全 文 ：七种菊科植物 ＳＳＲ标记在大黄橐吾和奇形橐吾
杂交区类群中的通用性检测∗
张　 荣１ꎬ２ꎬ 冯秀彦１ꎬ２ꎬ 龚　 洵１∗∗
(１ 中国科学院昆明植物研究所资源植物与生物技术重点实验室ꎬ 昆明　 ６５０２０１ꎻ ２ 中国科学院大学ꎬ 北京　 １０００４９)
摘要: 牦牛山橐吾 (Ｌｉｇｕｌａｒｉａ × ｍａｏｎｉｕｓｈａｎｅｎｓｉｓ) 是大黄橐吾 (Ｌ􀆰 ｄｕｃｉｆｏｒｍｉｓ) 和奇形橐吾 (Ｌ􀆰 ｐａｒａｄｏｘａ) 的一
个自然杂交种ꎮ 为了研究大黄橐吾和奇形橐吾杂交区类群的杂交关系和遗传结构ꎬ 本研究利用两个杂交区
杂交种及亲本的 ９４个个体ꎬ 从来自橐吾属、 大吴风草属、 千里光属和向日葵属 ７ 个种中已开发的 １４５ 对
核 ＳＳＲ引物进行筛选ꎮ 结果表明在所研究的三个类群中至少能在其中一个类群中成功扩增的位点有 ５４个ꎬ
都能扩增的位点 １７个ꎮ 在这 １７个位点中ꎬ 牦牛山橐吾中 １１个位点具多态性ꎬ 每个位点有 ２~１４个等位基
因ꎬ 平均为 ４􀆰 ８个ꎬ 观测杂合度和期望杂合度分别为 ０􀆰 ０５３~１􀆰 ０００和 ０􀆰 ０５１~０􀆰 ８８７ꎻ 大黄橐吾中 ９个位点
有多态性ꎬ 每个位点有 ３~１２个等位基因ꎬ 平均为 ７􀆰 ４个ꎬ 观测杂合度和期望杂合度分别为 ０􀆰 ２００~ ０􀆰 ９７１
和 ０􀆰 ２８３~０􀆰 ８４４ꎻ 奇形橐吾中 １０个位点有多态性ꎬ 每个位点具 ４~１５个等位基因ꎬ 平均为 ７􀆰 ６个ꎬ 观测杂
合度的值为 ０􀆰 ０２５~０􀆰 ９７４ꎬ 期望杂合度的值为 ０􀆰 ０９７~０􀆰 ８４６ꎮ 以上结果对大黄橐吾和奇形橐吾杂交区类群
的杂交程度和遗传结构的进一步研究有重要作用ꎮ
关键词: 牦牛山橐吾ꎻ 大黄橐吾ꎻ 奇形橐吾ꎻ ＳＳＲꎻ 多态性ꎻ 通用性
中图分类号: Ｑ ７５　 　 　 　 　 　 　 文献标志码: Ａ　 　 　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５－０８４５(２０１５)０４－４１６－０７
Ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＳＳＲ Ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｓｅｖｅｎ Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ
Ｓｐｅｃｉｅｓ ｔｏ Ｔａｘａ ｉｎ ｔｈｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｈｙｂｒｉｄ Ｚｏｎｅ ｂｅｔｗｅｅｎ
Ｌｉｇｕｌａｒｉａ ｄｕｃｉｆｏｒｍｉｓ ａｎｄ Ｌ􀆰 ｐａｒａｄｏｘａ∗
ＺＨＡＮＧ Ｒｏｎｇ１ꎬ２ꎬ ＦＥＮＧ Ｘｉｕ￣ｙａｎ１ꎬ２ꎬ ＧＯＮＧ Ｘｕｎ１∗∗
(１ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｐｌａｎｔｓ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｋｕｎｍｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ
Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２０１ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００４９ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｌｉｇｕｌａｒｉａ × ｍａｏｎｉｕｓｈａｎｅｎｓｉｓ (Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ) ｉｓ ａ ｎａｔｕｒａｌ ｈｙｂｒｉｄ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ Ｌ􀆰 ｄｕｃｉｆｏｒｍｉｓ ａｎｄ Ｌ􀆰 ｐａｒａｄｏｘａ. Ｉｎ
ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔａｘａ ｉｎ ｔｈｅ ｈｙｂｒｉｄ ｚｏｎｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｌ􀆰 ｄｕｃｉｆｏｒｍｉｓ ａｎｄ Ｌ􀆰 ｐａｒａｄｏｘａꎬ
ｃｒｏｓｓ￣ｓｐｅｃｉｅｓ ＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｕｓｉｎｇ ９４ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｏｆ ｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄ ｚｏｎｅｓ’ ｈｙｂｒｉｄｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｐａｒｅｎｔｓ ｆｒｏｍ １４５
ｎｕｃｌｅａｒ ＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｈｉｃｈ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｒｏｍ Ｌｉｇｕｌａｒｉａꎬ Ｆａｒｆｕｇｉｕｍꎬ Ｓｅｎｅｃｉｏ ａｎｄ Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ￣
ｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ５４ ｌｏｃｉ ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ ｔａｘｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｔａｘａ. Ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ １７ ｌｏｃｉ ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ
ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ａｔ ｔｈｒｅｅ ｔａｘａꎬ ｏｆ ｗｈｉｃｈ １１ ｗｅｒｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｉｎ Ｌ. × ｍａｏｎｉｕｓｈａｎｅｎｓｉｓꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ａｌｌｅｌｅｓ (ＮＡ )
ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ２ ｔｏ １４ ( ａｖｅｒａｇｅ ４􀆰 ８) ａｎｄ ｔｈｅ ｒａｎｇｅｓ ｏｆ ｏｂｓｅｒｖｅｄ (ＨＯ ) ａｎｄ ｅｘｐｅｃｔｅｄ (ＨＥ ) ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｉｅｓ ｗｅｒｅ
０􀆰 ０５３~１􀆰 ０００ ａｎｄ ０􀆰 ０５１~ ０􀆰 ８８７ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｏｆ ｗｈｉｃｈ ９ ｗｅｒｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｉｎ Ｌ􀆰 ｄｕｃｉｆｏｒｍｉｓꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ
ａｌｌｅｌｅｓ (ＮＡ) ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ３ ｔｏ １２ (ａｖｅｒａｇｅ ７􀆰 ４) ａｎｄ ｔｈｅ ｒａｎｇｅｓ ｏｆ ｏｂｓｅｒｖｅｄ (ＨＯ) ａｎｄ ｅｘｐｅｃｔｅｄ (ＨＥ) ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉ￣
ｔｉｅｓ ｗｅｒｅ ０􀆰 ２００~０􀆰 ９７１ ａｎｄ ０􀆰 ２８３~０􀆰 ８４４ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｏｆ ｗｈｉｃｈ １０ ｗｅｒｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｉｎ Ｌ􀆰 ｐａｒａｄｏｘａꎬ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ
植 物 分 类 与 资 源 学 报　 ２０１５ꎬ ３７ (４): ４１６~４２２
Ｐｌａｎｔ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ＤＯＩ: １０.７６７７ / ｙｎｚｗｙｊ２０１５１４１４４
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∗∗
基金项目: 国家自然科学基金 (３１４７０３３６)
通讯作者: Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｇｏｎｇｘｕｎ＠ｍａｉｌ􀆰 ｋｉｂ􀆰 ａｃ􀆰 ｃｎ
收稿日期: ２０１４－１１－０４ꎬ ２０１４－１２－２３接受发表
作者简介: 张荣 (１９８８－) 男ꎬ 硕士研究生ꎬ 主要从事群体遗传学研究ꎮ
ｏｆ ａｌｌｅｌｅｓ (ＮＡ) ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ４ ｔｏ １５ (ａｖｅｒａｇｅ ７. ６) ａｎｄ ｔｈｅ ｒａｎｇｅｓ ｏｆ ｏｂｓｅｒｖｅｄ (ＨＯ) ａｎｄ ｅｘｐｅｃｔｅｄ (ＨＥ) ｈｅｔｅｒｏｚｙ￣
ｇｏｓｉｔｉｅｓ ｗｅｒｅ ０􀆰 ０２５~０􀆰 ９７４ ａｎｄ ０􀆰 ０９７~０􀆰 ８４６ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｉｌｌ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｔｈｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄ ｅｘｔｅｎｔ ａｂｏｕｔ ｔａｘａ ｉｎ ｈｙｂｒｉｄ ｚｏｎｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｌ􀆰 ｄｕｃｉｆｏｒｍｉｓ ａｎｄ Ｌ􀆰 ｐａｒａｄｏｘａ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｌ. × ｍａｏｎｉｕｓｈａｎｅｎｓｉｓꎻ Ｌ􀆰 ｄｕｃｉｆｏｒｍｉｓꎻ Ｌ􀆰 ｐａｒａｄｏｘａꎻ ＳＳＲꎻ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍꎻ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙ
　 橐吾属 (Ｌｉｇｕｌａｒｉａ Ｃａｓｓ.) 是菊科 (Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ)
千里光族 (Ｔｒｉｂｅ Ｓｅｎｅｃｉｏｅａｅ) 款冬亚族 (Ｔｕｓｓｉｌａｇ￣
ｉｎｉｎａｅ) 的一个大属ꎬ 约有 １４０ 种ꎬ 其中我国有
１２３种 (刘尚武ꎬ １９８９ꎻ 刘尚武等ꎬ １９９４ꎻ Ｌｉｕ 和
Ｉｌｌａｒｉｏｎｏｖａꎬ ２０１１)ꎮ 该属具有较高的物种多样性ꎬ
种间二倍体杂交被认为是一个重要原因 (Ｌｉｕ等ꎬ
２００１ꎻ Ｌｉｕ等ꎬ ２００６)ꎮ 自然杂交在一些橐吾属同
域分布的地区普遍存在 (Ｌｉｕ 等ꎬ ２００６ꎻ Ｙｕ 等ꎬ
２０１１)ꎬ 并形成杂交区 (Ｈｙｂｒｉｄ ｚｏｎｅ)ꎮ 近年来ꎬ
橐吾属内的杂交事件时有报道ꎬ Ｐａｎ 等 (２００８)
从形态学和分子数据 ( ｃｐＤＮＡ 和 ＩＳＳＲ 标记) 证
实牦牛山橐吾 ( Ｌ. × ｍａｏｎｉｕｓｈａｎｅｎｓｉｓ Ｘ. Ｇｏｎｇ ＆
Ｙ􀆰 Ｚ. Ｐａｎ) 是大黄橐吾 (Ｌ􀆰 ｄｕｃｉｆｏｒｍｉｓ (Ｃ. Ｗｉｎｋｌ.)
Ｈａｎｄ.￣Ｍａｚｚ.) 和奇形橐吾 ( Ｌ􀆰 ｐａｒａｄｏｘａ Ｈａｎｄ.￣
Ｍａｚｚ.) 形成的一个杂交后代ꎮ 继而ꎬ Ｓａｉｔｏ 等
(２０１１) 和 Ｓｈｉｍｉｚｕ等 (２０１４) 通过分析化学成分和
核 ＩＴＳ片段分别对沼生橐吾 (Ｌ􀆰 ｌａｍａｒｕｍ (Ｄｉｅｌｓ)
Ｃ􀆰 Ｃ. Ｃｈａｎｇ) 和穗序橐吾 (Ｌ􀆰 ｓｕｂｓｐｉｃａｔａ (Ｂｕｒｅａｕ ＆
Ｆｒａｎｃｈ.) Ｈａｎｄ.￣Ｍａｚｚ.) 之间、 穗序橐吾和棉毛橐
吾 (Ｌ􀆰 ｖｅｌｌｅｒｅａ (Ｆｒａｎｃｈ.) Ｈａｎｄ.￣Ｍａｚｚ.) 之间的杂交
进行研究ꎻ Ｙｕ 等 (２０１１ꎬ ２０１４) 采用分子标记
ＩＳＳＲ结合 ｃｐＤＮＡ和 ＩＴＳ 片段等方法分别对莲叶
橐吾 ( Ｌ􀆰 ｎｅｌｕｍｂｉｆｏｌｉａ ( Ｂｕｒｅａｕ ＆ Ｆａｎｃｈ.) Ｈａｎｄ.￣
Ｍａｚｚ) 和穗序橐吾之间、 棉毛橐吾和穗序橐吾之
间的杂交进行了研究ꎮ 但运用 ＳＳＲ 的方法研究
橐吾属的自然杂交还未见报道ꎮ
ＳＳＲ (Ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ) 为共显性标记ꎬ
具丰度高、 可变位点多、 条带一致、 客观、 准确
的特点 (Ｋａｌｉａ等ꎬ ２０１１)ꎬ 可以用于揭示居群的遗
传结构、 检测居群内的遗传多样性 (邹喻苹等ꎬ
２００１)ꎮ 然而ꎬ 基于 ＰＣＲ和电泳检测的 ＳＳＲ标记
需要根据已知 ＳＳＲ 位点两侧的序列来设计 ＰＣＲ
引物ꎬ 这些序列一般通过构建 ＳＳＲ 基因文库、
筛选阳性克隆或直接测序筛选 ＳＳＲ 位点来获得
(Ｚａｎｅ等ꎬ ２００２ꎻ Ｋａｌｉａ等ꎬ ２０１１)ꎬ 开发新的 ＳＳＲ
引物难度大ꎬ 且费用较高 (叶林江等ꎬ ２０１４)ꎮ
近年来大量的基因组序列也为设计微卫星引物带
来便利 (何平ꎬ １９９８)ꎬ 但是大部分已测出的基
因组序列主要集中在栽培植物和有重要经济价值
的植物中ꎬ 野生植物的基因组序列还较为匮乏ꎬ
对大多数种类而言尚不足以用于设计微卫星引物
(Ｋａｌｉａ等ꎬ ２０１１)ꎮ 来自于共同祖先的物种ꎬ 在
基因上往往具有很高的同源性ꎮ 因此ꎬ 在一些微
卫星引物开发较多的类群中ꎬ 从近缘种已经开发
出来的微卫星标记中筛选目标物种所需的标记成
为了一种快捷手段 (Ｗｕ 和 Ｔａｎｋｓｌｅｙꎬ １９９３ꎻ Ｂａｒ￣
ｂａｒａ等ꎬ ２００７)ꎮ 例如ꎬ Ｈｅｅｓａｃｋｅｒ 等 (２００８) 利
用从向日葵 (Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ Ｌ.) 开发的 ＳＳＲ
引物用于同属 Ｈ􀆰 ａｒｇｏｐｈｙｌｌｕｓ Ｔｏｒｒ. ＆ Ａ. Ｇｒａｙꎬ 菊
芋 (Ｈ􀆰 ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ Ｌ.)ꎬ Ｈ􀆰 ａｎｏｍａｌｕｓ Ｓ􀆰 Ｆ. Ｂｌａｋｅꎬ Ｈ􀆰 ｐａ￣
ｒａｄｏｘｕｓ Ｈｅｉｓｅｒ 和 Ｈ􀆰 ｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａ Ｈｅｉｓｅｒ 的通用性检
测ꎬ Ｙａｔａｂｅ等 (２００７) 利用向日葵开发的 ＳＳＲ引
物研究向日葵和 Ｈ􀆰 ｐｅｔｉｏｌａｒｉｓ Ｎｕｔｔ. 的遗传多样
性ꎻ Ｌｉｕ等 (２００４) 和 Ｂｒｅｎｎａｎ等 (２０１２) 应用千
里光属 (Ｓｅｎｅｃｉｏ) Ｓ􀆰 ｓｑｕａｌｉｄｕｓ Ｌ. 开发的引物研究
同属 Ｓ􀆰 ａｅｔｈｎｅｎｓｉｓ Ｊａｎ ｅｘ ＤＣ. 和 Ｓ􀆰 ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉｆｏ￣
ｌｉｕｓ Ｐｏｉｒ. 同倍体杂交物种形成以及它们与杂交
种之间的分子遗传和质量性状分化ꎮ
在橐吾属不同的杂交区中ꎬ 居群的遗传多样
性及杂交区内部组成存在较大差异ꎮ 因此ꎬ 为了
进一步研究大黄橐吾和奇形橐吾杂交的程度ꎬ 本
研究从同属、 同亚族、 同族到不同族查找到已开
发 １４５对 ＳＳＲ 引物进行筛选ꎬ 对杂交区内三个
种进行 ＳＳＲ 引物多态性的初步检测ꎬ 以期得到
研究大黄橐吾和奇形橐吾自然杂交区类群的遗传
多样性及遗传结构的 ＳＳＲ引物ꎮ
１　 材料和方法
１􀆰 １　 实验材料
实验材料来源于大黄橐吾和奇形橐吾两个自然杂交
区内的 ９４个个体 (表 １)ꎬ 每株取 ４ ~ ５ 片幼嫩的叶片ꎬ
用变色硅胶干燥ꎬ 室温保存直到 ＤＮＡ 的提取ꎮ 各类群
的凭证标本保存于中国科学院昆明植物研究所标本馆
(ＫＵＮ)ꎬ 标本号分别为 Ｘ. Ｇｏｎｇ ２２３５５ ( Ｌ􀆰 ｄｕｃｉｆｏｒｍｉｓ)、
Ｘ. Ｇｏｎｇ ２２３５６ (Ｌ􀆰 ｐａｒａｄｏｘａ) 和 Ｘ. Ｇｏｎｇ ２２３５７ (Ｌ. × ｍａｏ￣
７１４４期　 　 　 　 　 　 张荣等: 七种菊科植物 ＳＳＲ标记在大黄橐吾和奇形橐吾杂交区类群中的通用性检测　 　 　 　 　 　
ｎｉｕｓｈａｎｅｎｓｉｓ)ꎮ ＰＣＲ过程中用于筛选的引物来自国内外
对鹿蹄橐吾 (Ｌ􀆰 ｈｏｄｇｓｏｎｉｉ Ｊ􀆰 Ｄ. Ｈｏｏｋ.) (Ｍａｏ等ꎬ ２００９)ꎬ 大
吴风草 (Ｆａｒｆｕｇｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ (Ｌ.) Ｋｉｔａｍ.) (Ｎｏｍｕｒａ 等ꎬ
２００９)ꎬ 千里光属 Ｓ􀆰 ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓ Ｐｏｉｒ. (Ｒｏｕｘ和Ｗｉｅｃ￣
ｚｏｒｅｋꎬ ２００７)、 Ｓ􀆰 ｍａｃｒｏｃａｒｐｕｓ Ｆ. Ｍｕｅｌｌ. ｅｘ Ｂｅｌｃｈｅｒ (Ａｈｒｅｎｓ
等ꎬ ２０１３)、 Ｓ􀆰 ｓｑｕａｌｉｄｕｓ 和欧洲千里光 ( Ｓ􀆰 ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌ.)
(Ｌｉｕ等ꎬ ２００４) ４个种ꎬ 及向日葵族 (Ｈｅｌｉａｎｔｈｅａｅ) 向日
葵属 (Ｈｅｅｓａｃｋｅｒ等ꎬ ２００８) 研究开发出的 １４５ 对核 ＳＳＲ
引物ꎬ 由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成ꎮ
１􀆰 ２　 实验方法
１􀆰 ２􀆰 １　 总 ＤＮＡ的提取
总 ＤＮＡ 的提取采用改良的 ＣＴＡＢ 法 ( Ｄｏｙｌｅ 等ꎬ
１９９１)ꎮ ＤＮＡ浓度采用电泳和分光光度计检测后加水稀
释ꎬ 使各样品间浓度基本保持一致ꎮ 所有 ＤＮＡ置－２０ ℃
冰箱保存备用ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ２　 ＳＳＲ引物筛选
１􀆰 ２􀆰 ２􀆰 １　 ＳＳＲ引物的初步筛选　 从 ２个杂交区的每个物
种的每个居群随机挑选 １个个体对 １４５ 对 ＳＳＲ 引物进行
初步筛选ꎬ 以文献中给定的退火温度为参考ꎬ 设立 ６ 个
温度梯度 (Ｔ＋２ꎬ Ｔ＋１ꎬ Ｔꎬ Ｔ￣１ꎬ Ｔ￣２ꎬ Ｔ￣３ꎬ Ｔ 代表文献
中相应引物的退火温度)ꎬ 对所有 ＳＳＲ 标记进行 ＰＣＲ 扩
增ꎮ 以获取最优的 ＰＣＲ 反应条件ꎮ 扩增体系为 ２５ μＬ:
ｄｄＨ２Ｏ １３􀆰 ５ μＬꎻ １０ × Ｂｕｆｆｅｒ ２􀆰 ５ μＬꎻ ＭｇＣｌ２ (２５ ｍｍｏｌ􀅰
Ｌ－１) ２􀆰 ０ μＬꎻ ｄＮＴＰ (１０ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１) ０􀆰 ５ μＬꎻ Ｐｒｉｍｅｒ (１０
μｍｏｌ􀅰Ｌ－１) ０􀆰 ５ μＬꎻ Ｔａｑ 酶 (５ Ｕ􀅰μＬ－１) ０􀆰 ２５ μＬꎻ ＢＡＳ
(２０ ｇ􀅰Ｌ－１) １ μＬꎻ 模板 １􀆰 ５ μＬꎮ 反应条件: ９４ ℃预变性
５ ｍｉｎꎻ (９４ ℃ ６０ ｓ变性ꎬ Ｔａ ６０ ｓ退火ꎬ ７２ ℃ ９０ ｓ延伸)
反应 ３５个循环ꎮ 其中 Ｔａ 为退火温度ꎬ 不同引物退火温
度见表 ２ꎻ ７２ ℃延伸 １２ ｍｉｎꎮ ＰＣＲ 产物用 １􀆰 ５％琼脂糖凝
胶电泳检测ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ２􀆰 ２　 通用 ＳＳＲ 引物多态性检测 　 对初步筛选出的
引物对中的一个引物做荧光染料修饰ꎬ 所用荧光染料为
６￣ＦＡＭ、 ＨＥＸ 和 ＲＯＸꎮ 利用牦牛山橐吾、 奇形橐吾和大
黄橐吾的 ２个自然杂交区的 ９４个个体对荧光标记引物进
行多态性的筛选ꎮ 采用上述步骤中建立的反应体系ꎻ 因
降落 ＰＣＲ法可以通过一次反应即顺利扩增出基因特异性
条带ꎬ 并且在模板浓度降低后也能扩增出产物ꎬ 为使初
筛引物对所有个体扩增ꎬ 故反应条件采用降落 ＰＣＲ 法:
９５ ℃ 预变性 ３ ｍｉｎꎻ ９５ ℃ ３０ ｓ 变性ꎬ ６３ ℃ ３０ ｓ 退火ꎬ
７２ ℃ ３０ ｓ延伸ꎬ 反应 １０个循环ꎻ ９５ ℃ ３０ ｓ变性ꎬ ５８ ℃
３０ ｓ 退火ꎬ ７２ ℃ ３０ ｓ 延伸ꎬ 反应 ２０ 个循环ꎻ ７２ ℃延伸
６ ｍｉｎꎮ ＰＣＲ产物在 ３７３０ＸＬ测序仪上检测ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ３　 数据整理与分析使用
Ｇｅｎｅｍａｐｐｅｒ软件读出每个 ＳＳＲ ＰＣＲ 产物片段大小ꎻ
用 ＧｅｎＡｌＥｘ (Ｖ􀆰 ６􀆰 ５版) (Ｐｅａｋａｌｌｒ和 Ｓｍｏｕｓｅꎬ ２００６) 进行
数据的整理及期望杂合度、 观察杂合度和 Ｈａｒｄｙ￣Ｗｅｉｎ￣
ｂｅｒｇ平衡检测ꎻ 等位基因数和连锁不平衡概率用 Ｐｏｐ￣
Ｇｅｎｅ (Ｖ􀆰 １􀆰 ３２版) (Ｙｅｈ等ꎬ １９９７) 完成ꎮ
２　 结果
２􀆰 １　 ＳＳＲ引物的初步筛选
通过对 １４５ 对 ＳＳＲ 引物进行初步通用性检
测 (部分引物 ＰＣＲ 琼脂糖凝胶电泳检测结果见
图 １)ꎬ 发现至少有 ５４ 对 (３７􀆰 ２％ꎻ ７ 对来自鹿
蹄橐吾ꎬ ５ 对来自大吴风草ꎬ ２ 对来自 Ｓ􀆰 ｍａｄａ￣
ｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓꎬ １４ 对来自 Ｓ􀆰 ｓｑｕａｌｉｄｕｓꎬ ２ 对来自欧
洲千里光ꎬ ６对来自 Ｓ􀆰 ｍａｃｒｏｃａｒｐｕｓꎬ １８对来自向
日葵) 引物能在牦牛山橐吾、 大黄橐吾、 奇形橐
吾中的至少一个种中扩增ꎬ 其中 １７ 对引物 (表
２) 能在三个种中稳定扩增 (部分毛细管电泳图
谱见图 ２)ꎮ
２􀆰 ２　 ＳＳＲ引物多态性筛选
在初步筛选到的 １７ 对引物中ꎬ ６ 个 ＳＳＲ 位
点是单态的ꎬ 剩余 １１ 个为多态性位点 (表 ２)ꎮ
在 １１个多态性位点中ꎬ 牦牛山橐吾中均具有多
态性ꎬ 但位点 Ｌｈｏ４０和 Ｓ２４在大黄橐吾中、 Ｌｈｏ４１
在奇形橐吾中是单态的 (表 ３)ꎮ 通过软件 ＧｅｎＡ￣
ｌＥｘ (Ｖ. ６􀆰 ５) 和 ＰｏｐＧｅｎｅ (Ｖ. １􀆰 ３２) 进行数据分
表 １　 Ｌｉｇｕｌａｒｉａ ｄｕｃｉｆｏｒｍｉｓꎬ Ｌ􀆰 ｐａｒａｄｏｘａ和 Ｌ. ×ｍａｏｎｉｕｓｈａｎｅｎｓｉｓ ２个采样点的具体信息和取样数
Ｔａｂｌｅ １　 Ｄｅｔａｉｌｓ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ ｌｏｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓａｍｐｌｅ ｓｉｚｅ (ｎ) ｏｆ ｔｈｅ ２ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ｌｉｇｕｌａｒｉａ ｄｕｃｉｆｏｒｍｉｓꎬ
Ｌ􀆰 ｐａｒａｄｏｘａ ａｎｄ Ｌ. × ｍａｏｎｉｕｓｈａｎｅｎｓｉｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
物种 Ｓｐｅｃｉｅｓ 编号Ｎｏ. 采集地点 Ｌｏｃａｌｉｔｙ
纬度 (Ｎ)
Ｌａｔｉｔｕｄｅ
/ °
经度 (Ｅ)
Ｌｏｎｇｉｔｕｄｅ
/ °
海拔
Ａｌｔｉｔｕｄｅ
/ ｍ
个体数
Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ
ｎｕｍｂｅｒ / ｎ
牦牛山橐吾 ＭＮＳ 云南省宁蒗县永宁乡牦牛山 １００􀆰 ５５４ ２７􀆰 ８１１ ４０４０ ９
Ｌ. × ｍａｏｎｉｕｓｈａｎｅｎｓｉｓ ＨＨ 云南省宁蒗县永宁乡黑海 １００􀆰 ５３０ ２７􀆰 ８０６ ４１４０ １０
大黄橐吾 ＭＮＳ 云南省宁蒗县永宁乡牦牛山 １００􀆰 ５５４ ２７􀆰 ８１１ ４０４０ １５
Ｌ􀆰 ｄｕｃｉｆｏｒｍｉｓ ＨＨ 云南省宁蒗县永宁乡黑海 １００􀆰 ５３０ ２７􀆰 ８０６ ４１４０ ２０
奇形橐吾 ＭＭＳ 云南省宁蒗县永宁乡牦牛山 １００􀆰 ５５４ ２７􀆰 ８１１ ４０４０ ２０
Ｌ􀆰 ｐａｒａｄｏｘａ ＨＨ 云南省宁蒗县永宁乡黑海 １００􀆰 ５３０ ２７􀆰 ８０６ ４１４０ ２０
８１４　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 植 物 分 类 与 资 源 学 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 第 ３７卷
析后得出ꎬ 牦牛山橐吾中ꎬ 每个位点的等位基因
数目在 ２ (Ｌｈｏ４１) 到 １４ (Ｓ２) 之间ꎬ 平均为 ４􀆰 ８
个ꎻ 观测杂合度和期望杂合度分别为 ０􀆰 ０５３ ~
１􀆰 ０００和 ０􀆰 ０５１ ~ ０􀆰 ８８７ꎬ 哈迪－温伯格平衡检验
显示ꎬ 位点 Ｌｈｏ６４、 ｓｍ０８３、 Ｓ２ 和 Ｓ２４ 偏离了哈
迪－温伯格平衡ꎮ 在大黄橐吾中ꎬ 每个位点的等
图 １　 ６个微卫星位点 ＰＣＲ琼脂糖凝胶电泳图
Ｆｉｇ􀆰 １　 ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｓｉｘ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｌｏｃｉ ｏｎ ｔｈｅ ａｇａｒｏｓｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
表 ２　 筛选出的 １７对能在牦牛山橐吾中扩增的微卫星引物信息
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｄｅｔａｉｌｓ ｏｆ １７ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｌｏｃｉ ｗｉｔｈ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｆｏｒ Ｌｉｇｕｌａｒｉａ × ｍａｏｎｉｕｓｈａｎｅｎｓｉｓ
位点
Ｌｏｃｕｓ 重复单元 Ｒｅｐｅａｔ ｍｏｔｉｆ
引物 (５′－３′)
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′－３′)
退火温度
Ｔａ / ℃
片段大小
Ｓｉｚｅ / ｂｐ 文献 Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
多态的 ＳＳＲ
Ｌｈｏ３８ (ＡＣ) ５􀆺(ＡＣ) ４􀆺(ＡＣ) ７
Ｆ: ＣＴＴＡＣＡＣＣＴＣＣＧＡＡＣＴＧＡＴＣ
Ｒ: ＴＣＴＡＡＡＡＧＧＧＡＡＡＴＧＧＡＡＡＣＡ ５７ ２７２~２９０ Ｍａｏ等ꎬ ２００９
Ｌｈｏ４０ (ＣＴ) ６􀆺(ＴＧ) ４
Ｆ: ＡＴＣＡＴＡＣＣＴＴＧＣＣＴＣＡＡＡＧＴ
Ｒ: ＣＡＡＴＡＧＴＴＣＣＧＡＡＣＡＣＣＣＴ ５７ １９２~２０２ Ｍａｏ等ꎬ ２００９
Ｌｈｏ４１ (ＡＧ) ４ＡＴ(ＡＧ) ８􀆺(ＡＧ) ９
Ｆ: ＡＣＧＡＧＴＡＧＡＣＡＣＣＣＡＡＣＧＴＣ
Ｒ: ＣＣＴＴＴＣＴＴＣＣＣＣＡＡＣＡＣＡＡ ５７ １８０~２０５ Ｍａｏ等ꎬ ２００９
Ｌｈｏ６４ (ＡＴＧ) ６􀆺(ＡＧ) ｒｉｃｈ
Ｆ: ＣＧＡＡＴＧＡＣＡＴＧＡＡＣＡＣＣＡＣ
Ｒ: ＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＴＧＡＧＣＣＴＡＴ ５７ １６０~１９５ Ｍａｏ等ꎬ ２００９
Ｌｈｏ７７ (ＴＧ) ７
Ｆ: ＡＧＴＴＴＴＧＴＡＧＴＡＡＡＡＣＧＧＡＧＴＴ
Ｒ: ＣＧＣＡＴＡＡＡＴＡＡＴＧＴＡＡＧＣＡ ５５ １７８~１９８ Ｍａｏ等ꎬ ２００９
ｓｍ０８３ (ＡＧ) ５
Ｆ: ＧＣＧＴＡＧＣＣＡＡＣＣＴＴＴＧＡＧＡＧ
Ｒ: ＧＧＡＧＴＧＧＴＴＡＡＣＧＧＡＣＡＴＧＣ ６０ ３１３ꎬ ３１７ Ａｈｒｅｎｓ等ꎬ ２０１３
Ｓ２ (Ａ) ２３－(ＧＴ) １３
Ｆ: ＧＣＣＣＴＣＴＧＴＴＴＣＴＣＣＴＣＣＡＡ
Ｒ: ＴＡＣＧＣＴＣＴＴＧＡＡＡＴＧＧＧＴＧＡＣ ５４ １２４ Ｌｉｕ等ꎬ ２００４
Ｓ４ (ＧＴ) １３－(ＡＧ) ５
Ｆ: ＴＧＧＴＣＡＧＴＣＡＴＧＴＣＧＡＡＣＣＡ
Ｒ: ＧＴＴＣＡＧＡＡＡＡＧＡＧＣＡＴＧＴＡＴＡＣＣ ５６ １８６ Ｌｉｕ等ꎬ ２００４
Ｓ２３ (ＧＴ) ２３
Ｆ: ＧＡＧＡＡＴＴＣＧＧＣＴＴＧＧＧＴＧＡＣ
Ｒ: ＣＧＡＧＧＣＧＣＧＴＧＧＡＣＴＡＡＣ ５５ １９０ Ｌｉｕ等ꎬ ２００４
Ｓ２４ (ＧＴ) １４－(ＡＧ) １８
Ｆ: ＡＡＧＴＣＴＴＧＧＣＣＡＣＡＴＡＡＣＣＴ
Ｒ: ＴＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＴＴＴＣＣＴＴＣＡＴＡＣ ５５ １７１ Ｌｉｕ等ꎬ ２００４
Ｖ４０ (ＧＴ) ２８
Ｆ: ＡＧＡＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＡＴＧＴＣＣ
Ｒ: ＴＣＣＣＡＡＣＡＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＴＡ ５４ ２３０ Ｌｉｕ等ꎬ ２００４
单态的 ＳＳＲ
Ｌｈｏ１５４ (ＧＴ) ６􀆺(ＧＴ) ７ Ｔ(ＧＴ) ６
Ｆ: ＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＡＣＧ
Ｒ: ＣＣＴＡＧＡＴＣＴＴＣＡＴＣＴＣＴＴＴＴＣＴ ５８ １７５~１９５ Ｍａｏ等ꎬ ２００９
ｓｍ０６９ (ＡＡＣ) ５
Ｆ: ＴＴＧＧＧＣＣＡＣＴＴＴＧＣＴＡＧＡＧＡ
Ｒ: ＴＧＴＴＴＣＡＴＧＣＡＴＧＣＴＧＧＡＧＴ ６０ ２６２ Ａｈｒｅｎｓ等ꎬ ２０１３
ｓｍ０７７ (ＡＴ) ５
Ｆ: ＣＣＡＡＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＧＧＣＧＴＧ
Ｒ: ＴＧＴＴＡＡＴＴＧＡＧＴＧＣＣＣＧＧＴＴ ６０ ３００ Ａｈｒｅｎｓ等ꎬ ２０１３
ｓｍ０９５ (ＡＧ) ５
Ｆ: ＧＡＣＣＡＧＧＣＣＡＡＣＣＡＡＧＡＧＡＴ
Ｒ: ＴＣＴＧＴＣＣＡＴＴＣＣＴＴＣＣＴＣＣＡ ６０ ３７４ Ａｈｒｅｎｓ等ꎬ ２０１３
ＨＴ８６７ (ＡＧ) ５
Ｆ: ＡＴＡＧＡＴＧＣＣＣＧＧＡＡＧＣＡＴＡＴＣ
Ｒ: ＣＴＴＣＡＣＣＴＣＡＴＴＣＡＧＣＣＡＣＡＴＣ ５７ １３２ Ｈｅｅｓａｃｋｅｒ等ꎬ ２００８
ＨＴ９０９ (ＣＣＡ) ５
Ｆ: ＡＡＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＧＡＣＣＡＴＧＣＡ
Ｒ: ＣＡＧＧＡＣＡＧＴＣＧＧＣＡＡＧＡＴＡＧＧＧ ６２ １９６ Ｈｅｅｓａｃｋｅｒ等ꎬ ２００８
９１４４期　 　 　 　 　 　 张荣等: 七种菊科植物 ＳＳＲ标记在大黄橐吾和奇形橐吾杂交区类群中的通用性检测　 　 　 　 　 　
位基因数目在 １ (Ｌｈｏ４０、 Ｓ２４) 到 １２ (Ｌｈｏ４１) 之
间ꎬ 平均为 ７􀆰 ４个ꎻ 观测杂合度为 ０􀆰 ０００~０􀆰 ９７１ꎬ
期望杂合度为 ０􀆰 ０００ ~ ０􀆰 ８４４ꎬ 除 Ｌｈｏ７７、 Ｓ４ 和
Ｓ２３外ꎬ 其余位点都偏离了哈迪－温伯格平衡ꎮ
对于奇形橐吾ꎬ 每个位点的等位基因数目在 １
(Ｌｈｏ４１) 到 １５ (Ｌｈｏ６４) 之间ꎬ 平均为 ７􀆰 ６个ꎻ
图 ２　 一个微卫星位点 (Ｓ２４) 毛细管电泳图谱
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｏｎｅ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｌｏｃｕｓ (Ｓ２４) ｏｎ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
表 ３　 筛选的 １１对多态性引物在大黄橐吾和奇形橐吾自然杂交区 ３个类群中的遗传参数
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｔａｘａ ｏｆ ｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄ ｚｏｎｅｓ ｏｆ Ｌｉｇｕｌａｒｉａ ｄｕｃｉｆｏｒｍｉｓ ａｎｄ Ｌ􀆰 ｐａｒａｄｏｘａ
ｗｉｌｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ １１ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒｓ
Ｌｏｃｕｓ
牦牛山橐吾 (Ｌ. ×ｍａｏｎｉｕｓｈａｎｅｎｓｉｓ)
ｎ＝ １９
ＮＡ ＨＯ ＨＥ Ｆ ＰＨＷ
大黄橐吾 (Ｌ􀆰 ｄｕｃｉｆｏｒｍｉｓ)
ｎ＝ ３５
ＮＡ ＨＯ ＨＥ Ｆ ＰＨＷ
奇形橐吾 (Ｌ􀆰 ｐａｒａｄｏｘａ)
ｎ＝ ４０
ＮＡ ＨＯ ＨＥ Ｆ ＰＨＷ
Ｌｈｏ３８ ５ ０􀆰 ８９５ ０􀆰 ６０１ －０􀆰 ４８８ ０􀆰 ２５６ ９ ０􀆰 ４５７ ０􀆰 ７３６ ０􀆰 ３７９ ０􀆰 ００１∗ ７ ０􀆰 ６７５ ０􀆰 ５２８ －０􀆰 ２７８ ０􀆰 ０００∗
Ｌｈｏ４０ ４ ０􀆰 ３１６ ０􀆰 ３２３ ０􀆰 ０２１ ０􀆰 ４９４ ８ ０􀆰 ５５６ ０􀆰 ７４７ ０􀆰 ２５６ ０􀆰 ４２３
Ｌｈｏ４１ ２ ０􀆰 ０５３ ０􀆰 ０５１ －０􀆰 ０２７ ０􀆰 ９０６ １２ ０􀆰 ４８６ ０􀆰 ６６７ ０􀆰 ２７１ ０􀆰 ０００∗
Ｌｈｏ６４ ３ １􀆰 ０００ ０􀆰 ５２５ －０􀆰 ９０５ ０􀆰 ０００∗ ３ ０􀆰 ９７１ ０􀆰 ５２７ －０􀆰 ８４２ ０􀆰 ０００∗ １５ ０􀆰 ８１６ ０􀆰 ７５６ －０􀆰 ０８０ ０􀆰 ０００∗
Ｌｈｏ７７ ６ ０􀆰 ７８９ ０􀆰 ７９２ ０􀆰 ００３ ０􀆰 ０８５ ７ ０􀆰 ７８１ ０􀆰 ７８２ ０􀆰 ００１ ０􀆰 ０２６ ６ ０􀆰 ９７４ ０􀆰 ７２０ －０􀆰 ３５３ ０􀆰 ０００∗
ｓｍ０８３ ２ ０􀆰 ８９５ ０􀆰 ４９４ －０􀆰 ８１０ ０􀆰 ０００∗ ６ ０􀆰 ２００ ０􀆰 ２８３ ０􀆰 ２９４ ０􀆰 ０００∗ ８ ０􀆰 ２１１ ０􀆰 ６１８ ０􀆰 ６６０ ０􀆰 ０００∗
Ｓ２ １４ ０􀆰 ４４４ ０􀆰 ８８７ ０􀆰 ４９９ ０􀆰 ０００∗ １１ ０􀆰 ４４１ ０􀆰 ８４４ ０􀆰 ４７７ ０􀆰 ０００∗ １１ ０􀆰 ３５９ ０􀆰 ８４６ ０􀆰 ５７６ ０􀆰 ０００∗
Ｓ４ ３ ０􀆰 ８４２ ０􀆰 ５０８ －０􀆰 ６５７ ０􀆰 ０１８ ５ ０􀆰 ５７１ ０􀆰 ５９１ ０􀆰 ０３２ ０􀆰 ８３１ ４ ０􀆰 ９２５ ０􀆰 ５５２ －０􀆰 ６７５ ０􀆰 ０００∗
Ｓ２３ ３ ０􀆰 ７３７ ０􀆰 ５２５ －０􀆰 ４０４ ０􀆰 １９３ ５ ０􀆰 ８２９ ０􀆰 ６０１ －０􀆰 ３７８ ０􀆰 ０７２ ５ ０􀆰 ９２５ ０􀆰 ５８８ －０􀆰 ５７４ ０􀆰 ０００∗
Ｓ２４ ３ ０􀆰 ８９５ ０􀆰 ５２２ －０􀆰 ７１４ ０􀆰 ００６∗ ４ ０􀆰 ０２５ ０􀆰 ０９７ ０􀆰 ７４１ ０􀆰 ０００∗
Ｖ４０ ８ ０􀆰 ７８９ ０􀆰 ７９８ ０􀆰 ０１０ ０􀆰 ０９５ ９ ０􀆰 ８７９ ０􀆰 ６８５ －０􀆰 ２８２ ０􀆰 ００１∗ ８ ０􀆰 ３４２ ０􀆰 ６２５ ０􀆰 ４５３ ０􀆰 ０８２
注: ＮＡꎬ 等位基因数目ꎻ ＨＯꎬ 观测杂合度ꎻ ＨＥꎬ 期望杂合度ꎻ Ｆꎬ 近交系数ꎻ ＰＨＷꎬ Ｈａｒｄｙ￣Ｗｅｉｎｂｅｒｇ 平衡频率ꎻ ∗ꎬ 偏离 Ｈａｒｄｙ￣
Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡 (Ｐ < ０􀆰 ０１) 的多态性 ＳＳＲ位点
０２４　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 植 物 分 类 与 资 源 学 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 第 ３７卷
观测杂合度和期望杂合度分别为 ０􀆰 ０００ ~ ０􀆰 ９７４
和 ０􀆰 ０００~０􀆰 ８４６ꎬ 除 Ｌｈｏ４０和 Ｖ４０外ꎬ 其余位点
都偏离了哈迪－温伯格平衡ꎮ 所有位点都没有严
重偏离 (Ｐ < ０􀆰 ００１) 基因型连锁不平衡 (Ｌｉｎｋａｇｅ
ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍꎬ ＬＤ)ꎮ
３　 分析与讨论
ＳＳＲ标记被认为是群体遗传学研究的理想标
记 (邹喻苹等ꎬ ２００１)ꎬ 在不同物种上的应用可为
近缘种的引物设计提供参考ꎬ 一旦微卫星位点在
某一物种中被分离并测序ꎬ 就可能被用于近缘种
的分析 (王丽和赵桂仿ꎬ ２００５)ꎮ 从近缘种已经开
发出来的 ＳＳＲ中筛选目标物种所需的标记ꎬ 成为
一种筛选微卫星标记的快捷手段ꎮ 本研究从已报
道的不同族到同属的 ７个物种的 １４５对 ＳＳＲ引物
进行筛选ꎬ 其中 ５４对 (３７􀆰 ２％) 引物在所研究的三
个类群中至少能在其中一个类群中成功扩增 (其中
１７对能对三个种中稳定扩增ꎬ １１个为多态位点)ꎮ
在所用 １４５ 对引物中ꎬ 从鹿蹄橐吾开发的
１４对引物中ꎬ ７对在所研究的三个类群中至少能
在牦牛山橐吾中稳定扩增 (５ 对具有多态性)ꎬ
引物通用性比例为 ５０％ꎮ 这一比例低于双子叶
植物 ＳＳＲ 标记的平均通用性 [(７１±２)％] (Ｂａｒ￣
ｂａｒａ等ꎬ ２００７)ꎮ 这 １４对引物在同属东俄洛橐吾
(Ｌ􀆰 ｔｏｎｇｏｌｅｎｓｉｓ) 的通用性较高ꎬ 为 ８５􀆰 ７％ (Ｍａｏ
等ꎬ ２００９)ꎮ 鹿蹄橐吾、 东俄洛橐吾、 大黄橐吾、
奇形橐吾在分类上都属于橐吾属伞房组 (刘尚
武ꎬ １９８９)ꎬ 鹿蹄橐吾与大黄橐吾在款冬亚族系
统的发育关系中相对东俄洛橐吾亲缘关系较近
(Ｐｅｌｓｅｒ等ꎬ ２００７)ꎬ 但通用性在大黄橐吾中却相
对较低ꎬ 这说明引物通用性在亲缘关系较近的不
同类群间波动也较大 (Ｂａｒｂａｒａ 等ꎬ ２００７)ꎮ 属外
类群大吴风草 ８对 ＳＳＲ引物 (５ 对稳定扩增) 在
大黄橐吾和奇形橐吾杂交区类群的通用性较高ꎬ
为 ６２􀆰 ５％ꎻ 所选的千里光属的 ８１ 对 (２４ 对稳定
扩增) 和向日葵属的 ４２ 对 (１８ 对稳定扩增) 的
ＳＳＲ引物的通用性较低ꎬ 分别为 ２９􀆰 ６％ (其中在
Ｓ􀆰 ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓ中引物通用性为 ２０％ꎬ 且其
在系统发育关系上离橐吾属相对较远) 和 ４２􀆰 ９％ꎮ
引物来源不同的四个属中ꎬ 通用性最高的来自大
吴风草ꎬ 最低的为千里光属ꎮ 本研究中的三个物
种与大吴风草在系统位置上相近ꎬ 亲缘关系密切
(刘尚武等ꎬ １９９４)ꎬ 甚至比同属鹿蹄橐吾还近
(Ｐｅｌｓｅｒ等ꎬ ２００７)ꎬ 与千里光属的亲缘关系较远
(Ｐｅｌｓｅｒ等ꎬ ２００７ꎬ ２０１０)ꎬ 所以来自亲缘关系可
能相对疏远种的引物通用性较低ꎮ 从而证实了
Ｂａｒｂａｒａ等 (２００７) 的观点: 亲缘关系远的两个
种种间引物通用性较低ꎮ 而从向日葵中开发的
ＳＳＲ引物比千里光属高ꎬ 这可能与向日葵为一年
生草本ꎬ 千里光属四种均为多年生草本的生活习
性、 世代长度相关 (Ｂａｒｂａｒａ等ꎬ ２００７)ꎮ
在牦牛山橐吾中ꎬ ６３􀆰 ６４％的位点有杂合子
过剩现象 (近交系数 Ｆ ＝ －０􀆰 ３１５ꎬ Ｆ < ０)ꎬ 大黄
橐吾中 ６６􀆰 ６７％的位点存在纯合子过剩现象 (Ｆ ＝
０􀆰 ０７２ꎬ Ｆ > ０)ꎬ 奇形橐吾中杂合子和纯合子数
量均等 (Ｆ≈０)ꎬ 导致杂交种牦牛山橐吾杂合子
较多可能是其处于杂交种初期所致ꎮ 研究结果暗
示了在狭小的杂交区内ꎬ 有限的个体数量ꎬ 很可
能导致近亲交配ꎬ 产生种质纯质化ꎬ 就会导致大
黄橐吾和奇形橐吾纯合子较多 (Ｌａｄｅ等ꎬ １９９６)ꎬ
这就不难理解为何牦牛山橐吾、 大黄橐吾、 奇形
橐吾中分别有 ４、 ６、 ８ 个位点偏离了哈迪－温伯
格平衡ꎮ 总之ꎬ 研究中筛选出适合牦牛山橐吾的
１１对多态性引物中ꎬ 虽然亲本物种大黄橐吾和
奇形橐吾分别有 ２对和 １对引物为单态ꎬ 但等位
基因数、 观测杂合度和期望杂合度相对于其他植
物而言ꎬ 都接近平均水平 (Ｎｙｂｏｍꎬ ２００４)ꎬ 这说
明这 １１对引物有助于研究大黄橐吾和奇形橐吾
杂交区类群的杂交关系和其它近缘物种的遗传多
样性和居群结构ꎮ
致谢　 感谢中国科学院昆明植物研究所的潘跃芝高级工
程师、 张启泰、 周魏、 何维颖及云南省宁蒗县林业局熊
在品在材料采集过程中给予的帮助ꎮ
〔参　 考　 文　 献〕
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ｔａ. Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｎ ｎｅｗ ｅｒｅｍｏｐｈｉｌａｎｅｓ ａｎｄ ａ ｎｅｗ ｓｅｃｏ￣ｂａｋｋａｎｅ
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Ｂｏｒｅａｌｉ￣Ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉａ Ｓｉｎｉｃａ (西北植物学报)ꎬ ２５ (８): １５４０—
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Ｗｕ Ｋꎬ Ｔａｎｋｓｌｅｙ ＳＤꎬ １９９３. Ａｂｕｎｄａｎｃｅꎬ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ
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Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＭＧＧꎬ ２４ (１￣２): ２２５—２３５
Ｙａｔａｂｅ Ｙꎬ Ｋａｎｅ ＮＣꎬ Ｓｃｏｔｔｉ￣Ｓａｉｎｔａｇｎｅ Ｃ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００７. Ｒａｍｐａｎｔ ｇｅｎｅ
ｅｘｃｈａｎｇｅ ａｃｒｏｓｓ ａ ｓｔｒｏｎｇ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｂａｒｒｉｅｒ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ａｎｎｕａｌ
ｓｕｎｆｌｏｗｅｒｓꎬ Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ ａｎｄ Ｈ􀆰 ｐｅｔｉｏｌａｒｉｓ [ Ｊ] . Ｇｅｎｅｔｉｃｓꎬ
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Ｙｅｈ ＦＣꎬ Ｙａｎｇ ＲＣꎬ Ｂｏｙｌｅ ＴＢＪ ｅｔ ａｌ.ꎬ １９９７. ＰＯＰＧＥＮＥꎬ ｔｈｅ ｕｓｅｒ ｆｒｉｅｎｄｌｙ
ｓｈａｒｅｗａｒｅ ｆｏｒ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ [Ｒ]. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｒｅꎬ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｌｂｅｒｔａꎬ Ｃａｎａｄａꎬ １０
Ｙｅ ＬＪ (叶林江)ꎬ Ｗａｎｇ Ｊ (王静)ꎬ Ｓｕｎ Ｐ (孙鹏) ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１４. Ｔｈｅ
ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｆｏｕｒ Ｃａｓｔａｎｏｐｓｉｓ
ｓｐｅｃｉｅｓ ｔｏ Ｃａｓｔａｎｏｐｓｉｓ ｔｉｂｅｔａｎａ (Ｆｒａｇａｃｅａｅ) [Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ａｎｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ (植物分类与资源学报)ꎬ ３６ (４): ４４３—４４８
Ｙｕ ＪＪꎬ Ｋｕｒｏｄａ Ｃꎬ Ｇｏｎｇ Ｘꎬ ２０１１. Ｎａｔｕｒａｌ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｒｏｇｒｅｓ￣
ｓｉｏｎ ｉｎ ｓｙｍｐａｔｒｉｃ Ｌｉｇｕｌａｒｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ ( Ａｓｔｅｒａｃｅａｅꎬ Ｓｅｎｅｃｉｏｎｅａｅ)
[Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎꎬ ４９ (５): ４３８—４４８
Ｙｕ ＪＪꎬ Ｐａｎ Ｌꎬ Ｐａｎ ＹＺ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１４. Ｎａｔｕｒａｌ ｈｙｂｒｉｄｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｌｉｇｕｌａｒ￣
ｉａ ｖｅｌｌｅｒｅａ ａｎｄ Ｌ􀆰 ｓｕｂｓｐｉｃａｔａ ( Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ: Ｓｅｎｅｃｉｏｎｅａｅ) [ Ｊ] .
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Ｚａｎｅ Ｌꎬ Ｂａｒｇｌｌｏｎｉ Ｌꎬ Ｐａｔａｒｎｅｌｌｏ Ｔꎬ ２００２. Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ
ｉｓｏｌａｔｉｏｎ: ａ ｒｅｖｉｅｗ [Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｃｏｌｏｇｙꎬ １１ (１): １—１６
２２４　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 植 物 分 类 与 资 源 学 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 第 ３７卷