全 文 ：大黄橐吾水溶性多糖的初步纯化及
清除自由基活性研究
刘春兰 ,周　博 ,杜　宁 ,王文蜀 ,李转秀 ,曾　鸣 ,张琳霞
(中央民族大学生命与环境科学学院 ,北京　100081)
摘　要:　为合理利用大黄橐吾提供一定依据 , 对大黄橐吾多糖进行提取分离纯化.大黄橐吾经热水浸提 , 乙
醇沉淀得到大黄橐吾粗多糖.粗多糖经凯氏定氮法测得蛋白质含量为 14.02%, 苯酚-硫酸法测得多糖中糖含
量为23.41%, 硫酸-咔唑法测半乳糖醛酸含量为 35.16%.粗多糖经 Sevage法和酶法联合脱蛋白 , 得初步纯化
的多糖.纯化多糖经红外吸收光谱分析 , 初步断定其官能团的存在及其所处状态.对大黄橐吾多糖进行清除自
由基活性研究 ,结果表明大黄橐吾多糖对超氧阴离子自由基和羟自由基具有明显的清除效果 , 且初步纯化后
多糖的清除效果比粗多糖好.
关键词:　大黄橐吾;多糖;提取;纯化;清除自由基作用
中图分类号:Q539　　文献标识码:A　　文章编号:1005-8036(2007)04-0341-05
收稿日期:2007-07-04
基金项目:国家“985”课题—中央民族大学“ 985”重点科研项目(cun985-3-3).
作者简介:刘春兰(1962-),女(汉族),吉林人 ,中央民族大学生命与环境科学学院副教授 , 生物化学专业.
　　橐吾属(Ligularia Cass.)为菊科(Compositae)千里光族 ,全属约有 130种.该属药用植物较多 ,许多种
类的根及根茎在民间做中药“紫菀”使用 ,有很长的药用历史.大黄橐吾(Ligularia duciformis)为多年生草
本植物 ,分布于甘肃南部 、四川 、湖北西部 、云南北部 、西藏东部等地 ,具有润肺下气 、祛痰止咳等功效[ 1] .
现代成分研究表明 ,橐吾的根中含有多种倍半萜类化合物.对橐吾的叶进行微量元素含量测定的研
究表明 ,叶中含有Zn ,Fe ,Cu ,Sr ,Ni ,Mn , Pb ,Cr , B ,P ,Mo ,Se 共 l2种微量元素.山紫菀所含化学成分主要
是三萜皂甙 ,此外还含其他萜类 、肽类 、香豆素 、甾醇等[ 2] .
药理研究发现 ,橐吾中 8个倍半萜类化合物对二氢吡啶类受体结合的作用和对离体血管张力有影
响 ,具有镇咳祛痰作用;蹄叶橐吾地上部分乙醇提取物具有抗炎免疫作用;从小舌紫菀根中的石油醚部
分分离出的豆甾醇 ,木栓酮具有抗菌 ,消炎 ,抗癌等生理活性[ 3～ 5] .但有关相橐吾多糖的研究还很少.鉴
于橐吾具有较高的药用价值和多糖具有的多种生理功效 ,本试验对产于四川凉山的大黄橐吾中的多糖
进行提取和初步纯化 ,并进行体外清除自由基活性研究.为进一步探讨橐吾多糖的药理活性 ,合理利用
大黄橐吾提供依据.
1　材料与方法
1.1　材料与仪器
大黄橐吾叶(Ligularia duciformis leaves ,采自于四川凉山),晾干 ,备用.
722型光栅分光光度计(上海分析仪器总厂),8002型电热恒温水浴锅(天津市中环实验电炉有限公
司),精密电子天平(感量 1 104),LD4-8型离心机(北京医用离心机),101-3型电热鼓风干燥箱(天津市泰
2007年 11月
第 16卷　第 4期
中央民族大学学报(自然科学版)
Journal of the CUN(Natural Sciences Edition)
Nov.2007
Vol.16　No.4
斯特仪器有限公司),VERTEX 70傅立叶变换红外光谱仪(德国布鲁克(Bruck)光谱仪器亚太有限公司).
1.2　方法
1.2.1　大黄橐吾粗多糖的提取[ 6 ～ 7]
称取经乙醇回流 ,干燥后的大黄橐吾 ,加入蒸馏水浸泡一夜 , 85℃水浴煮提 3次 ,间隙搅拌.将提取
液浓缩 ,浓缩后用 95%乙醇沉过夜.离心取沉淀 ,分别用乙醇洗后乙醚各洗一次 ,真空干燥后得大黄橐
吾粗多糖.
1.2.2　大黄橐吾粗多糖分析
1.2.2.1　淀粉含量采用 KI-I2 法测定
取粗多糖水溶液 10mL ,加入 I2-KI试剂 ,观察溶液是否变蓝.
1.2.2.2　蛋白质含量测定采用凯氏定氮法检测[ 8]
1.2.2.3　总糖含量采用苯酚-硫酸法[ 9～ 10] 检测
1.2.2.4　糖醛酸含量采用硫酸-咔唑法[ 11] 检测
1.2.2.5　粗多糖的初步纯化
配制 2%的糖溶液 ,加入一定量的蛋白酶 ,充分搅拌均匀 ,上面加一层甲苯 ,在 37℃恒温水浴锅加热
3h.然后加入溶液体积 1 3的正丁醇和氯仿 ,其中正丁醇和氯仿的比例为 1∶4 ,在分液漏斗中摇 20min ,然
后以 3500转 min的速度离心 10min ,取其上清夜.此步骤反复重复 4次[ 12] .最后用乙醇 ,乙醚洗涤 ,干燥
即可.
1.2.2.6　过氧化氢氧化脱色素[ 13]
2%的多糖水溶液用浓氨水调至 pH 8.0 ,水浴中加热至 30℃,滴入 30%H202(用量为糖液体积的
15%),保持 pH8 ～ 9 ,4h后终止反应.冷却至室温 ,草酸调 pH 至 7.0 ,缓缓加入乙醇 ,使含量达 70%,过
夜 ,离心收集沉淀 ,常规干燥至恒重.
1.2.2.7　红外光谱分析
分别取 1mg 样品与 10mg KBr研磨混合后压片 ,VERTEX 70傅立叶变换红外光谱仪 400—4000cm-1
扫描.
1.2.3　清除自由基活性测定
1.2.3.1　多糖清除·OH的测定[ 14 ～ 15] .参考 Fenton反应体系模型 ,采用固定时间反应法 ,在相同反应体
积的反应体系内(8.8mmol L H2O2 ,9mmol L Fe2+ 0.5mL ,9mmol L水杨酸-乙醇溶液 0.5mL)加入一系列不
同浓度(0.5 ,1.0 ,1.5 ,2.0 ,2.5mg mL)的多糖溶液 ,并以蒸馏水作参比 ,与试剂空白液作比较 ,在 510nm
处测量各浓度下的吸光度 A.
1.2.3.2　多糖清除O -·2 的测定.参考 Hassan[ 16] 的光化学方法建立实验模型 ,反应体系包括 2.4×10-6
mol L RFV 0.3mL ,0.01mol L Met 0.3mL ,1.67×10-4mol L NBT 0.2mL ,0.1mol L 磷酸缓冲液(pH8.0)和不
同浓度(0.03 ,0.05 ,0.07 ,0.1mg mL)的多糖溶液 1mL ,将反应体系置于日光灯下 45min后 ,在 560nm 处测
量各浓度多糖的吸光度 A.
1.2.3.3　清除率计算公式∶清除率=(A0-A样品)×100% A0.A0 为空白对照液的吸光度.
2　结果与讨论
2.1　大黄橐吾粗多糖的提取与分析
大黄橐吾叶经水提醇沉后得粗多糖 ,粗多糖得率为 6.2%,所得粗多糖为黑色粉末状固体 ,溶于水 ,
不溶于乙醇 、乙醚 、丙酮等有机溶剂.
KI-I2实验表明粗多糖不含淀粉 ,凯氏定氮法测定大黄橐吾粗多糖中蛋白质含量为 14.02%.苯酚-
342 中央民族大学学报(自然科学版) 第 16卷　
硫酸法测定多糖含量 ,根据回归曲线方程求得大黄橐吾粗多糖中的总糖含量为 23.41%.
咔唑-硫酸法测定半乳糖醛酸含量 ,根据回归曲线方程求得大黄橐吾粗多糖中的半乳糖醛酸含量为
35.16%.
因此大黄橐吾粗多糖为不含淀粉的酸性杂多糖.
2.2　大黄橐吾粗多糖的初步纯化和分析
2.2.1　酶法和 Sevage 法联合脱蛋白
通过测定粗多糖中蛋白质的含量 ,取10g粗多糖脱蛋白经酶法和Sevage法联合脱蛋白 ,进行粗多糖
的初步纯化.粗多糖经过初步纯化后所得产物经干燥后为黑色粉末状固体(6.61g).纯化得率为
74.33%.
2.2.2　过氧化氢法脱色
取初步纯化多糖 6.61g ,经过氧化氢法脱色后得产物为灰色粉末状固体(4.10g),得率为 62.10%.
2.2.3　红外光谱
大黄橐吾初步纯化多糖在红外光谱仪 400 ～ 4000cm-1扫描 ,见图 1.从大黄橐吾初步纯化多糖的红
外谱图4000cm-1 ～ 640cm-1红外区中可以观察到:在 4000cm-1 ～ 640 cm-1区间具有多糖类物质的一般特
征谱带 , 表现在 3399.49cm-1(强 , 宽)谱带 , 对应于羟基的伸缩振动 , 1600 ～ 1000cm-1相关谱带区 ,
1615cm
-1 、1404cm-1峰为C —H的变角振动引起的.1100cm-1处的强吸收峰为两种 C —O伸缩振动引起 ,
一种是糖环的C —O—C ,另一种是属于C —O—H的.1404.04cm-1为C H的面内弯曲振动 ,1000cm-1附
近有四个吸收峰 ,说明大黄橐吾初步纯化多糖可能含有吡喃环和呋喃环.这一结论有待进一步证明.
893cm
-1处的吸收峰说明 SJ21糖苷键构型为 β型[ 10] .
图 1　大黄橐吾多糖的红外光谱图
Fig.1　IR Spectrum of Ligularia duciformis Polysaccharide
2.3　大黄橐吾多糖对自由基的清除作用
2.3.1　大黄橐吾多糖对·OH的清除作用
参考 Fenton反应体系模型 ,检测大黄橐吾多糖对·OH的清除作用.结果见图 2 ,结果表明 ,大黄橐吾
多糖粗品和精品对·OH 都具有清除作用 ,而且在实验模拟的浓度范围内与浓度成正相关 ,在糖浓度为
0.1mg mL ,粗品的清除率与精品相近 ,当糖浓度大于 0.1mg mL 时 ,精品的清除率均高于粗品 ,且由此 ,我
们得出结论大黄橐吾多糖对·OH 有明显的清除作用 ,而且在一定浓度范围 ,多糖精品的清除作用高于
多糖粗品 ,在精品多糖浓度到达 1.0 mg ml时 ,清除率高于 40%,清除效果明显.原因可能是纯化后的多
糖除去了干扰多糖发挥清除·OH作用的物质 ,多糖的活性作用更好得到发挥[ 17] .本实验采用的自由基
模型体系所产生·OH自由基浓度远大于体内该自由基的浓度[ 18 ,19] ,体外实验表明大黄橐吾多糖是良好
的·OH 自由基清除剂.
2.3.2　大黄橐吾多糖对 O-·2 的清除作用
343　第 4期 刘春兰等:大黄橐吾水溶性多糖的初步纯化及清除自由基活性研究
图 2　大黄橐吾多糖对羟自由基的清除作用
Fig.2　The scavenging effect of Ligularia duciformis Polysaccharide on·OH
参考 Hassan的反应模型 ,检测大黄橐吾多糖对 O-·2 的清除作用.结果表明 ,大黄橐吾多糖粗品和精
品对O -·2 都具有清除作用 ,而且在实验模拟的浓度范围内与浓度成正相关.在实验模拟的浓度范围内 ,
多糖精品的清除作用高于多糖粗品 ,原因可能是纯化后的多糖除去了干扰多糖发挥清除对 O-·2 作用的
物质 ,多糖的活性作用更好得到发挥[ 17] .在多糖精品浓度到 0.05mg ml时 ,清除率大于 30%,清除效果明
显.本实验采用的自由基模型体系所产生 O -·2 自由基浓度远大于体内该自由基的浓度[ 18～ 19] ,体外实验
表明大黄橐吾多糖是良好的O -·2 自由基清除剂.
图 3　大黄橐吾多糖对超氧阴离子的清除作用
Fig.3　The scavenging effect of Ligularia duciformis Polysaccharide on O -·2
3　讨　　论
本实验借鉴其他植物多糖提取分析方法 ,用水煮醇沉法从大黄橐吾中提取可溶性多糖 ,粗多糖得率
为6.2%,所得粗多糖为黑色粉末 ,不含有淀粉 ,经苯酚-硫酸法和硫酸-咔唑法测定 ,粗多糖中总糖含量
为23.41%,糖醛酸含量为 35.16%,凯氏定氮法测得粗多糖蛋白含量为 14.02%;粗多糖经酶法和 Sevage
法脱蛋白得初步纯化多糖;脱色后 ,多糖为灰色粉末.纯化多糖用压片法做红外吸收光谱分析 ,初步断定
分子之中官能团存在及其所处状态.实验测定 ,大黄橐吾多糖对O -·2 和·OH都具有明显的清除作用 ,在
实验模拟的浓度范围内与浓度成正相关 ,且纯化后的大黄橐吾多糖对上述 2种自由基的清除效果比粗
多糖好.上述结果表明大黄橐吾多糖是一种清除自由基良好的抗氧化剂.氧自由基与机体衰老有很密切
的关系 ,推测大黄橐吾水溶性多糖可作为抗衰老保健品或药物在临床上使用 ,但还有待于体内实验进一
步证实.
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Study on Preliminary Purification and Scavenging Free Radical
Activity of Polysaccharide in Ligularia duciformis
LIU Chun-lan ,ZHOU Bo , DU Ning , WANG Wen-shu ,
LI Zhuan-xiu , ZENG Ming , ZHANG Lin-xia
(College of Life and Environmental Science , Central Universi ty for Nationalities , Beijing 100081 , China)
Abstract:The crude polysaccharide was extracted from Ligularia duciformis with hot water , and
precipitated by ethanol.Then some identifiable properties of the crude polysaccharide were studied.The
contents of protein was 14.02%, the contents of polysaccharide was 23.41%and the contents of GAL-A
was 35.16%.The refined polysaccharide was prepared after protein being separated.Both crude and
refined polysaccharide were effective in scavenging superoxide radical and hydroxyl radical.The
scavenging capacity for superoxide radical and hydroxyl radical of refined polysaccharide was higher than
that of crude polysaccharide.
Key words:Ligularia duciformis;polysaccharide;extracte;purification;effect of scavenging radical
[责任编辑:白　玲]
345　第 4期 刘春兰等:大黄橐吾水溶性多糖的初步纯化及清除自由基活性研究