆黄(♂)×砀山酥梨(♀) (47 d) 4.67 5.12 1.10
鸭梨(♂)×砀山酥梨(♀) (47 d) 3.20 0.97 0.30
圆黄(♂)×砀山酥梨(♀) (145 d) 4.52 2.26 0.50
鸭梨(♂)×砀山酥梨(♀) (145 d) 2.49 3.17 1.27

讨　　论
梨是典型自交不亲和的植物, 花粉直感现象明
显(陈昭存等2000), 异花授粉导致砀山酥梨PbF5H
表达量、梨石细胞含量、木质素含量及木质素GS
单体含量都发生改变。但在果实不同发育时期,
异花授粉导致的变化趋势是一致的, 都呈现先上
升后下降趋势。
相关性分析表明, 异花授粉的砀山酥梨木质
素含量与PbF5H相对表达量和石细胞含量高度正
相关, 且木质素含量的变化趋势滞后于PbF5H的相
对表达量变化趋势。这表明, 砀山酥梨果实的细
胞木质化是影响石细胞形成的关键因素(李玲等
2004), 而PbF5H作为调控S木质素合成的关键基
因, 主要参与调控S木质素单体, 影响G/S比值, 其
表达量与木质素总量的关系仍需进一步研究。
总之, 木质素合成是一个复杂的代谢网络, 涉
及到多个基因的调控(Vanholme等2010)。此外, 已
知的木本植物如毛果杨、蓝桉(García等2014)等也
存在F5H家族基因。而砀山酥梨作为木本植物, 是
否存在其他F5H则需要进一步的研究。本研究中,
PbF5H的生物信息学分析及相关性分析表明, 该基
因可能参与S木质素生物合成。PbF5H是调控砀
山酥梨果实S木质素的合成的关键基因之一, 影响
木质素单体G/S比值, 进而可能影响石细胞团的聚
合度。今后可尝试构建PbF5H的真核表达载体, 进
行遗传转化, 培育石细胞团聚合度低、口感优良
的梨品种。
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