全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (2): 199~204 199
收稿 2010-10-18 修定 　2010-11-24
资助 国家自然科学专项基金项目(3 09 42 00 47 )。
* 通讯作者(E-mail: jtian@scau.edu.cn; Tel: 020-85280156)。
建立和优化双向电泳分析柱花草根系蛋白谱的方法
陈志坚 1, 严炜 1,2, 孙丽莉 1,2, 刘国道 2, 廖红 1, 田江 1,*
1 华南农业大学根系生物学研究中心, 广州 510642; 2 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所, 海南儋州 571737
摘要: 本研究以柱花草根系为材料, 比较了不同蛋白质提取方法和蛋白上样量等因素对双向电泳方法分析根系蛋白图谱的
影响。结果表明, 在苯酚法提取蛋白中, 加入 0.7 mol·L-1 NaCl和 20%乙醇, 并在蛋白沉淀过程中加入 1/10倍体积 5 mol·L-1
NaCl, 能够有效去除组织样品中的非蛋白成分, 结合使用pH 4~7范围的IPG胶条, 1 mg根系蛋白可以在双向电泳图谱上分
辨出较多蛋白点, 图谱背景清晰, 该体系适合柱花草根系蛋白质的双向电泳分析。
关键词: 双向电泳; 蛋白提取; 柱花草
Establishment and Optimization of Two Dimensional Electrophoresis System
for Analyzing Protein Profiles in Stylo Roots
CHEN Zhi-Jian1, YAN Wei1,2, SUN Li-Li1,2, LIU Guo-Dao2, LIAO Hong1, TIAN Jiang1,*
1Root Biology Center, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2Institute of Tropical Crops Genetic
Resource, Chinese Academy of Tropical Agriculture Science, Danzhou, Hainan 571737, China
Abstract: In the study, effects of different methods of protein extraction and loading on analyzing protein
profiles of stylo roots were investigated using the two-dimensional electrophoresis (2-DE). The results showed
that 2-DE could be optimized by using the modified phenol extraction buffer containing 0.7 mol·L-1 NaCl and
20% ethanol, the precipitation buffer containing 1/10 volume 5 mol·L-1 NaCl. Totally, 500 protein spots could be
well resolved and detected in the gels when 1 mg protein of roots was separated using pH 4–7 IPG strip. All the
results suggested that the method was suitable for the study of 2-DE of stylo roots.
Key words: 2-DE; protein extraction; stylo
双向电泳(two-dimensional electrophoresis, 2-
DE)是蛋白质组学研究的核心技术, 已广泛应用于
研究蛋白表达模式、蛋白互作、亚细胞定位、蛋
白修饰等蛋白功能与调控方面(Patterson和Aebersold
2003)。植物组织中含有诸多非蛋白成分, 如多
糖、酚类物质、色素、脂类、单宁以及其他次
级代谢物等, 这些成分会干扰双向电泳图谱中蛋白
的分离, 导致双向电泳得不到满意的结果(Shaw和
Riederer 2003; Hille 等 2001)。蛋白质提取过程中
植物组织样品中的非蛋白成分的去除是双向电泳技
术的关键步骤, 是影响双向电泳质量与后续研究工
作的重要因素。非蛋白成分的种类和数量因不同
植物种类、不同器官和不同生长发育阶段而异, 蛋
白提取方法必须针对提取材料的特性进行优化
(Gorg 等 2004; Shaw 和 Riederer 2003)。近年来,
已报道许多适用于不同植物样品的蛋白提取方法,
如 Tris-HCl提取法、苯酚提取法和TCA丙酮提取
法等, 已被广泛应用于水稻(Yin 等 2007; Yan 等
2006; Salekdeh等 2002)、玉米(Li等 2007; Sauer等
2006)、大豆(Xu 等 2008)、大麦(Witzel 等 2007)
等蛋白组学研究中, 但是由于蛋白质丰度、分子
量、电荷、转录后修饰以及与其他分子相结合等,
没有适合于任何植物和组织蛋白提取的专一方法
(Chen 和 Harmon 2006)。
柱花草具有品质好、耐旱、耐酸性瘦土的特
点, 广泛用于水土保持、提高土壤肥力等(Liu 等
1997)。同时, 柱花草含有大量的粗蛋白、粗纤
维、粗脂肪、木质素、糖类和矿物盐等, 是优良
的热带豆科牧草, 具有良好的营养价值和饲用价值
技术与方法 Techniques and Method
植物生理学报200
(周汉林等 2006; 白昌军和刘国道 2002)。由于柱
花草含有大量的非蛋白成分, 迄今还未见对柱花草
根系蛋白有效提取方法及蛋白质双向电泳条件试验
的相关报道。本文以柱花草 ‘TPRC2001-1’根系为
材料, 比较了不同蛋白质提取方法对根系蛋白提取
效果的影响, 并对苯酚提取法进行改良, 同时在蛋
白质上样量等方面也作了进一步的优化, 探索适合
于柱花草根系蛋白的双向电泳技术, 从而为开展豆
科牧草蛋白质组学研究提供参考。
材料与方法
1 材料
供试柱花草(Stylosanthes guianensis L.)品种为
‘TPRC2001-1’。种子去种皮经10% NaClO消毒后,
播入石英砂中, 在25 ℃暗室催芽, 发芽后搬入温室
进行培养。培养温度为 28 ℃/25 ℃ (昼 / 夜), 湿度
75%, 光照强度 800 μmol·m-2·s-1。待第 1 片叶完全
展开时, 选取生长一致的幼苗, 移栽至 14 L 塑料盆
中进行营养液栽培。营养液为 1/2 Hoagland 溶液
(Liao 等 2006), 每 7 d 更换 1 次营养液, 每 2 d 用
KOH 或H2SO4 调节 pH值至 5.8。待生长一个月后
收获柱花草根系, -80 ℃超低温冰箱保存备用。
2 根系蛋白质的提取
2.1 Tris-HCl提取法
参考 Rabilloud (1998)的方法并略作改进。取
3 g根系组织样品, 用 12 mL提取液(0.5 mol·L-1 Tris-
HCl pH 8.3, 2% NP-40, 20 mmol·L-1 MgCl2, 2% β-巯基
乙醇, 1 mmol·L-1 PMSF, 1% PVPP)研磨, 在 4 ℃下
10 000×g离心15 min, 取上清, 加入4倍体积含10%
TCA的丙酮溶液, 混匀, -20 ℃静置 1 h 后, 在 4 ℃
下 10 000×g 离心 1 h, 弃上清, 用预冷的丙酮溶液
重悬, -20℃静置 1 h后, 在 4 ℃下 10 000×g离心1 h,
收集沉淀, 真空干燥, -80℃超低温冰箱保存备用。
2.2 苯酚提取法
参照 Hurkman和Tanaka (1986)方法并略作改
进。3 g 根系组织样品, 加入 8.0 mL 提取缓冲液
(50% 苯酚, 0.45 mol·L-1 蔗糖, 25 mmol·L-1 EDTA, 2%
β-巯基乙醇, 250 mmol·L-1 Tris-HCl pH 8.8, 2 mmol·L-1
PMSF, 2% PVPP)研磨, 混匀, 在 4 ℃下 5 000×g 离
心 10 min, 吸取上层苯酚溶液, 加入 5 倍体积预冷
的甲醇(含 0.1 mol·L-1 醋酸铵和 1% β- 巯基乙醇),
混匀, -20 ℃静置 2 h后, 在 4 ℃下 10 000×g离心
10 min, 弃上清, 沉淀用预冷的甲醇(含 0.1 mol·L-1
醋酸铵)冲洗 2次, 然后用 80% 丙酮洗 2次, 最后用
70% 酒精洗 1 次, 收集沉淀, 真空干燥, -80 ℃超低
温冰箱保存备用。
2.3 改良苯酚提取法
参照 Hurkman 和 Tanaka (1986)方法并作改
进。3 g根系组织样品, 加入 8.0 mL提取缓冲液(50%
苯酚, 0.45 mol·L-1蔗糖, 25 mmol·L-1 EDTA, 2% β-巯
基乙醇, 250 mmol·L-1 Tris-HCl pH 8.8, 2 mmol·L-1
PMSF, 2% PVPP, 0.3~1.4 mol·L-1 NaCl, 10%~40%
乙醇)研磨, 混匀, 在 4 ℃下 10 000×g 离心 15 min,
吸取上层苯酚溶液, 加入1/10倍体积5 mol·L-1 NaCl,
加入 5 倍体积预冷的甲醇(含 0.1 mol·L-1 醋酸铵和
1% β-巯基乙醇), 混匀, -20 ℃静置2 h后, 在4 ℃下
10 000×g 离心 15 min, 弃上清, 沉淀用预冷的甲醇
(含 0.1 mol·L-1 醋酸铵)冲洗 2 次, 然后用 80% 丙酮
洗 2次, 最后用 70%酒精洗 1次, 收集沉淀, 真空干
燥, -80℃超低温冰箱保存备用。
3 蛋白质样品溶解及浓度测定
蛋白质样品加入600 mL裂解液(7 mol·L-1尿素,
2 mol·L-1 硫脲, 4% CHAPS, 80 mmol·L-1 DTT, 1%
IPG 缓冲液)充分混合, 涡旋振荡 15 min, 在 4 ℃下
10 000×g 离心 15 min, 上清即为蛋白质样品液。采
用蛋白定量试剂盒(2-D Quant-Kit, GE-Healthcare)对
蛋白质样品进行浓度测定, 制备牛血清蛋白(BSA)标
准曲线, 测定样品吸光度值, 计算样品蛋白质浓度。
4 双向电泳
向胶条槽中加入430 μL蛋白样品液, 放入IPG
胶条(24 cm)后滴加覆盖油, 盖上胶条槽盖子, 置于
IPGphor 上(GE-Healthcare), 等电聚焦(IEF)程序为
25 ℃, 50 μA· 胶 -1, 电压和时间参数为: 30 V (快速
12 h)→ 50 V (快速 2 h)→ 100 V (线性 2 h)→ 200 V
(线性2 h)→500 V (线性2 h)→1000 V (线性2 h)→
8 000 V (线性 4 h)→ 8 000 V (快速 90 000 V·h)→
500 V (快速 10 h)。
将聚焦完成的 IPG 胶条进行平衡。胶条平衡
陈志坚等: 建立和优化双向电泳分析柱花草根系蛋白谱的方法 201
分两步进行: 第一步用含有 1% DTT 的平衡液[平
衡液: 50 mmol·L-1 Tris-HCl (pH 8.8), 6 mol·L-1尿素,
30% (V/V)甘油, 2% (W/V) SDS, 微量溴酚蓝]平衡
15 min; 第二步用含有2.5%碘乙酰胺的平衡液平衡
15 min。
平衡好的 IPG 胶条移至凝胶上端, 放入 Ettan
DALTsix 电泳仪(GE-Healthcare)进行电泳, 10 mA·
胶 -1 电泳 1 h 后, 40 mA· 胶 -1 电泳至结束。
5 凝胶染色和扫描
电泳结束后, 去离子水冲洗凝胶, 用固定液
[40% (V/V)无水乙醇, 10% (V/V)冰乙酸]固定 1 h以
上后, 用考马斯亮蓝 G-250 染色液[0.08% (W/V)考
马斯亮蓝 G-250, 25% (V/V)甲醇, 1% (V/V)磷酸]染
色过夜, 然后用去离子水冲洗数次, 直到凝胶背景
清晰为止, 用 EPSON 1640XL 型扫描仪进行扫描。
实验结果
1 不同提取方法对蛋白含量及2-DE图谱蛋白点数
目的影响
从表1可以看出, 不同提取方法得到的蛋白含
量差异不明显, 约为 1 mg 蛋白每克鲜重, 但在 2-
DE图谱中所显示出来的蛋白点数目各不一样。采
用 PD-Quest 7.0 (Bio-Rad)软件进行点检测及统计
分析, 在相同的参数设置条件下, 改良的苯酚提取
法在胶面上蛋白点数目最多, 可分辨出500个蛋白
点, 分别是Tris-HCl提取法和苯酚提取法 16.7和 7.1
倍, 差异显著。
2 Tris-HCl及苯酚提取法对2-DE图谱效果的影响
从图 1 可以看出, 用 Tris-HCl 提取法提取蛋白
质所得的 2-DE 图谱(图 1-A、B)蛋白点模糊, 分辨
率低, 横竖条纹干扰严重, 凝胶背景较深; 用苯酚提
取法提取蛋白质所得的 2-DE图谱(图 1-C、D)蛋白
点较Tris-HCl提取法所得多, 分离效果较好, 分辨率
有所提高, 蛋白点主要集中在等电点4~7范围内(图
1-D), 但蛋白点数目偏少, 不利于后续研究分析。
表 1 不同蛋白提取方法的蛋白含量及蛋白点数目
Table 1 Protein yield and total number of spots using
different protein extraction methods
方法 蛋白含量 /mg.g-1 (FW) 蛋白点数目 / 个
Tris-HCl 提取法 1.02±0.08a 3 0
苯酚提取法 0.99±0.04a 7 0
改良苯酚提取法 1.00±0.03a 500
　　表中同列不同小写字母表示差异显著(P<0 .05 )。
图 1 Tris-HCl和苯酚提取法的柱花草根系 2-DE 图谱比较
Fig.1 Comparison of 2-DE protein patterns in roots of stylo using Tris-HCl and phenol extraction methods
A: Tris-HCl 提取法(胶条 pH 3~10); B: Tris-HCl 提取法(胶条 pH 4~7); C: 苯酚提取法(胶条 pH 3~10); D: 苯酚提取法(胶条 pH
4~7); 蛋白质上样量均为 800 μg。
植物生理学报202
3 改良苯酚提取法对2-DE图谱效果的影响
本研究在苯酚提取法基础上作进一步改良, 比
较了在提取液中分别加入不同浓度的NaCl和乙醇,
并在蛋白沉淀过程中加入 1/10 倍体积 5 mol·L-1
NaCl对2-DE图谱的影响。结果表明, 低浓度NaCl
(0.3 mol·L-1)和乙醇(10%)不能很好地去除样品中的
非蛋白成分, 蛋白点模糊, 仍有横竖条纹干扰(图2-
A); 高浓度NaCl (1.4 mol·L-1)和乙醇(40%)会增加样
品中盐离子浓度, 而盐离子浓度过高会直接影响等
电聚焦时电压的上升, 从而影响聚焦效果, 导致 2-
DE图谱蛋白点分辨率低, 横条纹干扰严重(图2-C);
在提取液中加入 0.7 mol·L-1 NaCl和 20% 乙醇提取
蛋白质样品所得的2-DE图谱质量最好(图2-B), 蛋
白点分布均匀清晰, 在高中低分子量范围内均可检
测到较多的蛋白点, 凝胶背景干净, 相比Tris-HCl和
苯酚提取法所得图谱效果(图1)有明显改善, 表明该
图 2 改良苯酚提取法的 2-DE 图谱比较
Fig.2 Comparison of 2-DE protein patterns using modified phenol extraction methods
A: 0.3 mol·L-1 NaCl, 10% 乙醇; B: 0.7 mol·L-1 NaCl, 20% 乙醇; C: 1.4 mol·L-1 NaCl, 40% 乙醇; 蛋白质上样量均为 800 μg。
图 3 不同蛋白质上样量的 2-DE 图谱比较
Fig.3 Comparison of 2-DE protein patterns using different protein loading quantity
A: 蛋白质上样量为 800 μg; B: 蛋白质上样量为 1 000 μg; C: 蛋白质上样量为 1 200 μg。
方法适合柱花草根系蛋白提取。
4 蛋白质上样量对2-DE图谱效果的影响
从图 3 可以看出, 当蛋白质上样量为 800 μg
时, 图谱蛋白点数量较少, 不利于检出低丰度的蛋
白点(图 3-A); 当上样量为 1 200 μg, 蛋白点增多,
但高丰度蛋白点过大, 掩盖了其余蛋白点, 且图谱
上横竖条纹比较明显(图3-C); 当上样量为1 000 μg
时, 蛋白点呈清晰的圆形且分离均匀, 低丰度蛋白
数量也明显增加, 无横竖条纹干扰, 图谱质量最佳
(图 3-B)。
讨　　论
植物根系组织中含有大量非蛋白成分(Xie 等
2007; Tsugita和Kamo 1999), 这些成分在蛋白质提
取过程中难以去除, 并能够和蛋白质一起被提取出
陈志坚等: 建立和优化双向电泳分析柱花草根系蛋白谱的方法 203
来, 对蛋白点迁移和分离有重要的影响(Shaw 和
Riederer 2003; Hille 等 2001)。
蛋白质样品制备是双向电泳中关键的环节, 不
同样品要选择最合适的制备方法。本研究用 Tris-
HCl提取法所得的2-DE图谱不理想(图1-A、B), 这
可能由于该方法在提取过程中不能有效去除根系组
织中的非蛋白成分, 使蛋白等电聚焦(IEF)不充分。
这与Xie等(2007)结果相似, 认为Tris-HCl提取法不
适合含有大量非蛋白成分的多年生柴胡根系蛋白的
提取。因此, 该蛋白提取法不适合柱花草根系蛋白
的提取。
苯酚提取法能够有效去除组织样品中含有的
干扰成分(Nagai 等 2008; Bona 等 2007; Carpentier
等 2005)。在本研究中, 相对 Tris-HCl 提取法, 苯
酚提取法所得的 2-DE 图谱效果较好(图 1-C、D),
蛋白点主要集中在等电点4~7范围内, 但蛋白点数
目偏少, 这可能由于柱花草根系中含有大量的干扰
物质, 这些干扰物质在提取过程中不能完全被去除,
影响蛋白点的迁移和分离。
在核酸研究中, 植物DNA和RNA提取也受多
糖、酚类、单宁等次级代谢物的影响, 目前, 已
建立起许多有效去除这些物质的DNA和RNA提取
方法。已有研究报道表明, 加入终浓度 0.7~5 mol·L-1
NaCl 和 10%~30% 乙醇能够有效去除这些干扰物
质, 从而获得高质量的DNA或RNA (Cheng等2003;
Lewinsohn 等 1994; Chang 等 1993; Fang 等 1992;
Tesniere 和 Vayda 1991)。在上述研究基础上, 本
研究对苯酚提取法作进一步改良, 比较了在蛋白提
取液中加入不同浓度NaCl和乙醇, 并在蛋白沉淀过
程中加入1/10倍体积5 mol·L-1 NaCl对蛋白图谱的
影响。结果表明, 在提取液中加入终浓度为 0.7
mol·L-1 NaCl和20%乙醇提取蛋白质样品所得2-DE
图谱效果最佳(图2-B)。NaCl和乙醇能够充分去除
柱花草根系组织中的非蛋白成分, 可能是由于NaCl
和乙醇在初始提取时就能使多糖和酚类等物质沉
淀, 减少这些物质对后续步骤的污染。
植物体内大部分蛋白质的表达丰度很低, 提高
样品上样量会有利于低丰度蛋白的检出, 但上样量
过高又会引起高丰度蛋白点掩盖低丰度蛋白点
(Giavalisco等 2003)。本研究表明当蛋白上样量为
1 mg 时, 2-DE 图谱质量最佳(图 3-B)。
总之, 运用改良的苯酚提取法, 结合使用 pH
4~7 IPG 胶条以及蛋白上样量为 1 mg 的体系适用
于柱花草根系蛋白双向电泳研究, 同时, 该体系也
可能适用于富含干扰成分的非模式植物组织蛋白的
提取。
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